多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析

1。細胞の前処理と中期の準備

1. 彼らは70から80パーセントがコンフルエントに達するまで細胞は、5％CO ₂インキュベーターで37で10〜15％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン°Cを含むイーグル培地（DMEM）のダルベッコの改変で栽培されています。
2. 30〜60分間は0.05μg/ mlのコルセミド溶液で細胞を処理します。
3. 50 mlの滅菌ファルコン遠心チューブ内の任意の浮遊細胞を含む培地を収集します。 sterile1X-PBSでプレート上で細胞を洗浄します。 1〜2分間滅菌したトリプシンでインキュベートした後、収穫し、同じチューブに残りの細胞を収集します。
4. 5分間1000rpmでチューブを回転させ、上清を残して0.5 mlを吸引し、唯一の指でフリックでペレットを緩めます。
5. ペレットのサイズに応じて、dH ₂ Oでの0.56％のKClの低張液の5〜10 mlを追加し、30から45分間37℃で懸濁液をインキュベートします。
6. メタノール/酢酸の一滴を追加します。（3:1​​ vol / vol）のml当たり低張性の細胞懸濁液と混合するために穏やかにチューブを反転させる。
7. 継続的にペレットをフリックしながら5分間1200rpmで遠心分離し、ステップ1.4としてペレットを収集し、新鮮なメタノール/酢酸（3:1 vol / vol）の固定液を滴下し、5 mlを加える。この手順では、中期スプレッドは実験が損なわれる細胞の塊の中に閉じ込めされないようにすることが重要です。
8. 5分間1200rpmで再び遠心し、チューブの壁に沿って氷冷メタノール/酢酸固定液の5〜10 mlを加える。必要に応じて、この段階で、細胞は短期または-80 -20°Cで締めて密封チューブ内に固定液に保存することができます°C今後の使用のために長期（年）。
9. 無水エタノールできれいにスライドし、スライドの表面に水の鞘を形成するためにapproximately10XためのdH ₂ Oでスライドを浸す。 （ステップ1.8からの細胞懸濁液をガラス板とドロップ15-20μlの上でスライドを配置する） "10からスライドの上に1-2分間65から70に設定され水浴°Cでスライドを置き、乾燥させます。
10. 中期染色体スプレッドは等間隔があることを確認すること10Xと40Xの乾燥の目標を使用して光学顕微鏡下でスライドを確認してください。染色体を周囲の細胞質の存在を確認してください。細胞質は、現在のスライドの前処理（ペプシン消化）を続行している場合には細胞質が存在しないと染色体は、優れた形態を持っている場合は、スライドの前処理の必要はありません。

2。スライドの前処理（ペプシン処理）

1. 24ミリメートル×60 mmの顕微鏡のカバーガラスに2X-SSCに溶解し、1:200のRNase溶液（20 mg / ml）を120μLを適用し、優しく中期スライド面を反転してインキュベートし、カバーガラス上で中期のスライドを下向きに反転させる37℃で45分間。
2. 慎重にスライドを傷つけず​​にカバーガラスを除去し、コプリンジャーに2X-SSC緩衝液中で15分間毎に5分を洗う振とう。
3. きれいなビーカーにペプシン原液の5〜15μL（dH ₂ Oで100 mg / ml）を追加して、あらかじめ温めておいた100mlの追加（を37°C）0.01M HClを。 これは、ペプシンがクリーンに追加されることが重要です。直接HCl溶液に最初のではなく、ビーカー、それ以外の場合は、溶液に溶解しませんでした。で37塩酸/ペプシン溶液の入ったコプリンジャーにスライドをインキュベートし、3〜5分間°C。あまりにも多くの消化が染色体がoverdigestedされるようになりますし、少なすぎると消化は、プローブの非特異的な結合につながるとのハイブリダイゼーションシグナルに干渉する可能性のある細胞質消化のままになり、このステップは非常に重要です。
4. 室温で二回、5分間100ミリリットル1X-PBSを含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。
5. 室温で5分間（1X-PBS 950 mlの1M MgCl ₂の50ミリリットル）が100ミリリットル1X-PBS/MgCl _2を含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。
6. コプリンジャーcontaininのスライドを配置する室温（1X-PBS/MgCl ₂の100ミリリットルの37％ホルムアルデヒドの1.7 ml）をgで10分間100ミリリットル、1％ホルムアルデヒド。
7. 5分間100ミリリットル1X-PBSを含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。
8. スライドが適切に消化されず、細胞質が存在しないと染色体の形態が保持されていることを確認する40X乾燥したレンズを使用して光学顕微鏡下でスライドを観察します。ダイヤモンドペンを用いたハイブリダイゼーションの領域を選択します。

3。染色体とプローブの変性とハイブリダイゼーション

1. 新鮮な変性溶液（70％formamide/2X SSC、pH7.0）で70〜80にprewarm℃〜70℃の水浴で変性溶液を含むコプリンジャーにスライド水浴場所に置かれコプリンジャーに°を準備します。マウスの染色体と80°C、C 30-1.5分間のヒト染色体のために。
2. 直ちに3 80％と続いminと3分ごとに、空気乾燥した100％のエタノール、氷冷70％エタノールでスライドを配置します。スライドを調べる染色体の形態のために。優れた染色体の形態は、暗い染色体とされていません "相光"またはハロ染色体によって表されます。
3. 数秒間、1000rpmで簡単に20分、ボルテックスと遠心分離のために振とうしながら37℃で、SkyPaintプローブ（バイアル1位SKY塗装キット）を温める。
4. preannealingのために標識プローブDNAを許可するように60分間37°Cに続いて5分サイクルの85℃で2段階のサイクルのためにプログラムサーモプローブを変性させる。
5. 22ミリメートル×40 mmのカバーガラスには気泡をトラップしないようにして作るとのハイブリダイゼーションとカバーの領域に変性したプローブを10μlの適用されます。 48から72時間37℃で加湿チャンバーのゴムセメントとインキュベートするとカバーガラスの端をシールします。

4。蛍光プローブの検出

1. 慎重にカバーガラスを除去し、（45°C）、洗浄液I（2×SSCで新たに調製し、50％ホルムアミド）予熱を含むコプリンジャーにスライドを配置します。 5分間洗浄45三回45回転で振とう水浴中°C
2. 振とうしながら45回溶液II（1X SSC）℃で5分間の洗浄でスライドを洗浄します。
3. 45℃で5分間解IIIを（4X SSC/0.1％Tween 20）で洗浄℃の振とうしながらスライドを洗浄します。
4. ブロッキング試薬80μlの（SKYのペイントキット、バイアル＃2）を適用し、30分間37℃でカバースリップとインキュベートを配置します。
5. スライドを削除し、流体が流出することができます。 Cy5で染色試薬（濃縮抗体検出CADキット、バイアル＃3）80μlを適用し、40分間37℃でカバーガラスとインキュベートを適用します。
6. 振とうしながら5分間45°Cで3回ソリューションIIIを洗浄してスライドを洗浄します。
7. Cy5.5染色試薬（濃縮抗体検出CADキット、バイアル＃4）80μlを適用し、40分間37℃でカバーガラスとインキュベートを配置します。
8. 振とうしながら5分間45°Cで3回ソリューションIIIを洗浄してスライドを洗浄します。
9. スライドを傾けて、流体を許可ドレイン。アンチフェード試薬DAPI（SKYのペイントキット、バイアル＃5）の20μlを適用し、24ミリメートル×60 mmの顕微鏡のカバーガラスを配置します。慎重に形成されているかもしれない空気の泡を削除します。スライドはすぐに撮影さまたは4℃で保存し1週間を超えないために暗闇の中でCすることができます。

5。画像収集と分析

1. 画像の取得は60X油浸レンズを搭載したオリンパス顕微鏡、スペクトルキューブ（カスタム設計されたトリプルバンドパスフィルタ）、DAPIフィルターとCCDカメラによるサニャック干渉計モジュールを使用して、中期のスライドを表示することによって達成されます。
2. スペクトル核型は、ユーザーズマニュアルは、次のスカイビュー·ソフトウェア（応用分光イメージングバージョン1.62）を用いて行った。
3. 画像を分析した後、染色体はカラー画像（特定の蛍光色を含む）、擬似カラー画像（分類のための色）と反転DAPI画像（特定のバンディングパターン）と見なすことができます。

完全SKY手順は、通常1週間程度の時間（ 図1）をとります 。これは、中期細胞が十分に供給されていることを提供された画像の取得と分析が含まれています。核型分析では、野生型マウス（ 図2a）からの細胞の正常なマウスの核型（40、XY）を明らかにする。対照的に、PKD1から細胞^{- / -}マウス（PKDモデルマウス）染色体数や染色体欠失（染色体＃8）と転座（染色体＃11と19）（ 図2b）のような構造異常の有意な増加を示しています。また、ADPKD患者から血管組織を分析した。染色体の数を数えることによって、単純な研究では、非ADPKDといくつかのADPKD血管のサンプルは23対の染色体の正常な数値（ 図2c）を有していたことが示された。しかし、一般的に、我々は、染色体の46ペアで、その結果、染色体分離の障害を観察したDPKDサンプルの代わりに23対（ 図2d）。

図1。 SKYプロトコルのフローチャート。SKYプロトコルは細胞の前処理と中期の準備からの画像取得と解析を開始する実験を完了する手順を示しています。のフローチャートおおよそ一週間のタイムラインは日ごとにステップバイステップの手順で左側に提示されます。

図2。不死化マウス細胞株と新たに単離されたヒト初代培養細胞のスペクトル核型分析。個々の染色体の色と反転DAPI画像は染色体のソートの前に示されています。並べ替えの後、染色体は"分類"テーブルに表示されます。）は、野生型マウスからの中期スプレッドのSKYイメージが正常核型（40、XY）が含まれています。B） PKD1から中期スプレッドの>空画像^{- / -}マウスは、異常な染色体数（68の代わりに40）、このような染色体欠失（染色体＃8）と染色体転座（染色体＃11と19）のような染色体異常を示しています。C）SKY非ADPKD患者の血管組織からの中期スプレッドのイメージは、正常な核型（46、XX）を備えています。d）は ADPKD患者の血管組織から広がる中期の空のイメージは、異常な核型（92、XXXX）が含まれています。データの一部は、以前報告され、許可¹⁴で再利用されています。

スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体の組成を研究に使用される細胞遺伝学手法です。この手法では、染色体彩色プローブを活用し、これらのプローブの検出は、サニャック干渉計を介して取得されます。完全SKYプロセスは、通常1週間程度かかり、それはいくつかの重要なステップ（ 図1）が含まれます。 SKYは、最初のパディリャ、ナッシュら ³によって説明された標準プロトコルを使用しています。プロトコルは、以来、我々を含む様々な細胞遺伝学研究所、によって適合されています。

プロトコルの重要なステップの中で、良い品質の中期の準備が成功したSKYの分析を持っていることが極めて重要である。染色体があまりにも多くの細胞質を持っている場合や、スライドが古すぎる場合は、たとえば、画像の品質が損なわれる可能性があります。私たちのムービークリップで見られるように、細胞質の内容は簡単に差動の高解像度を使用して識別することができます干渉コントラスト顕微鏡技術。さらに、積極的に分裂する細胞の可用性は、SKY解析のための前提条件であり、これは長い時間や細胞に他の成長因子の添加のためにコルセミドで処理することによって克服することができます。 SKYの全体的な成功率はスキルとユーザの経験に大きく依存します。

SKYは単一の染色体の構造変化を含む染色体分析のための強力で信頼性の高いツールを提供しています。携帯倍数性に加えて、SKYは、染色体挿入、欠失、重複と転座を検討する可能性を提供しています。たとえば、SKYは、小説や隠された染色体異常と癌の発生と進行を¹⁵時の複雑な再配列の同定の同定を可能にする。さらに、SKYは進化⁴中に染色体再配列を研究して比較細胞遺伝学、内の研究分野に適用されています。 SKY技術を使用して、私たちの研究室では、多発性嚢胞腎疾患を持つマウスとヒト（ 図2）の染色体異常を識別するために最初になります。 SKYは、他の多くの染色体関連疾患に有益であることは間違いありません。実際には、我々はあの空にも繊毛は細胞分裂^14を制御することが示されている多くの繊毛に関連した病態で有用であろう提案する。

マウスやラットは、病気のメカニズムを研究し、in vivoでの機能評価を行うために重要な動物モデルであるため、SKY解析のためのマウスおよびラットのプローブの開発は、マウスとラットの染色体の核型分析ルーチンを許可している。現時点では、SKYしたがって、ヒト、マウス、ラットの染色体研究に限定されています。より多くの研究室ではゲノム組成を研究するために他の種を使用してしかし、それは別の生物の多くの染色体彩色プローブは間もなく市販されることを予見します。