Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

, ,

Department of Cell Biology, Harvard Medical School

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 107.20.7.65, User IP: 107.20.7.65, User IP Hex: 1796474689

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (60), e3888, doi:10.3791/3888 (2012).

Protocol: في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

1. المبيض خلية سرطان تشكيل الجسم الشبه الكروي

  1. تستزرع طلب تقديم العروض في التعبير عن خلايا سرطان المبيض في قاعدة متوسطة 10٪ (ثقافة الخلية المخصصة المتوسطة التي تحتوي على خليط 50:50 من 199 وMCDB105، المعطل الجنين بنسبة 10٪ مصل بقري و 1٪ من ركلة جزاء، بكتيريا). للتعبير عن طلب تقديم العروض في غير المسماة خلايا سرطان المبيض، transfect الخلايا مع طلب تقديم العروض 1 تحتوي على البلازميد وحدد لخلايا معربا عن طلب تقديم العروض. بدلا من ذلك، يمكن استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن عابر البروتينات الفلورية، أو خلايا يمكن أن تكون مرحلة ما قبل احتضان مع أحمر فلوري خلية تعقب صبغ (إينفيتروجن).
  2. قبل تشكيل الأجسام الشبه الكروية من سرطان المبيض، فمن الضروري أن تعد منخفضة التصاق 96 ثقافة أسفل جولة جيد أطباق. لإنتاج لوحات الثقافة المنخفضة التصاق، يضاف 30μl بولي HEMA (6mg هيدروكسي إيثيل ميثاكريليت في 1 95٪ EtOH مل) إلى حل كل بئر من 96 طبق كورنينج جيدا ثقافة الخلية. يتم تحضين لوحات 96 بشكل جيد في 37 درجة مئوية غير مرطب حاضنة لتتبخر والايثانول، لeaving فيلما من HEMA بولي في كل بئر. هذا الفيلم بولي HEMA يمنع الخلايا من الالتصاق على قاع البئر، مما اضطر الخلايا لتنمو في تعليق 18. [بدلا من ذلك، يمكن استخدام منخفضة للغاية لوحات ثقافة (موضوع متعدد الصفحات كورنينج) بدلا من بولي HEMA الأطباق المغلفة.]
  3. بعد مستعدون للثقافة التصاق منخفضة لوحات، ويعرض للتريبسين طبق من ذهب من خلايا سرطان المبيض، بيليه الخلايا في جهاز للطرد المركزي منضدية (هيراوس) عند 900 إطار التعاون الإقليمي لمدة 3 دقائق، ونضح وطاف في قاعدة متوسطة 10٪ إعادة تعليق.
  4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  5. ضبط تركيز مثل هذه الخلايا أن هناك 100 خلية لكل 50μl من قاعدة متوسطة 10٪.
  6. إضافة 50μl لتعليق الخلية المخففة علقت بشكل موحد على كل بئر من ال 96 جيدا بولي HEMA طبق ثقافة المغلفة.
  7. احتضان لوحة 96 بشكل جيد في 37 درجة مئوية خلية حاضنة الثقافة لمدة 16 ساعة (وينبغي زيادة هذه الكمية من الوقت أو ينقص تبعا لمقدار الوقت الذي يستغرقهخط خلية معينة لتشكيل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا أو الظروف التجريبية المطلوبة) للسماح للخلايا سرطان المبيض إلى كتلة معا، وتشكيل كروي واحد متعددة الخلايا في كل بئر. يمكن لبعض الخلايا السرطانية الخضوع لموت الخلايا المبرمج خلال هذه الفترة، لذلك من المهم أن تختار وقتا قبل استحثاث موت الخلايا المبرمج.

2. تكوين خلايا الظهارية أحادي الطبقة

  1. في خلية غطاء محرك السيارة والثقافة، وقبل معطف الآبار من 6 جيدا طبق ماتيك الزجاج أسفل مع فبرونيكتين بإضافة 2mL من فبرونيكتين 5μg / مل حل PBS إلى كل بئر من صحن وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. جودة البصري للقيعان من الزجاج في أطباق ماتيك تسمح عالية الدقة التصوير المجهري.
  2. تستزرع GFP، معربا عن الخلايا الظهارية في قاعدة متوسطة 10٪. يعرض للتريبسين لوحة من الخلايا الظهارية، وتدور باستمرار في جهاز للطرد المركزي منضدية (هيراوس) في 900RPM لمدة 3 دقائق، نضح طاف، ومتوسطة في قاعدة 10٪ إعادة تعليق. ووالخلايا الظهارية استخدمت هنا تعبير بالفعل GFP عندما تم الحصول عليها، ولكن يمكن أن تنتج الخلايا الظهارية غير المسماة التي transfecting مع GFP 1 تحتوي على البلازميد [كدنا]، أو preincubating الخلايا في خلية أخضر فلوري تعقب صبغ (إينفيتروجن).
  3. بعد حضانة فبرونيكتين لمدة 30 دقيقة (في الخطوة 2.1)، وغسل الآبار الطبق ماتيك مع PBS 2mL.
  4. نضح في برنامج تلفزيوني وصفيحة 6 5 X10 الخلية الظهارية لكل بئر في كل بئر من صحن ماتيك 6 جيدا. احتضان الطبق ماتيك في 37 درجة مئوية خلية حاضنة الثقافة بين عشية وضحاها للسماح للخلايا الظهارية لتعلقها على طبق وتشكيل أحادي الطبقة.

3. الظهارية الفحص خلية التخليص

  1. استخدام الماصة لجمع الأجسام الشبه الكروية بسرطان المبيض من 96 لوحة بولي HEMA جيد المغلفة.
  2. نضح في المتوسط ​​من بئر واحدة من طبق ماتيك 6 جيدا أحادي الطبقة التي تحتوي على الخلية الظهارية. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 2mL. إضافة كافة الأجسام الشبه الكروية من ص 96 جيدفي وقت متأخر لبئر واحدة من طبق ماتيك (~ 3X عدد الأجسام الشبه الكروية التي سوف يتم تصويرها لحساب هبوط الأجسام الشبه الكروية على جزء من الطبق الذي لا يمكن تصويرها).
  3. وضع طبق ماتيك على مرحلة مجهر مضان مقلوب widefield قادرة على أداء الوقت الفاصل بين التصوير لمدة 8 ساعات على الأقل. استخدم مرحلة الآلية في مناصب متعددة في صورة طبق، مع العديد من الأحداث إقحام كروي، في تجربة واحدة. نستخدم TI-E نيكون مقلوب الميكانيكية Widefield الإسفار الوقت الفاصل بين مجهر المتكاملة مع نظام مثالي التركيز وانخفاض [20X-0.75 الفتحة العددية (NA)] التكبير الفرق NA / تدخل النقيض (DIC) علم البصريات، وtransilluminator الهالوجين نيكون مع 0،52 NA لمسافات طويلة العمل (LWD) مكثف، نيكون سريع (<100 ميلي ثانية واحدة التبديل الوقت) الإثارة وانبعاث المرشحات (GFP تحويلة 480/40، إم 525/50، RFP-mCherry تحويلة 575/50 إم 640/50)، سوتر تنتقل بسرعة ومسار ضوء إيقاف الذكية epifluorescenceتبرد النسب، وخطي ترميز نيكون مرحلة الآلية، وهاماماتسو ORCA-AG المسؤول عن جهاز الديناميكي (اتفاقية مكافحة التصحر) وكاميرا، وحضانة مجهر مبنية خصيصا مع غرفة التحكم 2 درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون، ونيكون شيكل-AR عناصر برنامج الإصدار 3، و TMC طاولة الاهتزاز العزلة.
  4. فإن الأجسام الشبه الكروية خلية سرطان المبيض تترسب في القاع من صحن ونعلق على أحادي الطبقة الخلية الظهارية. جمع GFP، طلب تقديم العروض والصور من المرحلة 20 + كروي / أحادي الطبقة التفاعلات، كل 10 دقائق، لمدة 8 ساعات.
  5. فإن سرطان المبيض خلية الأجسام الشبه الكروية طلب تقديم العروض، معربا عن غزو في أحادي الطبقة GFP في التعبير عن الخلية الظهارية خلق ثقب في أحادي الطبقة. بعد 8 ساعات، قياس أحجام الثقوب عن طريق تتبع الثقوب السوداء في الصور GFP باستخدام عناصر البرنامج (أو برامج أخرى مناسبة مثل J الصورة). تطبيع حجم ثقب في حجم كروي الأولية من خلال تقسيم حجم ثقب في 8 ساعات بواسطة حجم كروي في الصورة المقابلة طلب تقديم العروض في الساعة صفر. في هذا السابقينوافرة، وقد تم قياس فقط في حجم ثقب مرة واحدة، ولكن يمكن قياسه عدة مرات في كافة مراحل التجربة ثماني ساعات لفهم أفضل للديناميات إقحام.

4. ممثل النتائج

في هذا المثال، قارنا القدرة تخليص الظهارية من OVCA433 الأجسام الشبه الكروية المبيض خلية سرطان أن يكون التعبير الموهن من تالين-1 للسيطرة على OVCA433 الأجسام الشبه الكروية. وأضيفت OVCA433 الأجسام الشبه الكروية من كل مجموعة إلى صحن ماتيك التي تحتوي على ZT monolayers الخلية الظهارية. تم تصوير ستة الأجسام الشبه الكروية من كل مجموعة في كل 10 دقائق لمدة ثماني ساعات (الشكل 4، الفيلم 3، فيلم 4). وتم قياس الثقوب التي تنتج في أحادي الطبقة من الأجسام الشبه الكروية ونشر وبلغ متوسط ​​ست وظائف من كل مجموعة. الشكل 4 يوضح أن منطقة المتوسط ​​التي أنشأتها إزالة الأجسام الشبه الكروية تالين ضربة قاضية 1 هو أقل بكثير من متوسط ​​المساحة التي أوجدتها سيطرة الأجسام الشبه الكروية، مما يوحي بأن هناك حاجة لإزالة تالين الظهارية بواسطة OVCA433 الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض.

الشكل 1
الشكل 1. المبيض الإنبثاث السرطان. أورام المبيض الأساسي تطوير إما من المبيض الظهارة السطحية أو قناة فالوب. الخلايا السرطانية / مجموعات قطع من الورم الرئيسي، وجمع في التجويف البريتوني. ويمكن بعد ذلك الخلايا السرطانية تجميعها لتشكيل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا. الأجسام الشبه الكروية نعلق بعد ذلك إلى الخلية الظهارية المبطنة monolayers التجويف البريتوني. وتستبعد الخلايا الظهارية من تحت كروي سرطان المبيض المرفقة، والسماح للالأجسام الشبه الكروية للوصول إلى الغشاء القاعدي الأساسي.

فيلم سرطان المبيض 1. الإنبثاث. انقر هنا لعرض الفيلم .

الشكل 2
الشكل 2.

الشكل (3)
الشكل 3. الظهارية الفحص التخليص. وتتشكل الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض بواسطة احتضان 100 طلب تقديم العروض في التعبير عن خلايا سرطان المبيض لكل بئر في بولي HEMA مطلي 96 جولة جيدا قاع طبق ثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بولي HEMA يمنع الخلايا من الالتصاق على طبق ثقافة، والسماح للخلايا البقاء في التعليق والالتزام بعضها البعض لتشكيل كتلة واحدة لكل بئر. وتعد الخلايا الظهارية monolayers بواسطة الطلاء 6x10 5 خلايا الظهارية لكل بئر في فبرونيكتين المغلفة 6 ماتيك طبق بشكل جيد واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. ثم يتم نقل الأجسام الشبه الكروية على طبق ماتيك مع أحادي الطبقة الظهارية والتقط السكان الخلية 2 كل 10 دقائق لمدة 8 ساعات باستخدام TI-E نيكون أناnverted الميكانيكية Widefield الإسفار الوقت الفاصل بين المجهر والبرمجيات عناصر.

فيلم 2. الظهارية الفحص التخليص. انقر هنا لعرض الفيلم .

الشكل 4
الشكل 4. التوهين من التعبير 1 في تالين OVCA433 الأجسام الشبه الكروية الظهارية يقلل قدرة التطهير. وسمح OVCA433 الأجسام الشبه الكروية (الحمراء) مع وبدون التعبير الموهن من تالين 1 إلى نعلق على وغزو إلى أحادي الطبقة الظهارية 1 ZT (الخضراء). والتقط سكان الخلية 2 كل 10 دقائق لمدة 8 ساعات باستخدام TI-E نيكون مقلوب الميكانيكية Widefield الإسفار الوقت الفاصل بين المجهر والبرمجيات العناصر. ويبين الرسم البياني أن تالين 1 توهينانخفاضات كبيرة في تخليص الخلية الظهارية (مؤامرة Quantile مع أشرطة خضراء على وسائل).

فيلم 3. التحكم OVCA433 الأجسام الشبه الكروية (الحمراء) في غزو أحادي الطبقة الظهارية (الخضراء). انقر هنا لعرض الفيلم .

فيلم 4. التوهين من التعبير 1 في تالين OVCA433 الأجسام الشبه الكروية (الحمراء) يقلل الظهارية (الخضراء) قدرة التطهير. انقر هنا لعرض الفيلم .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

في "الفحص التخليص الظهارية" المعروضة هنا يستخدم الوقت الفاصل بين المجهري لرصد تفاعلات الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض المتعددة الخلايا والخلايا الظهارية monolayers، في رائعة من التفصيل المكاني والزماني. سابقا، كانت عدة مجموعات تستخدم 8-14 المقايسات نقطة النهاية لإظهار أن خلايا سرطان المبيض ونعلق على غزو الخلايا الظهارية في monolayers. هذا الفحص هو فريد من نوعه من حيث أنه يستخدم خلايا fluorescently المسمى لتمييز الخلايا السرطانية من الخلايا الظهارية، بحيث يمكن رصد ديناميات هؤلاء السكان الخلية 2 في جميع أنحاء فحص. ويمكن لعملية إقحام تصور في الوقت الحقيقي، ويمكن أن معدل إزالة الظهارية قياسها كميا مع مرور الوقت. استخدام المجهر timelapse يسمح لأحد أن يرصد عن كثب ديناميات التفاعل بين السكان اثنين من خلية تحت ظروف تجريبية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، نسبة مئوية صغيرة من الخلايا الظهارية إما أو المبيض CE سرطانويمكن تسمية LLS مع علامة 1 فلوري ثالث لمراقبة ديناميات الخلايا الفردية في صفوف السكان. من خلال تتبع الخلايا الفردية مع مرور الوقت، يمكن حساب يكون الاتجاه ومعدل الهجرة. من أجل إجراء تحاليل دقة أعلى من تخليص الظهارية، ويمكن استخدام مجموع الداخلية انعكاس مضان (TIRF) المجهري. إذا وصفت التصاقات تنسيق في الخلايا الظهارية، ويمكن رصد تفكك التصاقات الظهارية بواسطة ملحقات تبارزي من الخلايا السرطانية، كما هو موضح في نشر رسائلنا السابقة 17.

ويمكن استخدام هذا الاختبار للمقارنة بين قدرة غزو الأجسام الشبه الكروية المبيض خلية سرطان التي تم تعديلها وراثيا أو دواء لإلقاء الضوء على الآليات الجزيئية التي الأجسام الشبه الكروية المبيض خلية سرطان مسح أحادي الطبقة الظهارية أو لتحديد مثبطات جزيء صغير من العملية. علاوة على ذلك، يتطلب فحص عدد قليل جدا من خلايا سرطان المبيض، وبالتالي الأولية tumoويمكن استخدام الخلايا R من الإفرازات السائل (انظر قيود أدناه) إذا وصفت من قبل preincubating الخلايا مع الأصباغ cytotracker (إينفيتروجن). الفحص هو أيضا قابلة للتحليل إنتاجية عالية. لإجراء دراسات إنتاجية عالية وراثية أو الدوائية، ويمكن transfected خلايا سرطان المبيض مع سيرنا ناقلات مختلفة أو تعامل مع مثبطات الدوائية مختلفة في كل بئر من لوحة 96-جيدا. يمكن مطلي monolayers الخلية الظهارية في 96 جيد أطباق ثقافة الزجاج أسفل، ويمكن نقل الأجسام الشبه الكروية 1:01 من لوحات بولي HEMA المغلفة لوحات أحادي الطبقة التي تحتوي على. يمكن تحسين كل خطوة من هذه الخطوات للاستخدام مع فحص الروبوتات بحيث مئات siRNAs أو مثبطات يمكن عرضه في وقت واحد.

واحدة من نقاط القوة في هذا الاختبار هو أن تكون قادرة على وضع نموذج لإقحام القوة التي تعتمد على خلايا سرطان المبيض في أحادي الطبقة الظهارية. مختبرنا تستخدم قوة الجر المجهري (TFM) لتحديد ما إذا FO الميكانيكيةRCE ينظم الظهارية 17 التخليص. وجدنا أن overexpression من إنتغرين α5 زيادة انقباض الخلايا مطلي على ركيزة فبرونيكتين مغلف بالمطاط، في حين رني ضربة قاضية بوساطة من تالين، أو الثاني الميوسين انخفضت انقباض الخلية 17. منذ downregulation من إنتغرين α5، تالين، أو الثاني الميوسين في الأجسام الشبه الكروية المبيض خلية سرطان انخفضت أيضا إزالة الظهارية، لدينا قياسات TFM دعم الفكرة القائلة بأن إزالة الظهارية في حدث تعتمد على القوات مقلص الخلوية، والتي في الخلايا مع القوات أعلى مقلص تسبب أكبر الظهارية التطهير. ولذلك، يمكن استخدام الفحص تخليص الظهارية لمزيد من فهم الأحداث إقحام، المرتبطة ورم خبيث كروي المبيض، والتي تعتمد على القوات الميكانيكية.

هذا فحص لديها عدد قليل من القيود على النظر. أولا، من أجل تشكيل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا، يجب أن يكون مثقف الخلايا في تعليق ما لا يقل عن 6 ساعات. إذاالخلايا غير قادرة على البقاء على قيد الحياة بدون مصفوفة الاتصال سوف تتضرر قدرتها على إزالتها. الثاني، فإنه من المفيد لاستخدام خلايا سرطان المبيض التي تشكل، والتعاقد موحدة الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا. إذا كانت خلايا سرطان المبيض تشكيل كتل فضفاضة فقط، فإنها قد تتفكك في النقل من لوحة polyHEMA مغلف بالمطاط في صحن يحتوي على أحادي الطبقة الظهارية، وخلق الأجسام الشبه الكروية من مختلف الأشكال والأحجام التي من شأنها أن تقلب إضافة إلى البيانات. ثالثا، إذا كانت الخلايا المستخدمة هي غير متجانسة، وهذا إضافة إلى تقلبات إضافية أحجام الثقوب التي تم إنشاؤها في أحادي الطبقة. من المهم لاستخدام الآبار تكرار متعددة (10-20/sample) وذلك بسبب التباين في مدى إقحام بعد ثماني ساعات. وتم في المقايسات وصفها هنا، وتستخدم راسخة سرطان المبيض (OVCA433) وخطوط الخلايا الظهارية (ZT). لجعل هذا الاختبار أكثر سريريا ذات الصلة، ويمكن استخدام الأولية خلايا سرطان المبيض، من استسقاء السائل من المرضى،. سيكون من المثير للاهتمام أن determالمعهد الوطني للإحصاء في الظهارية إذا المختبر خلية القدرة تخليص يرتبط مع نتائج سريرية. القيود المذكورة أعلاه من أهمية خاصة في الاعتبار عند استخدام العينات الأولية، كما أن عدد الخلايا الأولية المتاح هو العامل المحدد. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم للتحقق من سلامة أحادي الطبقة الظهارية قبل إجراء هذا الفحص. يمكن ان تكون ثابتة أحادي الطبقة الظهارية وملطخة للبروتينات تقاطع خلية خلية لضمان تقاطعات الخلية الظهارية سليمة.

أخيرا، يمكن فحص تخليص الظهارية تعديلها بسهولة للرد على أسئلة تجريبية محددة. هنا، كنا فبرونيكتين باعتبارها العنصر ECM التي تسمح للخلايا الظهارية المبيض والتمسك أطباق ثقافة زجاج القاع، ومع ذلك، يمكن أن تستخدم المكونات الأخرى بما في ذلك ECM الكولاجين وlaminin. وعلاوة على ذلك، يمكن إضافة أنواع الخلايا الأخرى التي تم العثور عليها تحت الغشاء القاعدي، بما في ذلك الخلايا الليفية، لهذا النظام التجريبي، لتقييم دورهذه أنواع الخلايا الظهارية في إزالة 9،19،20. وأخيرا، يمكن أيضا التفاعل من أنواع أخرى من الخلايا السرطانية (مثل البنكرياس، وسرطان الثدي، وغيرها) مع الخلايا الظهارية أن تكون على غرار استخدام هذا الفحص. وكان من الممكن لدراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية وأحادي الطبقة البطانية، وذلك باستخدام هذا الفحص، لتقليد intravasation أو تسرب (وقد وصفت فحوصات مماثلة في: 15،16،21-27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgements: في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

نود أن نشكر التصوير نيكون المركز في كلية الطب بجامعة هارفارد، ووترز على وجه التحديد جينيفر، لارا Petrak والسلمون ويندي، لتدريب واستخدام المجاهر timelapse بهم. ونود أيضا أن نشكر روزا نج وبيسير أكيم لإجراء مناقشات ذات قيمة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة جرانت 5695837 (إلى م. Iwanicki) وGM064346 إلى JSB، عن طريق منحة من ميريام والدكتور شيلدون اديلسون زاي للبحوث الطبية مؤسسة (لJSB).

Materials: في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

Name Company Catalog Number Comments
OVCA433 Ovarian Cancer Cells Gift from Dr. Dennis Slamon
ZT Mesothelial Cells Gift from Dr. Tan Ince
Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 19950
MCDB105 Cell Applications Inc. 117-500
FBS-heat inactivated GIBCO, by Life Technologies 10082
Pen-Strep GIBCO, by Life Technologies 15070
96 well plates Corning 3799
Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) Sigma-Aldrich 192066-25G For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH
EtOH Pharmco-AAPER 111ACS200 Dilute to 95% in dH20
Cell culture hood Nuaire NU-425-300
Tissue culture incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. 3110
incubator for poly-HEMA plates Labline Instruments Imperial III 305
Tabletop centrifuge Heraeus Instruments 75003429/01
6 well glass-bottom dish MatTek Corp. P06G-1.5-20-F
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG
PBS Cellgro 21-040-CV
Microscope Nikon Instruments Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System
Lens Nikon Instruments 20X-0.75 numerical apeture
Halogen transilluminator Nikon Instruments 0.52 NA long working distance condenser
Excitation and emission filters Chroma Technology Corp. GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
Transmitted and Epifluoresce light path Sutter Instrument Co. Smart Shutters
Linear-encoded motorized stage Nikon Instruments
Cooled charged-coupled device camera Hamamatsu Corp. ORCA-AG
Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control Custom Made
Vibration isolation table TMC
NIS-Elements software Nikon Instruments Version 3

References: في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

  1. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249, doi:caac.20006 [pii] 10.3322/caac.20006 (2009).
  2. Ries, L.G, Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D.G., Howlader, N., Horner, M.J., Mariotto, A., Miller, B.A., Feuer, E.J., Altekruse, S.F., Lewis, D.R., Clegg, L., Eisner, M.P., Reichman, M., & Edwards, B.K. In http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 National Cancer Institute. Bethesda, MD, (2007).
  3. Burleson, K.M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181, doi:10.1016/j.ygyno.2003.12.034 [pii] S0090825803009508 (2004).
  4. Birbeck, M.S. & Wheatley, D.N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
  5. Witz, C.A., Monotoya-Rodriguez, I.A., & Schenken, R.S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60, [pii] S0015028298004002 (1999).
  6. Zhang, X.Y., et al. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340, [pii] S1071-5576(99)00040-4 (1999).
  7. Kenny, H.A., Nieman, K.M., Mitra, A.K., & Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
  8. Niedbala, M.J., Crickard, K., & Bernacki, R.J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
  9. Kenny, H.A., Krausz, T., Yamada, S.D., & Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472, doi:10.1002/ijc.22874 (2007).
  10. Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240, doi: 10.2353/ajpath.2009.080613 [pii] S0002-9440(10)60982-0 (2009).
  11. Burleson, K.M., Boente, M.P., Pambuccian, S.E., & Skubitz, A.P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6, doi: 10.1186/1479-5876-4-6 [pii] 1479-5876-4-6 (2006).
  12. Heyman, L., et al. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244, doi: 10.1159/000152941 [pii] 000152941 (2008).
  13. Heyman, L., et al. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502, doi:10.1042/CBI20090331 [pii] CBI20090331(2010).
  14. Lessan, K., Aguiar, D.J., Oegema, T., Siebenson, L., & Skubitz, A.P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537, [pii] S0002-9440(10)65406-5 (1999).
  15. Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., & Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488, doi: 10.1016/j.cellbi.2005.01.008 [pii] S1065-6995(05)00048-X (2005).
  16. Leroy-Dudal, J., et al. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543, doi:10.1002/ijc.20778 (2005).
  17. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
  18. Folkman, J. & Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
  19. Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R.T., & Lancaster, W.D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
  20. Roberts, P.C., et al. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
  21. Okada, T., Okuno, H., & Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
  22. Zervantonakis, I.K., Kothapalli, C.R., Chung, S., Sudo, R., & Kamm, R.D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406, doi:10.1063/1.3553237 (2011).
  23. Brandt, B., et al. 3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395, doi: 10.1016/j.semcancer.2005.06.006 [pii] S1044-579X(05)00039-8 (2005).
  24. Condeelis, J. & Segall, J.E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930, doi:10.1038/nrc1231 [pii] ncr1231 (2003).
  25. Dai, J., Ting-Beall, H.P., Hochmuth, R.M., Sheetz, M.P., & Titus, M.A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
  26. Laferriere, J., Houle, F., Taher, M.M., Valerie, K., & Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772, doi:10.1074/jbc.M008564200 [pii] M008564200 (2001).
  27. Dong, C., Slattery, M.J., Rank, B.M., & You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).

Ask the Author: في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter