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 JoVE Clinical and Translational Medicine

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

, ,

Department of Cell Biology, Harvard Medical School

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Cite this Article: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (60), e3888, doi:10.3791/3888 (2012).

Abstract: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

O câncer de ovário é a quinta causa principal de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos 1. Apesar de uma resposta positiva inicial para terapias, 70 a 90 por cento das mulheres com câncer de ovário desenvolver com novas metástases, ea recorrência é muitas vezes fatal 2. É, portanto, necessário compreender como metástases secundárias surgir, a fim de desenvolver melhores tratamentos para o cancro intermediária e fase tardia do ovário. Metástase do cancro do ovário ocorre quando as células malignas destacar a partir do local do tumor primário e disseminar por toda a cavidade peritoneal. As células disseminadas pode formar aglomerados multicelulares, ou esferóides, que irá permanecer quer acopladas, ou implantes para órgãos dentro da cavidade peritoneal 3 (Figura 1, Filme 1).

Todos os órgãos dentro da cavidade peritoneal são revestidas com um único, a camada contínua de células mesoteliais 4-6 (Figura 2). No entanto, as células mesoteliais estão ausentes da parte de baixoperitoneais massas tumorais, como revelado por estudos de micrografia electrónica excisadas humanos secções de tecido de tumor 3,5-7 (Figura 2). Isto sugere que as células mesoteliais são excluídos por baixo da massa do tumor por um processo desconhecido.

Anterior, em experiências in vitro demonstraram que as células cancerosas do ovário primárias anexar mais eficientemente para a matriz extracelular do que para células mesoteliais 8, e os estudos mais recentes mostraram que os primários peritoneais células mesoteliais realmente proporcionar uma barreira para a adesão celular de ovário cancro e invasão (em comparação com adesão e invasão em substratos que não foram cobertos com células mesoteliais) 9,10. Isto sugere que as células mesoteliais actuar como uma barreira contra a metástase do cancro do ovário. Os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as células de câncer de ovário violam esta barreira, e excluir o mesotélio, até recentemente, permaneceu desconhecido.

Aqui descrevemos ªmetodologia e para um ensaio in vitro que os modelos de interacção entre esferóides de células cancerosas do ovário e células mesoteliais in vivo (Figura 3, Filme 2). O protocolo foi adaptado de métodos descritos anteriormente para analisar as interações ovarianos de células tumorais com monocamadas mesoteliais 8-16, e foi descrita pela primeira vez em um relatório mostrando que as células tumorais de ovário utilizar uma ativação dependente de integrinas de miosina e força de tração para promover a exclusão do células mesoteliais de 17 sob um tumor esferóide. Este modelo leva vantagem de lapso de tempo a microscopia de fluorescência para monitorar as populações de células de dois em tempo real, fornecendo informação espacial e temporal na interação. As células de cancro do ovário expressar vermelho proteína fluorescente (SDP), enquanto as células mesoteliais expressar a proteína verde fluorescente (GFP). RFP expressando esferóides de células cancerígenas de ovário anexar à monocamada expressando GFP-mesotelial. A propagação esferóides, invadir, eforçar as células mesoteliais de lado a criação de um buraco na monocamada. Este buraco é visualizado como o espaço negativo (preto) na imagem GFP. A área do orifício pode ser então medido quantitativamente analisar as diferenças na actividade folga entre o controlo e as populações experimentais de cancro do ovário e / ou células mesoteliais. Este ensaio requer apenas um pequeno número de células de ovário cancerosas (100 células por esferóides X 20-30 esferóides por condição), de modo que é possível realizar este ensaio usando preciosos primárias amostras de células tumorais. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para rastreio de alto rendimento.

Protocol: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

1. Ovarian Cancer Formação Spheroid celular

  1. RFP-expressando células cancerosas do ovário são cultivadas em meio de base de 10% (um meio de cultura de célula personalizado contendo uma mistura 50:50 de 199 e MCDB105, 10% de soro bovino fetal inactivado e 1% pen-strep). Para expressar RFP em células cancerosas do ovário não marcados, transfectar as células com um plasmídeo contendo RFP e seleccionar para células que expressam RFP. Alternativamente, os vectores virais podem ser usados ​​para expressar as proteínas fluorescentes transitoriamente, ou as células podem ser pré-incubar com um vermelho fluorescente de células rastreador corante (Invitrogen).
  2. Antes da formação de esferóides de cancro do ovário, é necessário preparar-adesão baixa 96 pratos de cultura de fundo redondo bem. Para produzir as placas de aderência baixa de cultura, 30μl poli-HEMA (6mg polyhydroxyethylmethacrylate em 1 ml de 95% EtOH) solução é adicionada a cada poço de uma bem Corning 96 prato de cultura de células. As placas de 96 poços são incubadas em um 37 ° C não-umidificado incubadora para evaporar o etanol, leaving uma película de poli-HEMA em cada poço. Esta película de poli-HEMA impede que as células se liguem ao fundo do poço, forçando as células a crescer em suspensão 18. [Alternativamente, Ultra-Low placas de fixação de cultura (Corning) pode ser usado em vez de poli-HEMA pratos revestidos.]
  3. Após os de baixa aderência placas de cultura são preparados, trypsinize uma placa de células de ovário, cancro, sedimentar as células em uma centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 RCF durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e re-suspender em meio de base de 10%.
  4. Contar as células utilizando um hemocitómetro.
  5. Ajustar a concentração de tais células que existem 100 células por 50 l de meio de base de 10%.
  6. Adicionar 50 l da suspensão de células em suspensão uniformemente diluído a cada poço da placa de cultura de 96 poços de poli-HEMA revestido.
  7. Incubar a placa de 96 poços em um 37 ° C incubador de cultura de células durante 16 horas (esta quantidade de tempo deve ser aumentada ou diminuída dependendo da quantidade de tempo que leva parauma linha de células particular para formar esferóides multicelulares ou desejado condições experimentais) para permitir que as células de cancro do ovário a agrupar em conjunto, formando um único esferóide multicelular em cada poço. Algumas células tumorais podem sofrer apoptose durante este período, por isso, é importante escolher um tempo anterior à indução de apoptose.

2. Formação de monocamada celular mesotelial

  1. Em um capuz de cultura de células, de pré-revestimento dos poços de uma 6 bem prato MatTek com fundo de vidro com fibronectina por adição de 2 mL de uma fibronectina 5μg / ml de solução PBS a cada poço do prato e incubando à temperatura ambiente durante 30 minutos. A qualidade óptica do vidro de fundo em pratos MatTek permitir a alta resolução de imagem microscópica.
  2. GFP-expressando células mesoteliais são cultivadas em meio de base de 10%. Trypsinize uma placa de células mesoteliais, girar em uma centrífuga de mesa (Heraeus) a 900RPM por 3 minutos, aspirar o sobrenadante, e re-suspensão em meio base de 10%. Océlulas mesoteliais aqui utilizados foram já expressando GFP quando eles foram obtidos, mas não marcados células mesoteliais podem ser produzidos por transfecção com um plasmídeo contendo ADNc de GFP, ou pré-incubação das células em um verde fluorescente de células rastreador corante (Invitrogen).
  3. Após a incubação a fibronectina de 30 minutos (no passo 2.1), lavar os poços do prato MatTek com 2mL de PBS.
  4. Aspirar o PBS e placa de 6 x10 5 de células mesoteliais por poço em cada poço do prato MatTek 6 bem. Incubar o prato MatTek em um 37 ° C incubador de cultura de células durante a noite para permitir que as células mesoteliais para anexar o prato e formam uma monocamada.

3. Ensaio Apuramento mesotelial celular

  1. Use uma pipeta para coletar os esferóides de câncer de ovário a partir da placa de 96 poli-HEMA bem revestido.
  2. Aspirar o meio a partir de um poço do prato MatTek 6 poços contendo uma monocamada de células mesoteliais. Lavar uma vez com 2 ml de PBS. Adicionar todos os esferóides a partir do 96 bem ptarde para um poço de o prato MatTek (~ o ​​número 3x de esferóides que vão a ser trabalhada a conta para a aterragem esferóides por parte do prato que não pode ser trabalhada).
  3. Coloque o prato MatTek com a fase de um microscópio de fluorescência invertido Widefield capaz de realizar lapso de tempo de imagem para a duração de pelo menos 8 horas. Use um palco motorizado para posições de imagens múltiplas no prato, com múltiplos eventos de intercalação esferóides, em um único experimento. Usamos uma Nikon Ti-E Invertido Motorizado Widefield Microscópio de fluorescência time-lapse com Sistema de Foco integrado perfeita e baixo [abertura 20x 0,75-numérica (NA)] ampliação / diferencial NA interferência de contraste (DIC) óptica, um transiluminador de halogênio Nikon com 0,52 NA distância de trabalho longa condensador (DPM), Nikon rápido (<100 milissegundos de comutação tempo) de excitação e emissão filtros (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter rápido transmissíveis Desligar e caminho de epifluorescência luz inteligenteters, uma Nikon fase linear codificado motorizado, um Hamamatsu ORCA-AG resfriado charge-coupled device câmera (CCD), uma custom-built câmara de incubação microscópio com a temperatura e CO controle 2, Nikon NIS Elements AR software versão 3, e um TMC mesa de isolamento de vibração.
  4. As células de câncer de ovário esferóides vai assentar no fundo do prato e coloque a monocamada de células mesoteliais. Colete GFP, RFP e imagens de fase de 20 + esferóides / monocamada interações, a cada 10 minutos, por 8 horas.
  5. Os RFP-expressam ovarianos esferóides de células cancerosas em invadir a monocamada de células GFP-expressando mesotelial criação de um buraco na monocamada. Após 8 horas, medir os tamanhos dos furos traçando os buracos negros nas imagens GFP utilizando elementos de software (ou outro software adequado, tal como J imagem). Normalizar o tamanho do furo para o tamanho inicial esferóide dividindo o tamanho do orifício de 8 horas com o tamanho do esferóide na imagem RFP correspondente no tempo zero. Neste examplo, o tamanho do buraco só foi medida uma vez, mas pode ser medido várias vezes ao longo da experiência de oito horas para entender melhor a dinâmica da intercalação.

4. Os resultados representativos

Neste exemplo, comparou a capacidade de apuramento de mesotelial OVCA433 ovarianos esferóides de células cancerosas que têm expressão atenuada do talina-1 para controlar OVCA433 esferóides. OVCA433 esferóides de cada grupo foram adicionados a um prato MatTek contendo monocamadas de células mesoteliais ZT. Seis esferóides de cada grupo foram fotografadas a cada 10 minutos durante oito horas (Figura 4, Filme 3, Filme 4). Os furos produzidos na monocamada pelos esferóides de espalhamento foram medidos e seis posições de cada grupo foram em média. A Figura 4 mostra que a área média de apuramento criado por talina 1 esferóides knockdown era significativamente menor do que a área média criado por esferóides controle, sugerindo que é necessária para talina depuração por O mesotelialVCA433 câncer de ovário esferóides.

A Figura 1
Figura 1. Metástase do câncer de ovário. Tumores ovarianos desenvolver a partir do epitélio de superfície do ovário ou trompas de falópio. As células tumorais / clusters romper com o tumor primário e recolher na cavidade peritoneal. As células tumorais podem então agregam para formar esferóides multicelulares. Esferóides, em seguida, anexar as monocamadas de células mesoteliais que revestem a cavidade peritoneal. As células mesoteliais são excluídos por baixo do esferóide anexa do cancro do ovário, permitindo que os esferóides para obter acesso à membrana basal subjacente.

Filme 1. Metástase do câncer de ovário. Clique aqui para ver filme .

A Figura 2
Figura 2.

A Figura 3
Figura 3. Ensaio Apuramento mesoteliais. Esferóides de cancro do ovário são formadas por incubação 100 RFP-expressando células do ovário do cancro por poço em um poli-HEMA revestido prato de cultura de 96 poços de fundo redondo, a 37 ° C durante 16 horas. Poli-HEMA impede que as células se liguem ao prato de cultura, permitindo que as células permaneçam em suspensão e aderirem umas às outras para formar um único agrupamento por poço. Monocamadas de células mesoteliais são preparados por plaqueamento 6x10 5 células mesoteliais por poço em um fibronectina revestido 6 prato MatTek bem e incubando a placa a 37 ° C durante 16 horas. Os esferóides são então transferidos para o prato MatTek com a monocamada mesotelial e as duas populações de células são gravadas a cada 10 minutos durante 8 horas, utilizando um Nikon Ti-E Inverted Motorizado Widefield Microscópio de fluorescência time-lapse e software Elements.

Filme 2. Ensaio Apuramento mesoteliais. Clique aqui para ver filme .

A Figura 4
Figura 4. Atenuação de talina expressão 1 em OVCA433 esferóides diminui a capacidade de apuramento mesotelial. OVCA433 esferóides (vermelho) com e sem expressão atenuada do talina 1 foram autorizados a juntar-se e invadir em uma monocamada ZT mesotelial (verde). As duas populações de células foram fotografadas a cada 10 minutos durante 8 horas, utilizando um Nikon Ti-E invertido motorizado Widefield Fluorescência lapso de tempo microscópio e software elementos. O gráfico mostra que talina 1 atenuaçãodiminui significativamente a depuração célula mesotelial (parcela Quantile com barras verdes no meio).

Filme 3. Controle OVCA433 esferóides (vermelho) invasores em uma monocamada mesotelial (verde). Clique aqui para ver filme .

Movie 4. Atenuação de talina expressão 1 em OVCA433 esferóides (vermelho) diminui mesotelial (verde) a capacidade de apuramento. Clique aqui para ver filme .

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Discussion: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

O "Ensaio Apuramento mesotelial" aqui apresentado usa de lapso de tempo de microscopia para monitorar as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais, em detalhe espacial e temporal. Anteriormente, vários grupos 8-14 tinha usado ensaios de ponto de extremidade para mostrar que as células de câncer de ovário juntar-se e invadir em monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio é único na medida em que utiliza células marcadas por fluorescência para distinguir as células tumorais a partir de células mesoteliais, de modo que a dinâmica das duas populações de células pode ser monitorizada ao longo do ensaio. O processo de intercalação pode ser visualizada em tempo real ea taxa de depuração mesotelial pode ser medida quantitativamente ao longo do tempo. O uso de microscopia timelapse permite acompanhar de perto a dinâmica da interação entre as duas populações de células em diferentes condições experimentais. Além disso, uma pequena porcentagem de tanto as células mesoteliais ou o câncer de ovário ceLLS pode ser marcado com um marcador fluorescente terceiro para monitorar a dinâmica das células individuais dentro da população. Ao rastrear células individuais ao longo do tempo, a direccionalidade e taxa de migração pode ser calculada. Para realizar análises de alta resolução de depuração mesotelial, reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF) pode ser usado. Se adesões focais são rotulados nas células mesoteliais, a dissociação das aderências mesoteliais por extensões protrusivos das células tumorais pode ser monitorizada, tal como descrito na nossa publicação anterior 17.

Este ensaio pode ser usado para comparar a capacidade de invasão de esferóides de células cancerosas do ovário que foram geneticamente modificados ou farmacologicamente para elucidar os mecanismos moleculares pelos quais esferóides de células de cancro do ovário limpar a monocamada mesotelial ou para identificar inibidores de moléculas pequenas do processo. Além disso, o ensaio requer um número muito pequeno de células cancerosas do ovário, de modo tumo primárioAs células a partir de exsudados r fluido pode ser usado (ver abaixo limitações) se rotulados por pré-incubação das células com corantes cytotracker (Invitrogen). O ensaio é também passíveis de análise com rendimento elevado. Para realizar os estudos de elevada capacidade genéticos ou farmacológicos, as células de cancro do ovário pode ser transfectadas com vectores de siRNA diferentes ou tratados com diferentes inibidores farmacológicos em cada poço da placa de 96 poços. Monocamadas de células mesoteliais pode ser plaqueada em 96 bem pratos de cultura com fundo de vidro, e os esferóides podem ser transferidos 01:01 a partir das placas de poli-HEMA revestidos às placas contendo monocamada. Todas estas etapas podem ser optimizados para utilização com os robôs de rastreio de modo a que centenas de siRNAs ou inibidores podem rastreados de uma só vez.

Uma das vantagens deste ensaio é o de ser capaz de modelar a intercalação força-dependente de células de cancro do ovário na monocamada mesotelial. Nosso laboratório usaram microscopia de força de tração (TFM) para determinar se fo mecânicarce regula 17 apuramento mesotelial. Nós descobrimos que a superexpressão da integrina α5 aumentou a contractilidade de células plaqueadas sobre um substrato revestido a fibronectina, enquanto RNAi mediada knockdown de talina, ou II miosina diminuição da contractilidade célula 17. Desde downregulation de integrina α5, talina, ou II miosina nos ovarianos esferóides de células cancerosas também diminuição da depuração mesotelial, nossas medições de TFM apoiar a idéia de que a depuração mesotelial em um evento dependente de celulares forças contráteis, no qual as células com maior força contrátil causado maior mesotelial depuração. Portanto, o ensaio de depuração mesotelial pode ser usado para melhor compreender os eventos de intercalação, associados a metástase esferóide de ovário, que são dependentes de forças mecânicas.

Este ensaio tem algumas limitações a serem consideradas. Em primeiro lugar, a fim de formar os esferóides multicelulares, as células devem ser cultivadas em suspensão durante pelo menos 6 horas. Seas células são incapazes de sobreviver sem matriz entre em contato com sua capacidade de apuramento será comprometida. Segundo, é vantajosa a utilização de células de ovário cancerosas que formam uniformes, compactas esferóides multicelulares. Se as células de cancro do ovário apenas formam aglomerados soltos, eles podem quebrar na transferência a partir da placa polyHEMA-revestido para o prato contendo a monocamada mesotelial, criando esferóides de diferentes formas e tamanhos que irá adicionar variabilidade para os dados. Em terceiro lugar, se as células utilizadas são heterogéneos, isto irá adicionar variabilidade adicional para os tamanhos de orifícios criados na monocamada. É importante a utilização de poços em duplicado múltiplas (10-20/sample) devido à variabilidade na extensão da intercalação após oito horas. Nos ensaios aqui descritos, bem estabelecida cancro do ovário (OVCA433) e mesoteliais linhas (ZT) de células foram usadas. Para tornar este ensaio clinicamente mais relevante, as células de ovário primárias do cancro, a partir do fluido ascítico de pacientes, pode ser usado. Seria interessante para determine se in vitro a capacidade da célula mesotelial depuração se correlaciona com a evolução clínica. As limitações acima são particularmente importante a considerar quando se utiliza amostras primárias, como o número de células primárias disponíveis é um factor limitativo. Além disso, é importante verificar a integridade da monocamada mesotelial antes de realizar este ensaio. A monocamada mesotelial podem ser fixadas e coradas para proteínas célula-célula de junção para assegurar que as junções celulares mesoteliais estão intactos.

Finalmente, o ensaio de depuração mesotelial pode ser facilmente modificado para responder a perguntas específicas experimentais. Aqui, foi utilizado como o componente de fibronectina ECM que permite que as células do ovário e mesoteliais a aderir aos pratos de cultura com fundo de vidro, no entanto, outros componentes de ECM podem ser utilizados, incluindo o colagénio ea laminina. Além disso, outros tipos de células que são encontrados sob a membrana basal, incluindo fibroblastos, pode ser adicionado a este sistema experimental, para avaliar o papeldestes tipos de células na depuração mesotelial 9,19,20. Por último, as interacções de outros tipos de células tumorais (por exemplo, da mama pancreática, etc) com células mesoteliais também pode ser modelado com este ensaio. E é viável para estudar as interacções entre as células cancerosas e uma monocamada endotelial, com este ensaio, para imitar intravasation ou extravasamento (ensaios semelhantes têm sido descritos em: 15,16,21-27).

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Disclosures: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgements: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Gostaríamos de agradecer a Nikon Imaging Center da Harvard Medical School, Waters especificamente Jennifer, Lara Petrak e Salmon Wendy, à formação e à utilização de microscópios seus timelapse. Gostaríamos também de agradecer a Rosa Nunes e Achim Besser pelas valiosas discussões. Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant 5695837 (para M. Iwanicki) e GM064346 a JSB; por uma concessão do Dr. Miriam e G. Sheldon Adelson Medical Research Foundation (para ICC).

Materials: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Name Company Catalog Number Comments
OVCA433 Ovarian Cancer Cells Gift from Dr. Dennis Slamon
ZT Mesothelial Cells Gift from Dr. Tan Ince
Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 19950
MCDB105 Cell Applications Inc. 117-500
FBS-heat inactivated GIBCO, by Life Technologies 10082
Pen-Strep GIBCO, by Life Technologies 15070
96 well plates Corning 3799
Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) Sigma-Aldrich 192066-25G For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH
EtOH Pharmco-AAPER 111ACS200 Dilute to 95% in dH20
Cell culture hood Nuaire NU-425-300
Tissue culture incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. 3110
incubator for poly-HEMA plates Labline Instruments Imperial III 305
Tabletop centrifuge Heraeus Instruments 75003429/01
6 well glass-bottom dish MatTek Corp. P06G-1.5-20-F
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG
PBS Cellgro 21-040-CV
Microscope Nikon Instruments Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System
Lens Nikon Instruments 20X-0.75 numerical apeture
Halogen transilluminator Nikon Instruments 0.52 NA long working distance condenser
Excitation and emission filters Chroma Technology Corp. GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
Transmitted and Epifluoresce light path Sutter Instrument Co. Smart Shutters
Linear-encoded motorized stage Nikon Instruments
Cooled charged-coupled device camera Hamamatsu Corp. ORCA-AG
Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control Custom Made
Vibration isolation table TMC
NIS-Elements software Nikon Instruments Version 3

References: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

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