JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

In vitro mesothelial Avslutande analys att modeller de tidiga stegen av äggstockscancer Metastasis

1, 1, 1

1Department of Cell Biology, Harvard Medical School

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.196.73.218, User IP: 54.196.73.218, User IP Hex: 918833626

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Mesothelial clearance analysen som beskrivs här drar nytta av fluorescensmärkta celler och time-lapse video mikroskopi för att visualisera och kvantitativt mäta samspelet mellan flercelliga äggstockscancer sfäroiderna och mesothelial monoskikt cell. Denna analys modellerar de tidiga stegen av äggstockscancer metastas.

    Date Published: 2/17/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3888

    Cite this Article

    Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (60), e3888, doi:10.3791/3888 (2012).

    Abstract

    Äggstockscancer är den femte vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i USA 1. Trots en positiv första reaktion terapier, 70 till 90 procent av kvinnor med äggstockscancer utveckla nya metastaser och återfall är ofta dödlig 2. Det är därför nödvändigt att förstå hur sekundära metastaser uppkommer i syfte att utveckla bättre behandlingar för mellan-och sent stadium äggstockscancer. Äggstockscancer metastas inträffar när maligna celler bort från det primära tumörstället och sprida hela peritonealhålan. De sprids celler kan bilda flercelliga kluster, eller sfäroider, som antingen kommer att förbli obundna eller implantat på organ inom bukhålan 3 (figur 1, Film 1).

    Alla organ i peritonealhålan är fodrade med ett enda, kontinuerlig, skikt av mesotelceller 4-6 (figur 2). Emellertid mesotelceller är frånvarande från undersidanperitoneal tumör massorna, som framkommit vid elektronmikrofotografi studier av utskurna human tumörvävnad avsnitt 3,5-7 (Figur 2). Detta antyder att mesotelceller utesluts från undersidan av tumörmassan genom en okänd process.

    Tidigare in vitro försök visade att primära ovariala cancerceller fästa mer effektivt till extracellulär matris än i mesotelceller 8, och nyare studier visade att den primära peritoneala mesotelceller verkligen tillhandahåller en barriär mot äggstockscancer celladhesion och invasion (jämfört med vidhäftningen och invasion på substrat som inte täcks av mesotelcellerna) 9,10. Detta tyder på att mesotelceller verka som en barriär mot äggstockscancer metastas. De cellulära och molekylära mekanismer genom vilka äggstockscancer cancerceller bryter mot detta hinder, och utesluta mesothelium har tills nyligen var okänd.

    Här beskriver vi the metoder för en in vitro-test som modellerar samspelet mellan cellen äggstockscancer sfäroiderna och mesotelcellerna in vivo (figur 3, Movie 2). Vår protokollet anpassades från tidigare beskrivna metoder för att analysera äggstockarna tumörceller interaktioner med mesothelial monolager 8-16, och beskrevs första gången i en rapport som visar att ovariellt tumörceller använder en integrin-beroende aktivering av myosin och dragkraft för att främja uteslutandet av mesotelceller från under en tumör sfäroid 17. Denna modell tar fördel av tidsförlopp fluorescensmikroskopi för att övervaka de två cellpopulationer i realtid, vilket ger spatial och temporal information om interaktionen. De ovariala cancerceller uttrycker röd fluorescerande protein (RFP) medan mesotelcellerna uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP). RFP-uttryckande äggstockscancer sfäroiderna cancercellinjer tillmäter GFP-uttryckande mesothelial monolager. Sfäroiderna spridning, invadera, ochtvinga mesotelceller undan skapa ett hål i monolagret. Detta hål visualiseras som den negativa utrymmet (svart) i GFP bilden. Området hålet kan sedan mätas för att kvantitativt analysera skillnader i clearance aktivitet mellan kontroll och experimentella populationer av äggstockscancer och / eller mesotelceller. Denna analys kräver bara ett litet antal av äggstockscancerceller (100 celler per sfäroida X 20-30 sfäroider per betingelse), så det är möjligt att utföra denna analys med användning av dyrbara primär tumörcell prover. Dessutom kan denna analys kan enkelt anpassas för högeffektiv screening.

    Protocol

    1. Äggstockscancer Cell sfäroid Formation

    1. RFP-uttryckande äggstockscancer celler odlas i 10%-basmedium (en anpassad cellodlingsmedium innehållande en 50:50 blandning av 199 och MCDB105, 10% fetalt bovint serum och 1% pen-strep). Att uttrycka RFP i omärkta ovariala cancerceller, transfektera cellerna med en plasmid innehållande RFP och selektera för celler som uttrycker RFP. Alternativt kan virala vektorer användas för att transient uttrycka fluorescerande proteiner eller celler kan för-inkubera med en röd fluorescerande celler spårnings-färgämne (Invitrogen).
    2. Innan formning av sfäroider äggstockscancer, är det nödvändigt att utarbeta lågvidhäftände 96 och rund rätter botten kultur. För att producera de lågvidhäftände odlingsplattor, 30 pl poly-HEMA (6 mg polyhydroxietylmetakrylat i 1 ml 95% EtOH) tillsätts till varje brunn i en 96 brunn Corning cellodlingsskål. Plattorna med 96 brunnar, inkuberas i en 37 ° C icke-fuktad inkubator för att avdunsta etanol, leaving en film av poly-HEMA på varje brunn. Denna poly-HEMA filmen förhindrar celler från att fästa till botten av brunnen, vilket tvingar cellerna att växa i suspension 18. [Alternativt kan Ultra-Low Attachment odlingsplattor (Corning) användas i stället för poly-HEMA belagda skålar.]
    3. Efter att de lågvidhäftande odlingsplattor framställes, Trypsinisera en platta av äggstockscancerceller och pelletera cellerna i en bordscentrifug (Heraeus) vid 900 RCF i 3 minuter, Sug av supematanten och återsuspendera i 10%-basmedium.
    4. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer.
    5. Justera koncentrationen av celler så att det finns 100 celler per 50 ^ 10% basmedium.
    6. Tillsätt 50 pl av den likformigt suspenderade utspädda cellsuspensionen till varje brunn i 96 brunn poly-HEMA belagda odlingsskål.
    7. Inkubera plattan med 96 brunnar i en 37 ° C cellkultur inkubator under 16 timmar (denna tid ökas eller minskas beroende på den tid det tar fören speciell cellinje för att bilda flercelliga sfäroider eller önskade experimentella förhållanden) för att tillåta de ovariala cancerceller till klunga ihop och bildar en enda multicellulär sfäroid i varje brunn. Vissa tumörceller kan genomgå apoptos under denna period, så det är viktigt att välja en tid före induktion av apoptos.

    2. Mesotelcell monoskikt Bildning

    1. I en cellodling huv, förbeläggning av brunnarna i en 6-brunnars glasbottnade MatTek skålen med fibronektin genom tillsats av 2 ml 5 pg ett fibronektin / ml PBS-lösning till varje brunn i plattan och inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter. Den optiska kvaliteten på glas-bottoms i Mattek rätter möjliggöra högupplösta mikroskopisk avbildning.
    2. GFP-uttryckande mesotelceller odlas i 10%-basmedium. Trypsinisera en platta av mesotelceller, centrifugera ner i en bordscentrifug (Heraeus) vid 900RPM under 3 minuter, aspirera supernatanten, och återsuspendera i 10%-basmedium. Denmesotelceller som används här redan uttrycker GFP då de erhölls utan omärkta mesotelceller kan framställas genom att transfektera med en plasmid innehållande GFP-cDNA, eller förinkubering av cellerna i en grönfluorescerande celler spårnings-färgämne (Invitrogen).
    3. Efter 30-minuters fibronektin inkubation (i steg 2,1), tvätta brunnarna i MatTek skålen med 2 ml PBS.
    4. Aspirera PBS och plattan 6 x 10 5 mesotelcell per brunn i varje brunn i 6-brunnars MatTek skålen. Inkubera MatTek skålen i en 37 ° C cellodling inkubator över natten för att låta mesotelcellerna att fästa skålen och bilda ett monolager.

    3. Mesotelcell Clearance analys

    1. Använd en pipett för att samla in sfäroiderna äggstockscancer från 96 brunnar poly-HEMA plåt.
    2. Aspirera mediet från en brunn av 6 väl MatTek skål innehållande en mesotelcell monolager. Tvätta en gång med 2 ml PBS. Lägga till alla sfäroiderna från 96-psent att en brunn på MatTek skålen (~ 3x antalet sfäroider som kommer att avbildas till svars för sfäroider landning på den del av skålen som inte kan avbildas).
    3. Placera MatTek skålen på scenen av en omvänd widefield fluorescensmikroskop kan utföra time-lapse avbildning för minst 8 timmar. Använd en motordriven steg för bild flera positioner i skålen, med flera sfäroida interkalering evenemang, i ett enda experiment. Vi använder en Nikon Ti-E Inverterad Motoriserad Widefield Fluorescens time-lapse mikroskop med inbyggd Perfect Focus System och låg [20x-0,75 numerisk apertur (NA)] förstoring / NA differential interferens kontrast (DIC) optik, en Nikon halogen transilluminator med 0,52 NA långa arbetsavstånd (LWD) kondensor, Nikon snabbt (<100-millisekund byta tid) excitations-och utsläpp filter (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter snabbt överförs och epifluorescens ljusstrålen Smart Shutgor, en Nikon linjär kodad motoriserad scen, en Hamamatsu ORCA-AG kyls charge-coupled device (CCD) kamera, en specialbyggd mikroskop inkubationskammaren med temperatur och CO 2 kontroll Nikon NIS-element AR version 3, och en TMC vibrationsisolering bord.
    4. De äggstockscancer celler sfäroiderna kommer sjunka till botten av skålen och fäster vid mesotelcellen monoskiktet. Samla GFP, RFP och bilder fas av 20 + sfäroida / cellslager interaktioner, var 10 minuter för 8 timmar.
    5. RFP-uttryckande ovariala cancercell-sfäroider kommer att invadera i GFP-uttryckande mesotelcell monoskikt skapa ett hål i monolagret. Efter 8 timmar mäta storleken på de hål genom att spåra de svarta hål i GFP bilder med användning Elements (eller annan lämplig mjukvara, såsom bild J). Normalisera den hålstorlek som den initiala sfäroid storlek genom att dividera hålstorlek vid 8 timmar efter storleken av sfäroiden i motsvarande RFP bilden vid tidpunkten noll. I detta exgott var hålstorlek endast mäts en gång, men det kan mätas flera gånger under åtta timmars försöket att bättre förstå dynamiken i interkalering.

    4. Representativa resultat

    I detta exempel jämförde vi mesotelceller clearance förmåga OVCA433 cell äggstockscancer sfäroider som har försvagade expression av talin-1 för att styra OVCA433 sfäroider. OVCA433 sfäroider från varje grupp sattes till en MatTek skål innehållande ZT mesotelceller cellmonoskikt. Sex sfäroider från varje grupp avbildades var 10 minuter för åtta timmar (Figur 4, Film 3, Film 4). Hålen som produceras i monoskikt av spridningskretsarna sfäroiderna mättes och sex positioner från varje grupp beräknades. Figur 4 visar att den genomsnittliga clearance område som uppstår genom talin 1 knockdown sfäroiderna var betydligt mindre än den genomsnittliga område som uppstår genom kontroll sfäroiderna, vilket antyder att Talin krävs för mesothelial godkännande av OVCA433 äggstockscancer sfäroider.

    Figur 1
    Figur 1. Ovarian Cancer Metastasis. Primära äggstockstumörer utveckla antingen från äggstockar ytepitelet eller äggledarna. Tumörceller eller kluster bryta bort från den primära tumören och uppsamlas i den peritoneala kaviteten. Tumörceller kan sedan aggregera för att bilda flercelliga sfäroider. Sfäroiderna fästa sedan till mesotel cellmonoskikten bekläder den peritoneala kaviteten. Mesotelcellerna utesluts från undersidan av bifogade äggstockscancer sfäroid, vilket tillåter de sfäroider för att få tillgång till det underliggande basalmembranet.

    Film 1. Äggstockscancer metastaser. Klicka här för att se filmen .

    Figur 2
    Figur 2.

    Figur 3
    Figur 3. Mesotelceller Clearance-analys. Äggstockscancer sfäroider bildas genom inkubering av 100 RFP-uttryckande äggstockscancerceller per brunn i en poly-HEMA belagda 96-brunnars rundbottnad odlingsskål vid 37 ° C under 16 timmar. Poly-HEMA hindrar cellerna från att fästa vid odlingsskålen, vilket tillåter celler att förbli i suspension och vidhäftar till varandra för att bilda en enda grupp per brunn. Mesotelceller cellmonoskikt framställes genom utstrykning 6x10 5 mesotelcellerna per brunn i en fibronektin belagd 6 väl MatTek skål och inkubering av plattan vid 37 ° C under 16 timmar. Sfäroiderna överförs sedan till den MatTek skålen med mesotelceller monoskiktet och de två cellpopulationerna avbildas var 10 minuter under 8 timmar med användning av en Nikon Ti-E Inverted Motoriserad Widefield Fluorescens time-lapse mikroskop och Elements.

    Film 2. Mesothelial Clearance Analys. Klicka här för att se filmen .

    Figur 4
    Figur 4. Dämpning av Talin 1 uttryck i OVCA433 sfäroiderna minskar mesothelial clearance förmåga. OVCA433 sfäroider (röd) med och utan försvagade uttryck för Talin 1 fick fästa till och invadera in i en ZT mesothelial monolager (grön). De två cellpopulationer, försågs med bild var 10 minut under 8 timmar med användning av en Nikon Ti-E Inverterad motoriserad Widefield Fluorescens tidsförlopp mikroskop och element mjukvara. Diagrammet visar att Talin 1 dämpningsignifikant minskar mesotelcell clearance (kvantil tomt med gröna staplar på medel).

    Film 3. Kontroll OVCA433 sfäroider (röd) invaderande till en mesothelial monolager (grön). Klicka här för att se filmen .

    Movie 4. Dämpning av Talin 1 uttryck i OVCA433 sfäroider (röd) minskar mesothelial (grön) clearance förmåga. Klicka här för att se filmen .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den "mesothelial Clearance Assay" presenteras här använder time-lapse mikroskopi för att övervaka samspelet mellan flercelliga äggstockscancer sfäroiderna och mesothelial monoskikt cell, i stor rumslig och temporal detalj. Tidigare hade flera grupper 8-14 används för endpoint analyser för att visa att äggstockscancer cancerceller fäster till och invadera in i mesothelial cellmonoskikt. Denna analys är unik genom att den använder fluorescensmärkta celler för att skilja tumörceller från mesotelceller, så att dynamiken hos dessa två cellpopulationer kan övervakas under hela analysen. Förfarandet enligt interkalering kan visualiseras i realtid och hastigheten för clearance mesotelceller kan mätas kvantitativt med tiden. Användningen av timelapse mikroskopi gör det möjligt att noggrant övervaka dynamiken i samspelet mellan de båda cellpopulationerna under olika experimentella betingelser. Dessutom, en liten andel av antingen mesotelceller eller äggstockscancer ceLLS kan märkas med en tredje fluorescerande markör för att övervaka dynamiken i enskilda celler i befolkningen. Genom att spåra individuella celler under en tid, kan den riktverkan och hastigheten för migreringen beräknas. Att utföra högupplösta analyser av mesotelceller clearance kan total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi användas. Om fokala sammanväxningar är märkta i mesotelceller, kan dissociationen av mesotelceller från adhesioner utskjutande förlängningar av tumörceller övervakas, såsom beskrivs i vår tidigare publikation 17.

    Denna analys kan användas för att jämföra invasionen förmåga cell äggstockscancer sfäroider som har blivit genetiskt eller farmakologiskt modifierade för att belysa de molekylära mekanismer genom vilka ovariala cancercell-sfäroider rensa mesotelceller monoskikt eller för att identifiera småmolekylära hämmare av processen. Dessutom kräver analysen ett mycket litet antal celler äggstockscancer, så primära tumor-celler från flytande utsöndringar kan användas (se begränsningar nedan) om märkt genom förinkubering av cellerna med cytotracker färgämnen (Invitrogen). Analysen är också mottagliga för hög genomströmning analys. Att utföra hög genomströmning genetiska eller farmakologiska studier, kan de ovariala cancerceller transfekteras med olika siRNA vektorer eller behandlas med olika farmakologiska hämmare i varje brunn i 96-brunnars platta. Mesotelceller cellmonoskikt kan pläteras i 96-brunnars glasbottnade odlingsskålar, och sfäroiderna kan överföras 01:01 från poly-HEMA-belagda plattor med monoskikt-innehållande plattor. Alla dessa steg kan optimeras för användning med screening robotar så att hundratals siRNA eller hämmare kan screenas på en gång.

    En av styrkorna med denna analys är att kunna modellera den kraft-beroende interkalering av äggstockscancer celler i mesothelial monoskiktet. Vårt laboratorium används mikroskopi dragkraft (TFM) för att avgöra om mekanisk foRCE reglerar mesothelial clearance 17. Vi fann att överuttryck av α5 integrin ökade kontraktilitet av celler placerades på ett fibronektin-substratet, medan RNAi-medierad knockdown i Talin, eller myosin II minskad cellen kontraktilitet 17. Sedan nedreglering av α5 integrin, Talin eller myosin II i cellen ovarialcancer sfäroiderna också minskat mesothelial clearance, våra TFM mätningar stödjer idén att mesothelial clearance i en händelse beror på cellulära sammandragande krafter, i vilka celler med högre sammandragande krafter som orsakas större mesothelial clearance. Därför kan mesothelial clearance analysen kan användas för att ytterligare förstå interkalering händelser, i samband med ovariell sfäroid metastaser, som är beroende av mekaniska krafter.

    Denna analys har några begränsningar att tänka på. Först, för att bilda de flercelliga sfäroider, måste cellerna odlas i suspension i minst 6 timmar. Omcellerna inte kan överleva utan matrix kontakta clearance förmåga kommer att äventyras. För det andra är det fördelaktigt att använda äggstockscancerceller som bildar en enhetlig och kompakta flercelliga sfäroider. Om äggstockscancer cancercellerna bara bilda lösa kluster, kan de bryta isär i överföringen från polyHEMA-belagda plattan skålen innehåller mesothelial monoskiktet skapa sfäroider i olika former och storlekar som kommer att lägga variabilitet till data. Tredje, om de använda cellerna är heterogena, kommer detta lägga till ytterligare variation av storlekar av hålen som skapats i monolagret. Det är viktigt att använda flera replikatbrunnar (10-20/sample) på grund av variabiliteten i omfattningen av interkalation efter åtta timmar. I de analyser som beskrivs här, var väletablerad äggstockscancer (OVCA433) och mesotelceller (ZT)-cellinjer användas. För att göra denna analys mer kliniskt relevant, kan primära ovariala cancerceller, från ascitesvätska av patienter, kan användas. Det skulle vara intressant att determine om det in vitro mesotelcell clearance förmågan korrelerar med kliniska utfallet. Begränsningarna ovan är särskilt viktigt att tänka på när du använder primära prover som antalet primära celler som finns är en begränsande faktor. Dessutom är det viktigt att kontrollera integriteten i mesothelial monoskiktet innan du utför denna analys. Mesothelial enkelskikt kan fastställas och färgas för cell-cell junction proteiner för att se till att mesotelcell korsningar är intakta.

    Slutligen kan mesothelial clearance analysen lätt modifieras för att svara på specifika experimentella frågor. Här har vi använt fibronektin som ECM-komponent som låter äggstocks-och meso-celler att vidhäfta till de glasbottnade odlingsskålar, emellertid kan andra ECM-komponenter användas, inklusive kollagen och laminin. Vidare kan andra celltyper som finns i basalmembranet, inklusive fibroblaster, sättas till detta experimentella system, för att bedöma rollenDessa typer av celler i mesotelceller clearance 9,19,20. Slutligen kan interaktioner mellan andra typer av tumörceller (t ex pankreas-, bröst-, etc) med mesotelceller också modelleras med användning av denna analys. Och det är möjligt att studera växelverkan mellan cancerceller och en endoteliala monoskiktet, med användning av denna analys, för att efterlikna intravasering eller extravasering (Liknande analyser har beskrivits i: 15,16,21-27).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Vi har inget att lämna ut.

    Acknowledgements

    Vi vill tacka Nikon Imaging Center vid Harvard Medical School, speciellt Jennifer Waters, Lara Petrak och Wendy Lax, för utbildning och användning av sina timelapse mikroskop. Vi vill också tacka Rosa Ng och Achim Besser för värdefulla diskussioner. Detta arbete stöddes av NIH Grant 5695837 (till M. Iwanicki) och GM064346 för att JSB, genom ett bidrag från Dr Miriam och Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (till JSB).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OVCA433 Ovarian Cancer Cells Gift from Dr. Dennis Slamon
    ZT Mesothelial Cells Gift from Dr. Tan Ince
    Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 19950
    MCDB105 Cell Applications Inc. 117-500
    FBS-heat inactivated GIBCO, by Life Technologies 10082
    Pen-Strep GIBCO, by Life Technologies 15070
    96 well plates Corning 3799
    Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) Sigma-Aldrich 192066-25G For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH
    EtOH Pharmco-AAPER 111ACS200 Dilute to 95% in dH20
    Cell culture hood Nuaire NU-425-300
    Tissue culture incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. 3110
    incubator for poly-HEMA plates Labline Instruments Imperial III 305
    Tabletop centrifuge Heraeus Instruments 75003429/01
    6 well glass-bottom dish MatTek Corp. P06G-1.5-20-F
    Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG
    PBS Cellgro 21-040-CV
    Microscope Nikon Instruments Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System
    Lens Nikon Instruments 20X-0.75 numerical apeture
    Halogen transilluminator Nikon Instruments 0.52 NA long working distance condenser
    Excitation and emission filters Chroma Technology Corp. GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
    Transmitted and Epifluoresce light path Sutter Instrument Co. Smart Shutters
    Linear-encoded motorized stage Nikon Instruments
    Cooled charged-coupled device camera Hamamatsu Corp. ORCA-AG
    Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control Custom Made
    Vibration isolation table TMC
    NIS-Elements software Nikon Instruments Version 3

    References

    1. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249, doi:caac.20006 [pii] 10.3322/caac.20006 (2009).
    2. Ries, L.G, Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D.G., Howlader, N., Horner, M.J., Mariotto, A., Miller, B.A., Feuer, E.J., Altekruse, S.F., Lewis, D.R., Clegg, L., Eisner, M.P., Reichman, M., & Edwards, B.K. In http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 National Cancer Institute. Bethesda, MD, (2007).
    3. Burleson, K.M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181, doi:10.1016/j.ygyno.2003.12.034 [pii] S0090825803009508 (2004).
    4. Birbeck, M.S. & Wheatley, D.N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
    5. Witz, C.A., Monotoya-Rodriguez, I.A., & Schenken, R.S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60, [pii] S0015028298004002 (1999).
    6. Zhang, X.Y., et al. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340, [pii] S1071-5576(99)00040-4 (1999).
    7. Kenny, H.A., Nieman, K.M., Mitra, A.K., & Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
    8. Niedbala, M.J., Crickard, K., & Bernacki, R.J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
    9. Kenny, H.A., Krausz, T., Yamada, S.D., & Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472, doi:10.1002/ijc.22874 (2007).
    10. Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240, doi: 10.2353/ajpath.2009.080613 [pii] S0002-9440(10)60982-0 (2009).
    11. Burleson, K.M., Boente, M.P., Pambuccian, S.E., & Skubitz, A.P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6, doi: 10.1186/1479-5876-4-6 [pii] 1479-5876-4-6 (2006).
    12. Heyman, L., et al. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244, doi: 10.1159/000152941 [pii] 000152941 (2008).
    13. Heyman, L., et al. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502, doi:10.1042/CBI20090331 [pii] CBI20090331(2010).
    14. Lessan, K., Aguiar, D.J., Oegema, T., Siebenson, L., & Skubitz, A.P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537, [pii] S0002-9440(10)65406-5 (1999).
    15. Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., & Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488, doi: 10.1016/j.cellbi.2005.01.008 [pii] S1065-6995(05)00048-X (2005).
    16. Leroy-Dudal, J., et al. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543, doi:10.1002/ijc.20778 (2005).
    17. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
    18. Folkman, J. & Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
    19. Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R.T., & Lancaster, W.D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
    20. Roberts, P.C., et al. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
    21. Okada, T., Okuno, H., & Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
    22. Zervantonakis, I.K., Kothapalli, C.R., Chung, S., Sudo, R., & Kamm, R.D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406, doi:10.1063/1.3553237 (2011).
    23. Brandt, B., et al. 3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395, doi: 10.1016/j.semcancer.2005.06.006 [pii] S1044-579X(05)00039-8 (2005).
    24. Condeelis, J. & Segall, J.E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930, doi:10.1038/nrc1231 [pii] ncr1231 (2003).
    25. Dai, J., Ting-Beall, H.P., Hochmuth, R.M., Sheetz, M.P., & Titus, M.A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
    26. Laferriere, J., Houle, F., Taher, M.M., Valerie, K., & Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772, doi:10.1074/jbc.M008564200 [pii] M008564200 (2001).
    27. Dong, C., Slattery, M.J., Rank, B.M., & You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter