In vitro mesothelial Avslutande analys att modeller de tidiga stegen av äggstockscancer Metastasis

1. Äggstockscancer Cell sfäroid Formation

1. RFP-uttryckande äggstockscancer celler odlas i 10%-basmedium (en anpassad cellodlingsmedium innehållande en 50:50 blandning av 199 och MCDB105, 10% fetalt bovint serum och 1% pen-strep). Att uttrycka RFP i omärkta ovariala cancerceller, transfektera cellerna med en plasmid innehållande RFP och selektera för celler som uttrycker RFP. Alternativt kan virala vektorer användas för att transient uttrycka fluorescerande proteiner eller celler kan för-inkubera med en röd fluorescerande celler spårnings-färgämne (Invitrogen).
2. Innan formning av sfäroider äggstockscancer, är det nödvändigt att utarbeta lågvidhäftände 96 och rund rätter botten kultur. För att producera de lågvidhäftände odlingsplattor, 30 pl poly-HEMA (6 mg polyhydroxietylmetakrylat i 1 ml 95% EtOH) tillsätts till varje brunn i en 96 brunn Corning cellodlingsskål. Plattorna med 96 brunnar, inkuberas i en 37 ° C icke-fuktad inkubator för att avdunsta etanol, leaving en film av poly-HEMA på varje brunn. Denna poly-HEMA filmen förhindrar celler från att fästa till botten av brunnen, vilket tvingar cellerna att växa i suspension ^18. [Alternativt kan Ultra-Low Attachment odlingsplattor (Corning) användas i stället för poly-HEMA belagda skålar.]
3. Efter att de lågvidhäftande odlingsplattor framställes, Trypsinisera en platta av äggstockscancerceller och pelletera cellerna i en bordscentrifug (Heraeus) vid 900 RCF i 3 minuter, Sug av supematanten och återsuspendera i 10%-basmedium.
4. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer.
5. Justera koncentrationen av celler så att det finns 100 celler per 50 ^ 10% basmedium.
6. Tillsätt 50 pl av den likformigt suspenderade utspädda cellsuspensionen till varje brunn i 96 brunn poly-HEMA belagda odlingsskål.
7. Inkubera plattan med 96 brunnar i en 37 ° C cellkultur inkubator under 16 timmar (denna tid ökas eller minskas beroende på den tid det tar fören speciell cellinje för att bilda flercelliga sfäroider eller önskade experimentella förhållanden) för att tillåta de ovariala cancerceller till klunga ihop och bildar en enda multicellulär sfäroid i varje brunn. Vissa tumörceller kan genomgå apoptos under denna period, så det är viktigt att välja en tid före induktion av apoptos.

2. Mesotelcell monoskikt Bildning

1. I en cellodling huv, förbeläggning av brunnarna i en 6-brunnars glasbottnade MatTek skålen med fibronektin genom tillsats av 2 ml 5 pg ett fibronektin / ml PBS-lösning till varje brunn i plattan och inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter. Den optiska kvaliteten på glas-bottoms i Mattek rätter möjliggöra högupplösta mikroskopisk avbildning.
2. GFP-uttryckande mesotelceller odlas i 10%-basmedium. Trypsinisera en platta av mesotelceller, centrifugera ner i en bordscentrifug (Heraeus) vid 900RPM under 3 minuter, aspirera supernatanten, och återsuspendera i 10%-basmedium. Denmesotelceller som används här redan uttrycker GFP då de erhölls utan omärkta mesotelceller kan framställas genom att transfektera med en plasmid innehållande GFP-cDNA, eller förinkubering av cellerna i en grönfluorescerande celler spårnings-färgämne (Invitrogen).
3. Efter 30-minuters fibronektin inkubation (i steg 2,1), tvätta brunnarna i MatTek skålen med 2 ml PBS.
4. Aspirera PBS och plattan 6 x 10 ⁵ mesotelcell per brunn i varje brunn i 6-brunnars MatTek skålen. Inkubera MatTek skålen i en 37 ° C cellodling inkubator över natten för att låta mesotelcellerna att fästa skålen och bilda ett monolager.

3. Mesotelcell Clearance analys

1. Använd en pipett för att samla in sfäroiderna äggstockscancer från 96 brunnar poly-HEMA plåt.
2. Aspirera mediet från en brunn av 6 väl MatTek skål innehållande en mesotelcell monolager. Tvätta en gång med 2 ml PBS. Lägga till alla sfäroiderna från 96-psent att en brunn på MatTek skålen (~ 3x antalet sfäroider som kommer att avbildas till svars för sfäroider landning på den del av skålen som inte kan avbildas).
3. Placera MatTek skålen på scenen av en omvänd widefield fluorescensmikroskop kan utföra time-lapse avbildning för minst 8 timmar. Använd en motordriven steg för bild flera positioner i skålen, med flera sfäroida interkalering evenemang, i ett enda experiment. Vi använder en Nikon Ti-E Inverterad Motoriserad Widefield Fluorescens time-lapse mikroskop med inbyggd Perfect Focus System och låg [20x-0,75 numerisk apertur (NA)] förstoring / NA differential interferens kontrast (DIC) optik, en Nikon halogen transilluminator med 0,52 NA långa arbetsavstånd (LWD) kondensor, Nikon snabbt (<100-millisekund byta tid) excitations-och utsläpp filter (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter snabbt överförs och epifluorescens ljusstrålen Smart Shutgor, en Nikon linjär kodad motoriserad scen, en Hamamatsu ORCA-AG kyls charge-coupled device (CCD) kamera, en specialbyggd mikroskop inkubationskammaren med temperatur och CO ₂ kontroll Nikon NIS-element AR version 3, och en TMC vibrationsisolering bord.
4. De äggstockscancer celler sfäroiderna kommer sjunka till botten av skålen och fäster vid mesotelcellen monoskiktet. Samla GFP, RFP och bilder fas av 20 + sfäroida / cellslager interaktioner, var 10 minuter för 8 timmar.
5. RFP-uttryckande ovariala cancercell-sfäroider kommer att invadera i GFP-uttryckande mesotelcell monoskikt skapa ett hål i monolagret. Efter 8 timmar mäta storleken på de hål genom att spåra de svarta hål i GFP bilder med användning Elements (eller annan lämplig mjukvara, såsom bild J). Normalisera den hålstorlek som den initiala sfäroid storlek genom att dividera hålstorlek vid 8 timmar efter storleken av sfäroiden i motsvarande RFP bilden vid tidpunkten noll. I detta exgott var hålstorlek endast mäts en gång, men det kan mätas flera gånger under åtta timmars försöket att bättre förstå dynamiken i interkalering.

4. Representativa resultat

I detta exempel jämförde vi mesotelceller clearance förmåga OVCA433 cell äggstockscancer sfäroider som har försvagade expression av talin-1 för att styra OVCA433 sfäroider. OVCA433 sfäroider från varje grupp sattes till en MatTek skål innehållande ZT mesotelceller cellmonoskikt. Sex sfäroider från varje grupp avbildades var 10 minuter för åtta timmar (Figur 4, Film 3, Film 4). Hålen som produceras i monoskikt av spridningskretsarna sfäroiderna mättes och sex positioner från varje grupp beräknades. Figur 4 visar att den genomsnittliga clearance område som uppstår genom talin 1 knockdown sfäroiderna var betydligt mindre än den genomsnittliga område som uppstår genom kontroll sfäroiderna, vilket antyder att Talin krävs för mesothelial godkännande av OVCA433 äggstockscancer sfäroider.

Figur 1. Ovarian Cancer Metastasis. Primära äggstockstumörer utveckla antingen från äggstockar ytepitelet eller äggledarna. Tumörceller eller kluster bryta bort från den primära tumören och uppsamlas i den peritoneala kaviteten. Tumörceller kan sedan aggregera för att bilda flercelliga sfäroider. Sfäroiderna fästa sedan till mesotel cellmonoskikten bekläder den peritoneala kaviteten. Mesotelcellerna utesluts från undersidan av bifogade äggstockscancer sfäroid, vilket tillåter de sfäroider för att få tillgång till det underliggande basalmembranet.

Film 1. Äggstockscancer metastaser. Klicka här för att se filmen .

Figur 2.

Figur 3. Mesotelceller Clearance-analys. Äggstockscancer sfäroider bildas genom inkubering av 100 RFP-uttryckande äggstockscancerceller per brunn i en poly-HEMA belagda 96-brunnars rundbottnad odlingsskål vid 37 ° C under 16 timmar. Poly-HEMA hindrar cellerna från att fästa vid odlingsskålen, vilket tillåter celler att förbli i suspension och vidhäftar till varandra för att bilda en enda grupp per brunn. Mesotelceller cellmonoskikt framställes genom utstrykning 6x10 ⁵ mesotelcellerna per brunn i en fibronektin belagd 6 väl MatTek skål och inkubering av plattan vid 37 ° C under 16 timmar. Sfäroiderna överförs sedan till den MatTek skålen med mesotelceller monoskiktet och de två cellpopulationerna avbildas var 10 minuter under 8 timmar med användning av en Nikon Ti-E Inverted Motoriserad Widefield Fluorescens time-lapse mikroskop och Elements.

Film 2. Mesothelial Clearance Analys. Klicka här för att se filmen .

Figur 4. Dämpning av Talin 1 uttryck i OVCA433 sfäroiderna minskar mesothelial clearance förmåga. OVCA433 sfäroider (röd) med och utan försvagade uttryck för Talin 1 fick fästa till och invadera in i en ZT mesothelial monolager (grön). De två cellpopulationer, försågs med bild var 10 minut under 8 timmar med användning av en Nikon Ti-E Inverterad motoriserad Widefield Fluorescens tidsförlopp mikroskop och element mjukvara. Diagrammet visar att Talin 1 dämpningsignifikant minskar mesotelcell clearance (kvantil tomt med gröna staplar på medel).

Film 3. Kontroll OVCA433 sfäroider (röd) invaderande till en mesothelial monolager (grön). Klicka här för att se filmen .

Movie 4. Dämpning av Talin 1 uttryck i OVCA433 sfäroider (röd) minskar mesothelial (grön) clearance förmåga. Klicka här för att se filmen .

Den "mesothelial Clearance Assay" presenteras här använder time-lapse mikroskopi för att övervaka samspelet mellan flercelliga äggstockscancer sfäroiderna och mesothelial monoskikt cell, i stor rumslig och temporal detalj. Tidigare hade flera grupper ^8-14 används för endpoint analyser för att visa att äggstockscancer cancerceller fäster till och invadera in i mesothelial cellmonoskikt. Denna analys är unik genom att den använder fluorescensmärkta celler för att skilja tumörceller från mesotelceller, så att dynamiken hos dessa två cellpopulationer kan övervakas under hela analysen. Förfarandet enligt interkalering kan visualiseras i realtid och hastigheten för clearance mesotelceller kan mätas kvantitativt med tiden. Användningen av timelapse mikroskopi gör det möjligt att noggrant övervaka dynamiken i samspelet mellan de båda cellpopulationerna under olika experimentella betingelser. Dessutom, en liten andel av antingen mesotelceller eller äggstockscancer ceLLS kan märkas med en tredje fluorescerande markör för att övervaka dynamiken i enskilda celler i befolkningen. Genom att spåra individuella celler under en tid, kan den riktverkan och hastigheten för migreringen beräknas. Att utföra högupplösta analyser av mesotelceller clearance kan total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi användas. Om fokala sammanväxningar är märkta i mesotelceller, kan dissociationen av mesotelceller från adhesioner utskjutande förlängningar av tumörceller övervakas, såsom beskrivs i vår tidigare publikation ^17.

Denna analys kan användas för att jämföra invasionen förmåga cell äggstockscancer sfäroider som har blivit genetiskt eller farmakologiskt modifierade för att belysa de molekylära mekanismer genom vilka ovariala cancercell-sfäroider rensa mesotelceller monoskikt eller för att identifiera småmolekylära hämmare av processen. Dessutom kräver analysen ett mycket litet antal celler äggstockscancer, så primära tumor-celler från flytande utsöndringar kan användas (se begränsningar nedan) om märkt genom förinkubering av cellerna med cytotracker färgämnen (Invitrogen). Analysen är också mottagliga för hög genomströmning analys. Att utföra hög genomströmning genetiska eller farmakologiska studier, kan de ovariala cancerceller transfekteras med olika siRNA vektorer eller behandlas med olika farmakologiska hämmare i varje brunn i 96-brunnars platta. Mesotelceller cellmonoskikt kan pläteras i 96-brunnars glasbottnade odlingsskålar, och sfäroiderna kan överföras 01:01 från poly-HEMA-belagda plattor med monoskikt-innehållande plattor. Alla dessa steg kan optimeras för användning med screening robotar så att hundratals siRNA eller hämmare kan screenas på en gång.

En av styrkorna med denna analys är att kunna modellera den kraft-beroende interkalering av äggstockscancer celler i mesothelial monoskiktet. Vårt laboratorium används mikroskopi dragkraft (TFM) för att avgöra om mekanisk foRCE reglerar mesothelial clearance ^17. Vi fann att överuttryck av α5 integrin ökade kontraktilitet av celler placerades på ett fibronektin-substratet, medan RNAi-medierad knockdown i Talin, eller myosin II minskad cellen kontraktilitet ^17. Sedan nedreglering av α5 integrin, Talin eller myosin II i cellen ovarialcancer sfäroiderna också minskat mesothelial clearance, våra TFM mätningar stödjer idén att mesothelial clearance i en händelse beror på cellulära sammandragande krafter, i vilka celler med högre sammandragande krafter som orsakas större mesothelial clearance. Därför kan mesothelial clearance analysen kan användas för att ytterligare förstå interkalering händelser, i samband med ovariell sfäroid metastaser, som är beroende av mekaniska krafter.

Denna analys har några begränsningar att tänka på. Först, för att bilda de flercelliga sfäroider, måste cellerna odlas i suspension i minst 6 timmar. Omcellerna inte kan överleva utan matrix kontakta clearance förmåga kommer att äventyras. För det andra är det fördelaktigt att använda äggstockscancerceller som bildar en enhetlig och kompakta flercelliga sfäroider. Om äggstockscancer cancercellerna bara bilda lösa kluster, kan de bryta isär i överföringen från polyHEMA-belagda plattan skålen innehåller mesothelial monoskiktet skapa sfäroider i olika former och storlekar som kommer att lägga variabilitet till data. Tredje, om de använda cellerna är heterogena, kommer detta lägga till ytterligare variation av storlekar av hålen som skapats i monolagret. Det är viktigt att använda flera replikatbrunnar (10-20/sample) på grund av variabiliteten i omfattningen av interkalation efter åtta timmar. I de analyser som beskrivs här, var väletablerad äggstockscancer (OVCA433) och mesotelceller (ZT)-cellinjer användas. För att göra denna analys mer kliniskt relevant, kan primära ovariala cancerceller, från ascitesvätska av patienter, kan användas. Det skulle vara intressant att determine om det in vitro mesotelcell clearance förmågan korrelerar med kliniska utfallet. Begränsningarna ovan är särskilt viktigt att tänka på när du använder primära prover som antalet primära celler som finns är en begränsande faktor. Dessutom är det viktigt att kontrollera integriteten i mesothelial monoskiktet innan du utför denna analys. Mesothelial enkelskikt kan fastställas och färgas för cell-cell junction proteiner för att se till att mesotelcell korsningar är intakta.

Slutligen kan mesothelial clearance analysen lätt modifieras för att svara på specifika experimentella frågor. Här har vi använt fibronektin som ECM-komponent som låter äggstocks-och meso-celler att vidhäfta till de glasbottnade odlingsskålar, emellertid kan andra ECM-komponenter användas, inklusive kollagen och laminin. Vidare kan andra celltyper som finns i basalmembranet, inklusive fibroblaster, sättas till detta experimentella system, för att bedöma rollenDessa typer av celler i mesotelceller clearance ^9,19,20. Slutligen kan interaktioner mellan andra typer av tumörceller (t ex pankreas-, bröst-, etc) med mesotelceller också modelleras med användning av denna analys. Och det är möjligt att studera växelverkan mellan cancerceller och en endoteliala monoskiktet, med användning av denna analys, för att efterlikna intravasering eller extravasering (Liknande analyser har beskrivits i: ^{15,16,21-27).}