In vitro mesothelial Clearance Assay at modeller av de tidlige trinnene på eggstokkreft Metastase

1. Ovarian Cancer Cell Spheroid Formation

1. RFP-uttrykke eggstokkreft celler dyrkes i 10% Base Medium (et egendefinert celle kultur medium med en 50:50 blanding av 199 og MCDB105, 10% inaktivert fosterutvikling bovint serum og 1% penn-strep). For å uttrykke RFP i umerkede eggstokkreft celler, transfektere cellene med et plasmid som inneholder RFP og velg for celler som uttrykker RFP. Alternativt kan virale vektorer brukes til midlertidig uttrykke fluorescerende proteiner, eller cellene kan være pre-inkuber med en rød fluorescerende celle tracker fargestoff (Invitrogen).
2. Før dannelsen av eggstokkreft spheroids, er det nødvendig å forberede lav adhesjon 96 vel rund bunn kultur retter. Å produsere de lave vedheft kultur plater, 30μl poly-HEMA (6mg polyhydroxyethylmethacrylate i 1 ml 95% EtOH) løsning er lagt til hver brønn av en 96 brønn Corning cellekultur parabolen. De 96 brønners plater inkuberes i en 37 ° C ikke-fuktet inkubator å fordampe etanol, leaving en film av poly-HEMA på hver brønn. Dette poly-HEMA film hindrer cellene fester seg til bunnen av brønnen, tvinger cellene til å vokse i suspensjon ^18. [Alternativt kan Ultra-Low vedlegg kultur plater Corning) benyttes i stedet for poly-Hema belagt retter.]
3. Etter lav-vedheft kultur plater er forberedt, trypsinize en plate av eggstokkreft celler, pelletskaminer cellene i en tabletop sentrifuge (Heraeus) på 900 RCF i 3 minutter, Aspirer supernatanten og re-suspendere i 10% Base Medium.
4. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
5. Juster konsentrasjonen av cellene slik at det er 100 celler per 50μl på 10% Base Medium.
6. Legg 50μl av jevnt suspendert utvannet cellesuspensjon til hver brønn på 96 godt poly-HEMA belagt kultur parabolen.
7. Inkuber plate med 96 brønner i en 37 ° C cellekultur inkubator for 16 timer (denne tiden bør økes eller reduseres avhengig av hvor lang tid det tar foren bestemt cellelinje for å danne flercellede spheroids eller ønskede eksperimentelle betingelser) for å tillate eggstokkreft celler til å klynge sammen og danner en enkelt flercellet sfæriske legemet i hver brønn. Noen kreftceller kan gjennomgå apoptose i denne perioden, så det er viktig å velge en tid før induksjon av apoptose.

2. Mesothelial Cell Monolayer Formation

1. I en celle kultur hette, pre-coat brønnene til en 6 godt glass-bunn Mattek tallerken med fibronectin ved å legge 2ml av en 5μg fibronectin / mL PBS løsning til hver brønn av fatet og ruger ved romtemperatur i 30 minutter. Den optiske kvaliteten på glass-bunner i Mattek retter mulighet for høy oppløsning mikroskopisk bildebehandling.
2. GFP-uttrykke mesothelial celler dyrkes i 10% Base Medium. Trypsinize en plate av mesothelial celler, spinner ned i en tabletop sentrifuge (Heraeus) ved 900RPM i 3 minutter, aspirer supernatanten, og re-suspendere i 10% Base Medium. Detmesothelial celler er brukt her var allerede uttrykker GFP da de ble innhentet, men umerkede mesothelial celler kan produseres av transfecting med et plasmid som inneholder GFP cDNA, eller preincubating cellene i en grønn fluorescerende celle tracker fargestoff (Invitrogen).
3. Etter 30 minutters fibronectin inkubering (i trinn 2.1), vaske brønner på Mattek fatet med 2ml PBS.
4. Aspirer PBS og platen 6 x10 ⁵ mesothelial celle per brønn i hver brønn på 6 brønnen Mattek parabolen. Inkuber Mattek fatet i en 37 ° C cellekultur inkubator natten for å tillate mesothelial cellene til å feste til parabol og danne en monolayer.

3. Mesothelial Cell Clearance Assay

1. Bruk en pipette til å samle eggstokkreft spheroids fra 96 ​​brønner poly-HEMA belagt plate.
2. Aspirer medium fra en brønn på 6 brønnen Mattek parabolen inneholder en mesothelial celle monolayer. Vask straks med 2ml PBS. Legg alle spheroids fra 96 ​​brønner psent til en brønn av Mattek fatet (~ 3x antallet spheroids som skal bli fotografert på kontoen for spheroids landing på den delen av fatet som ikke kan avbildes).
3. Plasser Mattek fatet på scenen av en invertert widefield fluorescens mikroskop stand til å utføre time-lapse imaging for varigheten på minst 8 timer. Bruk en motorisert scene å avbilde flere stillinger i fatet, med flere Spheroid intercalation hendelser, i en enkelt eksperiment. Vi bruker et Nikon Ti-E Inverted Motorisert Widefield Fluorescence time-lapse mikroskop med integrert Perfect Focus System og lav [20x-0,75 numerisk apertur (NA)] forstørrelse / NA differensiallikninger interferens kontrast (DIC) optikk, en Nikon halogen transilluminator med 0,52 NA lang arbeidsavstand (LWD) kondensator, Nikon rask (<100 millisekund switching tid) eksitasjon og emisjon filtre (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter rask overførbare og epifluorescence lysbanen Smart Shutregistre, en Nikon lineær-kodet motorisert scene, en Hamamatsu ORCA-AG avkjølt charge-coupled device (CCD) kamera, en spesialbygd mikroskop inkubasjon kammer med temperatur og CO ₂ kontroll, Nikon NIS-Elements AR programvare versjon 3, og en TMC vibrasjonsisolering tabellen.
4. De eggstokkreft cellen spheroids vil bosette til bunnen av fatet og fester seg til mesothelial cellen monolayer. Samle GFP, RFP og fase bilder av 20 + Spheroid / monolayer samspill, hvert 10. minutt, etter 8 timer.
5. De RFP-uttrykker eggstokkreft celle spheroids vil invadere til GFP-uttrykke mesothelial celle monolayer skape et hull i monolayer. Etter 8 timer, måle størrelsen på hullene ved å trekke de svarte hullene i GFP bildene ved hjelp Elements programvare (eller en annen egnet programvare, for eksempel bilde J). Normaliser hullet størrelsen til den opprinnelige sfæriske legemet størrelsen ved å dele hullet størrelse på 8 timer av størrelsen det sfæriske legemet i tilsvarende RFP bildet på tidspunktet null. I denne exrikelig, ble hullet størrelse bare målt en gang, men det kan måles flere ganger i løpet av åtte timers forsøket til bedre forstå dynamikken i intercalation.

4. Representative Resultater

I dette eksempelet, sammenlignet vi mesothelial clearance evne OVCA433 eggstokkreft celle spheroids som har svekket uttrykk for talin-1 for å kontrollere OVCA433 spheroids. OVCA433 spheroids fra hver gruppe ble lagt til en Mattek tallerken inneholder ZT mesothelial celle monolayers. Seks spheroids fra hver gruppe ble fotografert hvert 10. minutt for åtte timer (figur 4, Movie 3, Movie 4). Hullene som produseres i monolayer ved sprer spheroids ble målt og seks stillinger fra hver gruppe ble i gjennomsnitt. Figur 4 viser at den gjennomsnittlige avstanden området opprettet av talin 1 knockdown spheroids var betydelig mindre enn gjennomsnittet området skapt av kontroll spheroids, noe som tyder på at talin kreves for mesothelial klarering av OVCA433 eggstokkreft spheroids.

Figur 1. Ovarian kreft metastasering. Primære ovarietumorer utvikle enten fra eggstokkene overflaten epitelet eller egglederne. Kreftceller / klynger løsner fra den primære svulsten og samle seg i bukhulen. Kreftceller kan deretter aggregere å danne flercellede spheroids. Spheroids deretter legge til mesothelial celle monolayers langs bukhulen. Mesothelial cellene er ekskludert fra undersiden av vedlagte eggstokkreft sfæriske legemet, slik at spheroids å få tilgang til den underliggende basalmembranen.

Movie 1. Ovarian kreft metastasering. Klikk her for å vise film .

Figur 2.

Figur 3. Mesothelial Clearance Assay. Eggstokkreft spheroids er dannet ved å inkubere 100 RFP-uttrykke eggstokkreft celler per brønn i en poly-HEMA belagt 96 vel rund bunn kultur tallerken ved 37 ° C i 16 timer. Poly-HEMA hindrer cellene fra fester til kulturen fatet, slik at cellene til å forbli i suspensjon, og holder seg til hverandre for å danne en enkelt klynge per brønn. Mesothelial celle monolayers er utarbeidet av platekledning 6x10 ⁵ mesothelial celler per brønn i en fibronectin belagt seks godt Mattek rett og ruger platen ved 37 ° C i 16 timer. De spheroids blir deretter overført til Mattek fatet med mesothelial monolayer og de to celle populasjoner blir fotografert hver 10 minutter til 8 timer med en Nikon Ti-E jegnverted Motorisert Widefield Fluorescence time-lapse mikroskop og Elements programvare.

Movie 2. Mesothelial Clearance Assay. Klikk her for å vise film .

Figur 4. Dempning av talin en uttrykk i OVCA433 spheroids avtar mesothelial klarering evne. OVCA433 spheroids (rød) med og uten dempes uttrykk for talin en fikk lov til å feste til og invadere inn en ZT mesothelial monolayer (grønn). De to celle populasjoner ble fotografert hvert 10. minutt for 8 timer med en Nikon Ti-E Inverted Motorisert Widefield Fluorescence time-lapse mikroskop og elementer programvare. Grafen viser at talin en dempingbetydelig redusert mesothelial celle clearance (kvantilregresjoner tomt med grønne striper på midler).

Movie 3. Kontroll OVCA433 spheroids (rød) invaderer inn en mesothelial monolayer (grønn). Klikk her for å vise film .

Movie 4. Dempning av talin en uttrykk i OVCA433 spheroids (rød) reduseres mesothelial (grønn) klaring evne. Klikk her for å vise film .

Den "mesothelial Clearance Assay" presenteres her bruker time-lapse mikroskop for å overvåke interaksjoner av eggstokkreft flercellede spheroids og mesothelial celle monolayers, i stor romlig og tidsmessig detalj. Tidligere hadde flere grupper ^8-14 brukes endepunkt analyser å vise at eggstokkreft celler feste til og invadere inn mesothelial celle monolayers. Denne analysen er unik i at den bruker fluorescensmerkede celler å skille kreftceller fra mesothelial celler, slik at dynamikken i disse to celle populasjoner kan overvåkes hele analysen. Prosessen intercalation kan visualiseres i sanntid og frekvensen av mesothelial klarering kan kvantitativt måles over tid. Bruken av timelapse mikroskopi gjør det mulig å nøye overvåke dynamikken i samspillet mellom de to celle populasjoner under forskjellige eksperimentelle forhold. I tillegg en liten prosentandel av enten mesothelial celler eller eggstokkreft ceLLS kan merkes med en tredje fluoriserende fargestoff overvåke dynamikken i enkelte celler i befolkningen. Ved å spore individuelle celler over tid, kan den retningen og hastigheten av migrasjon beregnes. For å utføre høyere oppløsning analyser av mesothelial klarering, kan total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi brukes. Hvis fokale sammenvoksninger er merket i mesothelial cellene, kan dissosiasjon fra mesothelial sammenvoksninger ved protrusive utvidelser av kreftceller overvåkes, som beskrevet i vår tidligere publikasjon ^17.

Denne analysen kan brukes til å sammenligne invasjonen evne eggstokkreft celle spheroids som er genetisk eller farmakologisk modifisert for å belyse de molekylære mekanismer som eggstokkreft celle spheroids tømme mesothelial monolayer eller å identifisere små molekyl hemmere av prosessen. Videre krever analysen et svært lite antall eggstokkreft celler, så primær tumor celler fra væske eksudater kan brukes (se begrensninger nedenfor) hvis merket med preincubating cellene med cytotracker fargestoffer (Invitrogen). Analysen er også mottagelig for høy gjennomstrømming analyse. For å utføre høy gjennomstrømning genetiske eller farmakologiske studier, kan de eggstokkreft celler bli tilført med ulike siRNA vektorer eller behandlet med ulike farmakologiske hemmere i hver brønn på 96-brønnen plate. Mesothelial celle monolayers kan belagt i 96 vel glassbunn kultur retter, og spheroids kan overføres 01:01 fra poly-Hema belagte plater til de monolayer-holdige plater. Alle disse trinnene kan være optimalisert for bruk med screening roboter slik at hundrevis av siRNAs eller hemmere kan screenes på en gang.

En av styrkene til denne analysen er å kunne modellere kraft-avhengig intercalation av eggstokkreft celler i mesothelial monolayer. Laboratoriet brukes trekkraft mikroskopi (TFM) å bestemme om mekanisk FORCE regulerer mesothelial clearance ^17. Vi fant at overuttrykte α5 integrin økt kontraktilitet av celler belagt på en fibronectin-belagt substrat, mens RNAi-mediert knockdown av talin, eller myosin II redusert celle kontraktilitet ^17. Siden downregulation av α5 integrin, talin, eller myosin II i ovarian kreft celle spheroids også redusert mesothelial clearance, våre TFM målinger støtter ideen om at mesothelial klarering i en hendelse avhengig mobilnettet kontraktile krefter, i hvilke celler med høyere kontraktile krefter forårsaket større mesothelial klaring. Derfor kan mesothelial klarering analysen brukes til å ytterligere forstå intercalation hendelser, knyttet til ovarial sfæriske legemet metastasering, som er avhengige av mekaniske krefter.

Denne analysen har noen begrensninger for å vurdere. Først, for å danne de flercellede spheroids, må cellene dyrkes i suspensjon i minst 6 timer. Dersomcellene ikke klarer å overleve uten matrise kontakte sin klarering evne vil bli kompromittert. For det andre er det en fordel å bruke eggstokkreft celler som danner uniform, kompakte flercellede spheroids. Hvis eggstokkreft celler bare danne løse klynger, kan de bryte fra hverandre i overføringen fra polyHEMA-belagt plate til fatet inneholder mesothelial monolayer, skaper spheroids av forskjellige former og størrelser som vil legge variasjon til dataene. Tredje, hvis cellene som brukes er heterogene, vil dette legge ytterligere variasjon i størrelsene på hull skapt i monolayer. Det er viktig å bruke flere replikatmålinger brønner (10-20/sample) på grunn av variasjon i omfanget av intercalation etter åtte timer. I de analysene som er beskrevet her, var veletablert eggstokkreft (OVCA433) og mesothelial (ZT) cellelinjer som brukes. For å gjøre denne analysen mer klinisk relevant, kan primære eggstokkreft celler, fra ascites væske av pasienter, skal brukes. Det ville være interessant å determIne om in vitro mesothelial celle clearance evne korrelerer med klinisk utfall. Begrensningene ovenfor er spesielt viktig å vurdere når du bruker primære prøver, som antall primærsøkere celler tilgjengelig er en begrensende faktor. I tillegg er det viktig å sjekke integriteten til mesothelial monolayer før du utfører denne analysen. Den mesothelial monolayer kan festes og farges for celle-celle krysset proteiner for å sikre at mesothelial celle veikryss er intakt.

Endelig kan det mesothelial klarering analysen enkelt endres til å svare på konkrete eksperimentelle spørsmål. Her brukte vi fibronectin som ECM-komponenten som gjør at eggstokkene og mesothelial celler til å følge de glassbunn kultur retter, derimot, kan andre ECM komponenter brukes herunder kollagen og laminin. Videre kan andre celletyper som er funnet under basalmembranen, inkludert fibroblaster, legges til denne eksperimentelle systemet, for å vurdere rolleav disse celletypene i mesothelial clearance ^9,19,20. Til slutt kan interaksjoner med andre typer kreftceller (f.eks bukspyttkjertelen, bryst, etc) med mesothelial celler også bli modellert ved hjelp av denne analysen. Og det er mulig å studere samspillet mellom kreftceller og en endotelial monolayer, bruker denne analysen, for å etterligne intravasation eller bloduttredelse (Lignende analyser er beskrevet i: ^{15,16,21-27).}