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 JoVE Clinical and Translational Medicine

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

1, 1, 1

1Department of Cell Biology, Harvard Medical School

Article
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    Summary

    Il saggio di liquidazione mesoteliali qui descritto si avvale di cellule fluorescente e microscopia time-lapse video visualizzare e misurare quantitativamente le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico.

    Date Published: 2/17/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3888

    Cite this Article

    Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (60), e3888, doi:10.3791/3888 (2012).

    Abstract

    Il cancro ovarico è la quinta causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti 1. Nonostante un iniziale risposta positiva alle terapie, da 70 a 90 per cento delle donne con tumore ovarico sviluppare nuove metastasi, e la ricorrenza è spesso fatale 2. Si tratta, quindi, necessario capire come metastasi secondarie sorgono al fine di sviluppare migliori trattamenti per il cancro fase intermedia e tardiva dell'ovaio. Metastasi del cancro ovarico si verifica quando le cellule maligne si staccano dal tumore primario e diffondere in tutta la cavità peritoneale. Le cellule diffusi possono formare aggregati multicellulari, o sferoidi, che uno rimanga unattached, o impianto sul organi all'interno della cavità peritoneale 3 (figura 1, film 1).

    Tutti gli organi all'interno della cavità peritoneale sono rivestite con un unico strato continuo di cellule mesoteliali 4-6 (Figura 2). Tuttavia, le cellule mesoteliali sono assenti da sottomasse tumorali peritoneali, come rivelato dagli studi al microscopio elettronico di sezioni umani asportati 3,5-7 tessuto tumorale (Figura 2). Questo suggerisce che le cellule mesoteliali sono esclusi da sotto la massa tumorale da un processo sconosciuto.

    Precedente esperimenti in vitro hanno dimostrato che cellule primarie di cancro ovarico collegare in modo più efficace matrice extracellulare che di cellule mesoteliali 8, e studi più recenti hanno dimostrato che le cellule primarie peritoneali mesoteliali in realtà costituiscono una barriera per l'adesione delle cellule del cancro ovarico e l'invasione (rispetto alla adesione e l'invasione su supporti che non sono stati coperti con le cellule mesoteliali) 9,10. Questo suggerisce che le cellule mesoteliali fungere da barriera contro il cancro ovarico metastasi. I meccanismi cellulari e molecolari con cui le cellule del cancro ovarico violare questa barriera, ed escludere il mesotelio hanno, fino a poco tempo, è rimasto sconosciuto.

    Qui si descrive °metodologia e di un test in vitro che modella l'interazione tra sferoidi di cellule di cancro ovarico e cellule mesoteliali in vivo (figura 3, Movie 2). Il nostro protocollo è stato adattato da metodi descritti in precedenza per analizzare le interazioni delle cellule tumorali ovariche con monostrati mesoteliali 8-16, ed è stata descritta in un rapporto che mostra che le cellule tumorali ovariche utilizzano un integrina-dipendente l'attivazione della miosina e la forza di trazione per promuovere l'esclusione del cellule mesoteliali da sotto un tumore 17 sferoide. Questo modello si avvale di time-lapse microscopia a fluorescenza per monitorare le due popolazioni cellulari in tempo reale, fornendo informazioni spaziale e temporale sull'interazione. Le cellule del carcinoma ovarico esprimere la proteina fluorescente rossa (RFP), mentre le cellule mesoteliali esprimere la proteina fluorescente verde (GFP). RFP che esprimono sferoidi di cellule di cancro ovarico allegare alla GFP-esprimere monostrato mesoteliali. La diffusione sferoidi, invadere, eforzare le cellule mesoteliali parte creando un foro nel monostrato. Questo foro è visualizzato come lo spazio negativo (nero) nell'immagine GFP L'area del foro può essere misurata per analizzare quantitativamente differenze di attività di gioco tra le popolazioni di controllo e sperimentali di cancro ovarico e / o cellule mesoteliali. Questo saggio necessita soltanto un piccolo numero di cellule di cancro ovarico (100 cellule per sferoidali X 20-30 sferoidi per condizione), quindi è possibile eseguire questo saggio con preziosi campioni di cellule del tumore primario. Inoltre, questa analisi può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

    Protocol

    1. Ovarian Cancer Cell Formazione Spheroid

    1. RFP-esprimono cellule di cancro ovarico vengono coltivate in terreno di base 10% (una consuetudine mezzo di coltura cellulare contenente una miscela 50:50 di 199 e MCDB105, 10% siero fetale bovino inattivato e 1% pen-strep). Per esprimere RFP in cellule non marcate cancro ovarico, trasfettare le cellule con un plasmide contenente RFP e per selezionare cellule esprimenti RFP. In alternativa, vettori virali possono essere usati per esprimere transitoriamente proteine ​​fluorescenti, o le cellule possono essere pre-incubare con fluorescente rossa cella inseguitore colorante (Invitrogen).
    2. Prima di formare sferoidi di cancro ovarico, è necessario preparare bassa aderenza e rotonde 96 piastre di coltura fondo. Per produrre i bassa aderenza piastre di coltura, 30μl poli-HEMA (6mg polyhydroxyethylmethacrylate in 1 ml di EtOH 95%) soluzione viene aggiunta a ciascun pozzetto di un pozzo 96 piatto di coltura cellulare Corning. Le piastre a 96 pozzetti vengono incubate a 37 ° C non incubatore umidificato per far evaporare l'etanolo, Leaving una pellicola di poli-HEMA in ciascun pozzetto. Questo poli-HEMA pellicola impedisce alle cellule di attaccarsi al fondo del pozzo, costringendo le cellule a crescere in sospensione 18. [In alternativa, Ultra-Low piastre di coltura Attachment (Corning) può essere usato al posto di piatti rivestiti poly-HEMA.]
    3. Dopo bassa aderenza piastre di coltura vengono preparati, Tripsinizzare una piastra di cellule tumorali ovariche, pellet delle cellule in una centrifuga da tavolo (Heraeus) a 900 RCF per 3 minuti, aspirare il supernatante e risospendere in terreno di base 10%.
    4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
    5. Regolare la concentrazione di tali cellule che ci sono 100 cellule per 50 microlitri di terreno di base 10%.
    6. Aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare diluita uniformemente sospeso in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti poli-HEMA cultura rivestita.
    7. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C incubatore di coltura cellulare per 16 ore (tale quantità di tempo dovrebbe essere aumentata o diminuita a seconda della quantità di tempo necessario peruna linea cellulare particolare per formare sferoidi multicellulari o desiderati condizioni sperimentali) permettere alle cellule del carcinoma ovarico a raggrupparsi, formando un unico sferoide multicellulare in ciascun pozzetto. Alcune cellule tumorali possono apoptosi durante questo periodo, quindi è importante scegliere un momento prima della induzione di apoptosi.

    2. Mesoteliali formazione di cellule monostrato

    1. In una cappa coltura cellulare, pre-rivestimento dei pozzetti di una ben 6 fondo di vetro piatto MatTek con fibronectina aggiungendo 2 ml di fibronectina 5μg / mL di soluzione salina in ogni pozzetto della piastra e incubando a temperatura ambiente per 30 minuti. La qualità ottica dei fondi di vetro in piatti MatTek consentono immagini ad alta risoluzione microscopico.
    2. GFP-esprimono cellule mesoteliali vengono coltivate in terreno di base 10%. Tripsinizzare un piatto di cellule mesoteliali, spin down in una centrifuga da tavolo (Heraeus) a 900RPM per 3 minuti, aspirare il surnatante, e risospendere in terreno di base del 10%. Ilcellule mesoteliali usati qui sono stati già esprimendo GFP quando sono stati ottenuti, ma non marcati cellule mesoteliali può essere prodotto da trasfezione con un plasmide contenente cDNA GFP, o preincubating le cellule in un verde fluorescente cella inseguitore colorante (Invitrogen).
    3. Dopo l'incubazione di 30 minuti fibronectina (in fase 2.1), lavare i pozzetti del piatto MatTek con 2 ml PBS.
    4. Aspirare il PBS e la piastra 6 x10 5 cellule mesoteliali per bene in ciascun pozzetto della piastra ben 6 MatTek. Incubare il piatto MatTek a 37 ° C incubatore per colture cellulare notte per consentire le cellule mesoteliali per collegare al piatto e formano un monostrato.

    3. Mesoteliali cella Assay Clearance

    1. Utilizzare una pipetta per raccogliere gli sferoidi carcinoma ovarico da ben 96 poli-HEMA piastra rivestita.
    2. Aspirare il mezzo da un pozzetto della piastra ben 6 MatTek contenente un monostrato di cellule mesoteliali. Lavare una volta con 2 ml PBS. Aggiungere tutti gli sferoidi dal 96 pozzetti ptardi per un pozzetto della piastra MatTek (~ 3x il numero di sferoidi che stanno per essere ripreso in considerazione per l'atterraggio sferoidi parte del piatto che non può essere ripreso).
    3. Porre la capsula MatTek sul palco di un microscopio invertito widefield a fluorescenza in grado di eseguire time-lapse imaging per la durata di almeno 8 ore. Utilizzare uno stadio motorizzato a posizioni più immagini nel piatto, con più eventi di intercalazione sferoidali, in un singolo esperimento. Usiamo un Ti-E Nikon invertito motorizzato widefield fluorescenza time-lapse microscopio integrato con un sistema di messa a fuoco perfetta e bassa [20x-0.75 apertura numerica (NA)] ingrandimento / NA contrasto differenziale di interferenza (DIC) l'ottica, un transilluminatore alogena Nikon con 0,52 NA lunga distanza di lavoro (LWD) condensatore, Nikon veloce (<100 millisecondi tempo di commutazione), filtri di eccitazione e di emissione (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter veloce trasmessi e epifluorescenza percorso Valvola luce intelligenteTERS, una lineare codificato Nikon stadio motorizzato, un ORCA Hamamatsu-AG raffreddato charge-coupled device (CCD), macchina fotografica, una custom-built camera di incubazione microscopio con la temperatura e CO 2 di controllo, Nikon NIS-Elements AR software versione 3, e un TMC vibrazioni tavolo isolamento.
    4. Gli sferoidi di cellule di cancro ovarico si depositerà sul fondo del piatto e allegare il monostrato cellulare mesoteliali. Raccogliere GFP, RFP e le immagini di fase di 20 + sferoidali / monostrato interazioni, ogni 10 minuti, per 8 ore.
    5. Le RFP che esprimono sferoidi di cellule di cancro ovarico si invadere la GFP che esprimono monostrato di cellule mesoteliali la creazione di un buco nel monostrato. Dopo 8 ore, misurare le dimensioni dei fori tracciando i buchi neri nelle immagini GFP usando software Elements (o un altro software adatto come immagine J). Normalizza le dimensioni del foro alla dimensione iniziale sferoide dividendo la dimensione del foro a 8 ore dalla dimensione dello sferoide nell'immagine RFP corrispondente al tempo zero. In questo exampio, la dimensione del foro è stata misurata una volta sola, ma può essere misurata più volte durante l'esperimento otto ore per comprendere meglio le dinamiche di intercalazione.

    4. Risultati rappresentativi

    In questo esempio, abbiamo confrontato la capacità mesoteliali liquidazione dei OVCA433 sferoidi di cellule di cancro ovarico che hanno attenuato l'espressione della Talin-1 per controllare OVCA433 sferoidi. OVCA433 sferoidi di ciascun gruppo sono stati aggiunti ad un piatto MatTek contenente ZT monostrati di cellule mesoteliali. Sei sferoidi di ogni gruppo sono stati ripresi ogni 10 minuti per otto ore (Figura 4, Movie 3, Movie 4). I fori prodotti nella monostrato dai sferoidi diffusione sono state misurate e sei posizioni di ciascun gruppo sono stati mediati. La figura 4 mostra che l'area di clearance media creato da Talin 1 sferoidi atterramento era significativamente più piccola rispetto alla superficie media creato da sferoidi di controllo, suggerendo che Talin è necessario per la loro liquidazione mesoteliali da OVCA433 carcinoma ovarico sferoidi.

    Figura 1
    Figura 1. Cancer Metastasi ovarica. Tumori ovarici primari sviluppare sia dall'epitelio di superficie ovarico o tube di Falloppio. Le cellule tumorali / cluster staccarsi dal tumore primario e raccogliere nella cavità peritoneale. Le cellule tumorali possono quindi aggregare per formare sferoidi multicellulari. Sferoidi quindi allegare ai monostrati di cellule mesoteliali che rivestono la cavità peritoneale. Le cellule mesoteliali sono esclusi da sotto lo sferoide allegata cancro ovarico, consentendo gli sferoidi di accedere alla membrana basale sottostante.

    Movie 1. Metastasi del cancro ovarico. Clicca qui per vedere il film .

    Figura 2
    Figura 2.

    Figura 3
    Figura 3. Assay Clearance mesoteliali. Sferoidi carcinoma ovarico formate incubando 100 RFP cellule esprimenti carcinoma ovarico per pozzetto in una poli-HEMA rivestita 96 piatto fondo del pozzetto rotondo coltura a 37 ° C per 16 ore. Poly-HEMA impedisce alle cellule di attaccarsi alla piastra di coltura, permettendo alle cellule di rimanere in sospensione e aderire l'una all'altra a formare un unico cluster per pozzetto. Monostrati di cellule mesoteliali sono preparati mediante placcatura 6x10 5 cellule mesoteliali per pozzetto in una fibronectina rivestito 6 ben piatto MatTek e incubando la piastra a 37 ° C per 16 ore. Gli sferoidi sono poi trasferiti al piatto MatTek con il monostrato mesoteliali e le due popolazioni cellulari vengono esposte ogni 10 minuti per 8 ore utilizzando un legame Ti-E Nikon Inverted motorizzato widefield fluorescenza time-lapse microscopio e software Elements.

    Movie 2. Saggio Clearance mesoteliali. Clicca qui per vedere il film .

    Figura 4
    Attenuazione Figura 4. Di Talin uno espressione in OVCA433 sferoidi possono diminuire la capacità mesoteliali clearance. OVCA433 sferoidi (rosso) con e senza l'espressione attenuata di Talin 1 sono stati autorizzati a cui attaccarsi e invadere in un monostrato ZT mesoteliali (verde). Le due popolazioni cellulari sono stati ripresi ogni 10 minuti per 8 ore utilizzando una Ti-E Nikon invertito motorizzato widefield fluorescenza time-lapse microscopio e software elementi. Il grafico mostra che Talin 1 attenuazioneriduce significativamente la clearance delle cellule mesoteliali (plot Quantile con barre verdi i mezzi).

    Movie 3. Controllo OVCA433 sferoidi (rosso) che invadono in un monostrato mesoteliali (verde). Clicca qui per vedere il film .

    Attenuazione Movie 4. Di Talin uno espressione in OVCA433 sferoidi (rosso) diminuisce mesoteliali (verde) capacità di clearance. Clicca qui per vedere il film .

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    Discussion

    Il "test Liquidazione mesoteliale" qui presentata usa microscopia time-lapse per monitorare le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali, in grande dettaglio spaziale e temporale. In precedenza, diversi gruppi 8-14 aveva usato saggi endpoint per dimostrare che le cellule tumorali ovariche attaccarsi e invadere monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio è unico in quanto utilizza celle fluorescente di distinguere le cellule tumorali da cellule mesoteliali, in modo che le dinamiche di queste due popolazioni cellulari possono essere monitorati durante il saggio. Il processo di intercalazione può essere visualizzata in tempo reale e il tasso di clearance mesoteliale può essere misurata quantitativamente nel tempo. L'uso di microscopia Timelapse permette di monitorare attentamente le dinamiche di interazione tra le due popolazioni cellulari in diverse condizioni sperimentali. Inoltre, una piccola percentuale alle cellule mesoteliali o il cancro ovarico ceLLS possono essere etichettati con un terzo marcatore fluorescente per monitorare le dinamiche delle singole cellule all'interno della popolazione. Seguendo celle individuali nel tempo, la direzionalità e la velocità di migrazione può essere calcolato. Per eseguire analisi risoluzione maggiore di liquidazione mesoteliale, fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia può essere utilizzato. Se adesioni focali sono classificati nelle cellule mesoteliali, la dissociazione di aderenze mesoteliali di estensioni sporgenti delle cellule tumorali possono essere monitorati, come descritto nella nostra pubblicazione precedente 17.

    Questa analisi può essere utilizzato per confrontare la capacità di invasione sferoidi cancro ovarico cellule che sono state geneticamente o farmacologicamente modificati per chiarire i meccanismi molecolari con cui sferoidi di cellule di cancro ovarico eliminare l'monostrato mesoteliali o per identificare piccole molecole inibitrici del processo. Inoltre, il test richiede un numero molto piccolo di cellule tumorali ovariche, così primario Tumocellule r da essudati fluido può essere utilizzato (vedi limitazioni di seguito), se etichettati da preincubating le cellule con coloranti cytotracker (Invitrogen). Il test è inoltre suscettibile di analisi ad alto rendimento. Per eseguire studi high throughput genetici o farmacologico, le cellule del carcinoma ovarico possono essere trasfettate con vettori siRNA differenti o trattate con diversi inibitori farmacologici in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Monostrati di cellule mesoteliali possono essere placcati in 96 pozzetti con fondo di vetro piastre di coltura, e gli sferoidi possono essere trasferiti 01:01 dalle piastre rivestite poli-HEMA alle monostrato contenenti piastre. Tutti questi passaggi possono essere ottimizzati per l'utilizzo con i robot di screening in modo che centinaia di siRNA o inibitori può proiettato in una sola volta.

    Uno dei punti di forza di questo saggio è quello di essere in grado di modellare la forza-dipendente intercalazione di cellule tumorali ovariche in monostrato mesoteliali. Il nostro laboratorio di microscopia usato la forza di trazione (TFM) per determinare se meccanica foRCE regola 17 mesoteliali clearance. Abbiamo trovato che la sovraespressione di α5 integrina aumentato la contrattilità delle cellule piastrate su uno fibronectina-substrato rivestito, mentre RNAi-mediata knockdown di Talin, o miosina II diminuzione della contrattilità cella 17. Dal momento che down-regulation di α5 integrina, Talin, o miosina II negli sferoidi di cellule di cancro ovarico anche una ridotta clearance mesoteliali, le nostre misurazioni TFM sostenere l'idea che la clearance mesoteliali in un evento dipende da cellulari forze contrattili, in cui le cellule con maggiori forze contrattili causato una maggiore mesoteliali clearance. Pertanto, il saggio mesoteliali gioco può essere utilizzato per comprendere ulteriormente eventi intercalazione, associati con metastasi ovarica sferoidale, che sono dipendenti da forze meccaniche.

    Questo saggio presenta alcune limitazioni da considerare. In primo luogo, per formare gli sferoidi multicellulari, le cellule devono essere coltivate in sospensione per almeno 6 ore. Sele cellule sono in grado di sopravvivere senza matrice di contattare la loro capacità di autorizzazione sarà compromessa. In secondo luogo, è vantaggioso usare cellule di cancro ovarico che formano uniformi, sferoidi compatti multicellulari. Se le cellule del carcinoma ovarico solo formare aggregati sfusi, che possono rompersi nel trasferimento dal polyHEMA rivestita piastra al recipiente contenente il monostrato mesoteliale, creando sferoidi di diverse forme e dimensioni che si aggiungono variabilità dei dati. In terzo luogo, se le cellule utilizzate sono eterogenei, questo aggiungerà variabilità aggiuntiva alle dimensioni dei fori creati in monostrato. È importante utilizzare pozzetti multipli (replicati 10-20/sample) a causa della variabilità in grado di intercalazione dopo otto ore. Nei saggi qui descritti, ben consolidata carcinoma ovarico (OVCA433) e mesoteliali (ZT) linee cellulari sono stati utilizzati. Per fare questo saggio più clinicamente rilevante, primarie cellule tumorali ovariche, dal liquido ascitico di pazienti, possono essere utilizzati. Sarebbe interessante determmente se nella capacità delle cellule mesoteliali gioco vitro si correla con l'esito clinico. Le limitazioni di cui sopra sono particolarmente importanti da considerare quando si utilizzano campioni elementari, come il numero di cellule primarie disponibili è un fattore limitante. Inoltre, è importante controllare l'integrità del monostrato mesoteliali prima esecuzione di questo test. Il monostrato mesoteliale può essere fissate e colorate per cellula-cellula proteine ​​giunzione per assicurare che giunzioni cellule mesoteliali sono intatti.

    Infine, il saggio gioco mesoteliali possono essere facilmente modificati per rispondere a specifiche domande sperimentali. Qui, abbiamo usato fibronectina come componente ECM che consente alle cellule ovariche mesoteliale e ad aderire alle fondo di vetro piastre di coltura, tuttavia, altri componenti ECM può essere utilizzato anche collagene e laminina. Inoltre, altri tipi di cellule che si trovano sotto la membrana basale, compresi fibroblasti, può essere aggiunto a questo sistema sperimentale, per valutare il ruolodi questi tipi di cellule nella clearance mesoteliali 9,19,20. Infine, le interazioni di altri tipi di cellule tumorali (ad esempio pancreatico, della mammella, etc) con cellule mesoteliali può anche essere modellata utilizzando questo saggio. Ed è possibile studiare le interazioni tra cellule tumorali e un monostrato endoteliale, questo test, per imitare intravasation o stravaso (saggi simili sono stati descritti in: 15,16,21-27).

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    Disclosures

    Non abbiamo nulla da rivelare.

    Acknowledgements

    Vorremmo ringraziare la Nikon Imaging Center presso la Harvard Medical School, in particolare Jennifer Waters, Lara Petrak e salmone Wendy, per la formazione e l'uso delle loro microscopi timelapse. Vorremmo anche ringraziare Rosa Ng e Achim Besser per le discussioni importanti. Questo lavoro è stato supportato dal NIH di Grant 5695837 (da M. Iwanicki) e GM064346 di ACC, da una sovvenzione dal Dott. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (a JSB).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OVCA433 Ovarian Cancer Cells Gift from Dr. Dennis Slamon
    ZT Mesothelial Cells Gift from Dr. Tan Ince
    Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 19950
    MCDB105 Cell Applications Inc. 117-500
    FBS-heat inactivated GIBCO, by Life Technologies 10082
    Pen-Strep GIBCO, by Life Technologies 15070
    96 well plates Corning 3799
    Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) Sigma-Aldrich 192066-25G For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH
    EtOH Pharmco-AAPER 111ACS200 Dilute to 95% in dH20
    Cell culture hood Nuaire NU-425-300
    Tissue culture incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. 3110
    incubator for poly-HEMA plates Labline Instruments Imperial III 305
    Tabletop centrifuge Heraeus Instruments 75003429/01
    6 well glass-bottom dish MatTek Corp. P06G-1.5-20-F
    Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG
    PBS Cellgro 21-040-CV
    Microscope Nikon Instruments Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System
    Lens Nikon Instruments 20X-0.75 numerical apeture
    Halogen transilluminator Nikon Instruments 0.52 NA long working distance condenser
    Excitation and emission filters Chroma Technology Corp. GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
    Transmitted and Epifluoresce light path Sutter Instrument Co. Smart Shutters
    Linear-encoded motorized stage Nikon Instruments
    Cooled charged-coupled device camera Hamamatsu Corp. ORCA-AG
    Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control Custom Made
    Vibration isolation table TMC
    NIS-Elements software Nikon Instruments Version 3

    References

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