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 JoVE Immunology and Infection

लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

1, 2, 1, 2, 2, 1

1Microbiology and Pathogenesis Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, 2Tick-Borne Diseases Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

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Cite this Article: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

Patton, T. G., Dietrich, G., Brandt, K., Dolan, M. C., Piesman, J., Gilmore Jr., R. D. Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks. J. Vis. Exp. (60), e3894, doi:10.3791/3894 (2012).

Abstract: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

Ticks दुनिया भर में पाए जाते हैं और कई टिक जनित बीमारियों के साथ मनुष्य के दु: ख है. Ticks रोगज़नक़ों कारण है कि Lyme रोग और टिक जनित प्रत्यावर्ती ज्वर (Borrelia एसपीपी), रॉकी पर्वत बुखार देखा (रिकेटसिआ rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis और ई. सम), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum) इन्सेफेलाइटिस (टिक के लिए वैक्टर जनित इन्सेफेलाइटिस वायरस), (Babesia एसपीपी). babesiosis, में कोलोराडो टिक बुखार (Coltivirus) और Tularemia (Francisella tularensis) के 1-8. को ठीक से मेजबान में प्रेषित किया जा इन संक्रामक एजेंटों विभिन्न जीन अभिव्यक्ति को विनियमित, टिक प्रोटीन के साथ बातचीत, और 3,9-13 टिक के माध्यम से विस्थापित. उदाहरण के लिए, Lyme रोग एजेंट, Borrelia burgdorferi, अंतर जीन अभिव्यक्ति के माध्यम से टिक पशुस्थानिक 14,15 चक्र की दावत और अकाल चरण के लिए adapts. इसके अलावा, के रूप में एक Ixodes टिक खपतbloodmeal Borrelia दोहराने के लिए और hemocoel है, जहां वे लार की गिल्टी के लिए यात्रा कर रहे हैं और मेजबान में निष्कासित कर दिया 9,16-19 लार के साथ प्रेषित में आद्यमध्यांत्र से विस्थापित.

मेजबान के रूप में एक टिक फ़ीड आम तौर पर एक मजबूत और hemostatic और सहज प्रतिरक्षा 11,13,20-22 प्रतिक्रिया के साथ जवाब. मैं इन मेजबान प्रतिक्रियाओं के बावजूद, scapularis कई दिनों के लिए फ़ीड क्योंकि टिक लार प्रोटीन है कि immunomodulatory, lytic एजेंटों, anticoagulants, और fibrinolysins 3,11,20,21,23 खिला टिक सहायता कर सकते हैं. immunomodulatory गतिविधियों टिक लार या लार ग्रंथि निकालने (SGE) द्वारा पास प्रसारण, प्रसार, कई टिक जनित 3,20,24-27 रोगज़नक़ों के प्रसार और सुविधा. आगे समझने के लिए कैसे टिक जनित संक्रामक एजेंटों के रोग का कारण यह करने के लिए सक्रिय रूप से काटना ticks के खिला और टिक लार इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है. इस वीडियो प्रोटोकॉल के लिए विच्छेदन तकनीक को दर्शाता हैhemolymph का संग्रह और सक्रिय रूप से मैं खिलाने से लार की गिल्टी को हटाने के scapularis nymphs के 48 के बाद और 72 घंटे के बाद माउस नियुक्ति. हम भी एक वयस्क महिला मैं से लार संग्रह का प्रदर्शन scapularis टिक.

Protocol: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

1. स्लाइड तैयार करने के लिए संग्रह hemolymph

(मूवी 1)

  1. धीरे से 5 मिनट के लिए एक और 3% सामयिक हाइड्रोजन पेरोक्साइड में पशु जगह से सक्रिय रूप से खिला ticks है और हटाने के फिर सतह बाँझ 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में.
  2. साथ पैप कलम silane लेपित खुर्दबीन स्लाइड पर एक वृत्त खींचना और पैप कलम सर्कल के भीतर टिक जगह है.
    1. Silane लेपित स्लाइड खुर्दबीन स्लाइड के लिए सबसे अच्छा hemolymph का पालन करने के लिए उपयोग किया जाता है.
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप (1X उद्देश्य, 10X ऐपिस, 3.5X बढ़ाई) के तहत टिक देखें.
  4. धीरे संदंश साथ है टिक पीठ पर नीचे टिक पैर टेढ़ा और टिक स्थिर धक्का.

नोट: जब टिक immobilizing भी कठिन प्रेस नहीं है क्योंकि यह आद्यमध्यांत्र या टिक पंचर बाधित और hemolymph के दूषित हो सकता है.

  1. टिक या वें पर पैर पैर काटनाई ठीक एक डिस्पोजेबल स्केलपेल बिंदु के साथ बाहर का संयुक्त. संक्रामकता निर्धारित hemolymph के माध्यम से केवल 1 पैर काट किया जाना चाहिए. स्लाइड पर hemolymph के संग्रह के लिए कई पैर काट किया जा सकता है.

नोट: क्या कटौती क्योंकि यह hemolymph की आद्यमध्यांत्र संदूषण के कारण हो सकता है नहीं भी शरीर के करीब पैर.

  1. के बाद पैर या पैर काट रहे हैं धीरे स्लाइड पर पैरों के बाहर छिपाना hemolymph के लिए है टिक पीठ के लिए दबाव लागू करने के लिए जारी. धीरे चारों ओर स्लाइड पर टिक hemolymph से फैल चाल.

2. लार ग्रंथि को हटाने

मूवीज़ (2 & 3)

  1. स्पॉट फॉस्फेट के कई 25 μl पूल एक खुर्दबीन स्लाइड पर खारा (पीबीएस) के बफर और एक पीबीएस पूल में एक टिक जगह.
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप (1X उद्देश्य, 10X ऐपिस, 3.5X बढ़ाई) के तहत टिक देखें.
  3. ठीक इत्तला दे दी forcep साथ टिक स्थिर कीआधार capitulum (मुँह भागों) या टिक के पीछे रखने के द्वारा है.
  4. टिक के पीछे में ठीक इत्तला दे दी संदंश डालें और ऊपर टुकड़ा टिक अंगों को बेनकाब करने के लिए पीठ है. अगर वांछित आद्यमध्यांत्र इस समय पर हटाया जा सकता है और एक खुर्दबीन स्लाइड पर एक PBS की ताजा पूल या एक microfuge पीबीएस युक्त ट्यूब के लिए स्थानांतरित.
  5. लार (अंगूर की तरह समूहों) टिक के पैरों के साथ द्विपक्षीय स्थित ग्रंथियों की जोड़ी खोजें. यदि लार की गिल्टी में टिक मलबे मुख्य टिक भाग ले जाने के लिए, अभी भी लार की गिल्टी वाले पीबीएस की एक ताजा पूल के विघटन और लार की गिल्टी के नुकसान को कम करने के बीच में दिखाई नहीं कर रहे हैं.

नोट: इससे पहले एक खिलाने में, लार की गिल्टी कठिन को खोजने क्योंकि वे के रूप में खिलाने में पर बाद में की तुलना में विकसित नहीं कर रहे हैं.

  1. ठीक इत्तला दे दी संदंश और पीबीएस का एक ताजा पूल में जगह के साथ टिक से लार की गिल्टी निकालें.
  2. वाईठीक वें संदंश एक और साफ 25 μl पीबीएस पूल लार की गिल्टी को हस्तांतरण करने के लिए, इस धोने कदम 3-4 से अधिक बार दोहराने के लिए किसी भी बाहरी सूक्ष्मजीवों और टिक मलबे को हटाने के इत्तला दे दी.

नोट: लार ग्रंथि समूहों धीरे धो नुकसान और व्यक्तिगत लार ग्रंथियों के विघटन को कम करने.

  1. एक silane लेपित स्लाइड पर एक PBS की साफ पूल में या एक microfuge पीबीएस युक्त ट्यूब में ग्रंथियों रखें.

3. लार संग्रह

(मूवी 4)

  1. धीरे वयस्क खरगोश या अन्य मेजबान का उपयोग कर ठीक इत्तला दे दी संदंश बस से पहले वे छोड़ पूरी तरह से engorged, लगभग 5-7 दिनों के बाद लगाव से महिला ticks के हटा दें.
  2. स्कॉच टेप के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड के एक छोर पर लगभग रक्तसंकुल टिक पालन करें. टेप रखा जाना चाहिए लगभग ¾ टिक सिर की ओर पीठ को रास्ते टिक आधार capitulum मुँह भागों उजागर जा.
  3. जहां टेप ticks के 5% pilocarpine समाधान की पृष्ठीय सतह pipet 5 μl (मेथनॉल में) के पूर्वकाल किनारे मिलता है. टेप टिक पीठ पर pilocarpine बाती pilocarpine टिक आधार capitulum के साथ संपर्क में आने के लिए अनुमति के बिना, की अनुमति दें.
  4. खुर्दबीन स्लाइड पर गैर विषैले मॉडलिंग मिट्टी का एक टुकड़ा टिक mouthparts से लगभग एक इंच माउंट.
  5. ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर एक खींच केशिका 28 ट्यूब की वांछित व्यास को टिप को तोड़ने.
  6. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे लिए टिक आधार capitulum देखें.
  7. धीरे खींच केशिका ट्यूब दाढ़ की हड्डी का palps केशिका ट्यूब के बाहर निवास करने के लिए अनुमति में टिक hypostome को फिट.
  8. क्ले मॉडलिंग में केशिका ट्यूब के विपरीत अंत प्रेस जगह में केशिका ट्यूब पकड़.
  9. उच्च आर्द्रता (जैसे, एक lidded स्टायरोफोम गीला पैप के साथ लाइन बॉक्स के साथ एक अंधेरे कक्ष के अंदर घुड़सवार मुँह में पानी टिक प्लेस एर तौलिए). Hypostome अंक तो कंटेनर के नीचे स्लाइड झुकाव, गुरुत्वाकर्षण लार संग्रह में सहायता करने के लिए अनुमति देता है.
  10. कमरे के तापमान पर कंटेनर रखें.
  11. निकट ticks के पहले घंटे के लिए मुँह में पानी की निगरानी, ​​और लार जमा के रूप में यह यह expelling के बाहर एक पाश्चर pipet बल्ब के साथ केशिका ट्यूब के द्वारा उत्पन्न होता है. पहले घंटे के बाद, कम से कम 4 घंटे के लिए हर घंटे संचय की जाँच करें. लार के रूप में यह उत्पन्न होता है इकट्ठा करने के लिए जारी रखें.

नोट: एक बार पर्याप्त लार लार अधिग्रहण प्रदर्शन किया जा रहा अध्ययन के लिए एकत्र किया जाता है रोका जा सकता है.

  1. यदि ticks के मुँह में पानी है या नहीं अगर अधिक लार की आवश्यकता है, कभी कभी राल निकालना केशिका ट्यूब hypostome मालिश का उपयोग करने के लिए द्वारा प्रेरित किया जा सकता है.
  2. लार और -80 में दुकान डिग्री सेल्सियस तक की जरूरत के लिए protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के 0.1 मात्रा जोड़ें.

4. प्रतिनिधि परिणाम

> 1 मूवी e_content दर्शाता है कि कैसे एक आंशिक रूप से में में खिलाया मैं scapularis अप्सरा पकड़ और पैर काटना के लिए एक खुर्दबीन स्लाइड पर hemolymph इकट्ठा एक बार पैर या पैर काट कर रहे हैं एक साफ तरल पदार्थ (आंकड़ा 1 ए और 1 बी) secreted है. यदि आद्यमध्यांत्र उठी hemolymph बादल दिखाई देता है के रूप में इसे काट पैर (ओं) (आंकड़ा 1C और 1D) के बाहर आता है.

अप्सरा 48 या 72 घंटे के लिए खिला गया है के बाद लार ग्रंथियों की निकासी के 2 और 3 फिल्मों में प्रदर्शन किया है. के बाद टिक की हवा निकाल दी है, वहां आम तौर पर मलबे का एक बहुत है (ट्रेकिआ, malpighian नलिकाओं, रक्त से मिलकर, संयोजी ऊतक आदि), नुकसान या लार की गिल्टी के विघटन को रोकने के पीबीएस की एक ताजा पूल टिक चाल. 2A और 2B शो के आंकड़े और जहां लार की गिल्टी के बाद अप्सरा खुला काट दिया गया है स्थित हैं आंकड़ा 2C से पता चलता है पीबीएस की एक पूल में लार ग्रंथि समूहों को हटा.

लार संग्रह मैं से स्थापित scapularis वयस्क महिलाओं मैं 4 फिल्म और आंकड़ा 3 में दिखाया गया है. एक केशिका ट्यूब में मुँह में पानी टिक 5 फिल्म में मनाया जाता है. लार संग्रह की इस पद्धति का इस्तेमाल किया pilocarpine राल निकालना उत्तेजित और वयस्क महिला टिक प्रति लार के 20 μl से अधिक उपज कर सकते हैं.

आकृति 1.
चित्रा 1 मैं scapularis अप्सरा के लेबल संरचनाओं.

मूवी 1. Ixodes scapularis hemolymph संग्रह. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2.
चित्रा 2. (A & B) पवित्र और (सी और डी) अप्सरा पैर से exuding hemolymph दूषित.

मूवी 2. 48 घंटे खिलाया मैं से लार ग्रंथि निष्कर्षण scapularis अप्सरा.pload/3894/3894movie2.avi "> फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूवी 3 से एक 72 घंटे खिलाया मैं लार ग्रंथि निष्कर्षण scapularis अप्सरा फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3.
चित्रा 3 Ixodes scapularis अप्सरा लार ग्रंथियों. (ए एंड बी) लार की गिल्टी का एक 72 घंटे खिलाया अप्सरा में उदाहरण निकासी के लिए पहले. (सी) लार ग्रंथि क्लस्टर हटाया.

मूवी 4 लार संग्रह से एक वयस्क मैं स्थापित scapularis महिला टिक. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4.
चित्रा 4 से लार संग्रह वयस्क आई. scapularis महिला टीicks. (ए एंड बी) क्ले मॉडलिंग द्वारा आयोजित केशिका ट्यूब की unpulled अंत के साथ केशिका ट्यूब के अंत में खींच लिया hypostome के साथ एक स्लाइड पर घुड़सवार टिक. (सी एंड डी) humidified मुँह में पानी वयस्क मैं युक्त कक्ष scapularis महिला ticks है.

5 मूवी. Scapularis महिला एक केशिका ट्यूब में मुँह में पानी टिक Ixodes फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

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Discussion: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

टिक hemolymph, लार की गिल्टी, और लार का संग्रह टिक जनित रोगज़नक़ संचरण के अध्ययन में महत्वपूर्ण है, प्रसार, प्रसार, प्रसार, और दोनों टिक और 6,11-13,20,23,29 मेजबान में दृढ़ता. वहाँ 30,31 टिक काटना के लिए कई तरीके हैं. हालांकि, जब लार की गिल्टी का संग्रह यह टिक ठीक से लार की गिल्टी उठी या नहीं टिक रहता है में खो रहे हैं तो काटना करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक बार लार की गिल्टी टिक वे कई बार धोया जा आद्यमध्यांत्र संदूषण को निकालने और तब धुंधला हो जाना या पीबीएस में जमीन लार ग्रंथि निकालने (SGE) प्राप्त करने के लिए एक स्लाइड पर तय किया जा सकता है की जरूरत से हटा रहे हैं. SGE लार से इकट्ठा करने के लिए आसान है और लार के लिए इसी तरह की विशेषताओं के पास है, इसलिए यह एक लार विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, SGE अतिरिक्त लार ग्रंथि की कोशिकाओं है कि टिकटिक लार में मौजूद नहीं हैं से होने वाले प्रोटीन शामिल हैं. SGE कर सकते हैं ख में अतिरिक्त प्रोटीन के अलावाएक लाभ या नुकसान प्रदर्शन किया जा रहा एक अध्ययन के आधार पर, लेकिन कुछ एक शोधकर्ता जब SGE के साथ काम करने के बारे में पता होना चाहिए है. SGE लाभ है कि pilocarpine लार की गिल्टी के संग्रह के दौरान प्रयोग नहीं किया जाता है. Pilocarpine, muscarinic परानुकंपी अनुकारी एजेंट है कि मुक्ति का एक agonist के रूप में कार्य करता है, बी पर एक साइटोटोक्सिक प्रभाव है दिखाया गया है लार संग्रह 32,33 दौरान burgdorferi. Dopamine राल निकालना के एक और agonist है लेकिन तेजी से hemolymph और अन्य टिक तरल पदार्थ के द्वारा नष्ट, के रूप में है कि एक निरंतर प्रभाव 33 pilocarpine तुलना में. अन्य stimulatory तकनीक लार संग्रह के लिए पता लगाया गया है और सभी लार 34 संरचना को प्रभावित दिखाया गया है.

Hemolymph संग्रह मुश्किल हो सकता है क्योंकि ticks के बढ़ रहे हैं और यह करने के लिए उन्हें आद्यमध्यांत्र rupturing के बिना स्थिर करने के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता कर सकते हैं. डबल पक्षीय टेप के साथ टिक Immobilizing एक विकल्प है, लेकिन hemoलसीका टेप पर खो दिया जा सकता है अगर नहीं टिक निकाल दिया जाता है. अन्य अध्ययनों से कई ticks है से बाहर जोड़ों पर टिक पैर काटने और centrifugation का उपयोग करने के लिए hemolymph 16,35 एकत्र hemolymph एकत्र किया है. एक बार hemolymph संग्रह महारत हासिल है hemolymph टिक संक्रामकता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, रोगज़नक़ बातचीत टिकटिक, और लार की गिल्टी आद्यमध्यांत्र से रोगजनकों के प्रवास.

हालांकि हमारी प्रयोगशाला बी पर ध्यान केंद्रित है burgdorferi और मैं scapularis ticks है, इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीकों के लिए अन्य टिकटिक जनित संक्रामक एजेंटों का अध्ययन और प्रजातियों टिकटिक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इन तकनीकों या nymphs के रिश्तेदार आसानी के साथ वयस्कों पर इस्तेमाल किया जा सकता है. लार्वा के साथ इन तकनीकों का प्रयोग उनके आकार के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है. विच्छेदन तकनीक में महारत हासिल है जब तक यह के असंक्रमित ticks के उपयोग का सुझाव दिया है. यह भी उचित जैव सुरक्षा उपाय का प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है जब infec विदारकटेड या क्षेत्र ticks है एकत्र की. इस वीडियो प्रोटोकॉल में विधियों टिक dissections और जब इन तकनीकों का प्रदर्शन करने के लिए क्या देखने के बाहर कैसे ले जाने के लिए पर दिशा निर्देशों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

लेखकों के लिए वेक्टर जनित रोगों के पशु संसाधन शाखा के डिवीजन शुक्रिया अदा करना चाहूँगा, विशेष रूप से Andrea पीटरसन, लिसा Massoudi, वेरना ओ, और जॉन लिडेल उनके और चूहों और खरगोशों की देखभाल और रखरखाव के लिए. हम भी एमी Ullmann, थेरेसा रसेल, और बारबरा जे जॉनसन इस पांडुलिपि की ओर उनके योगदान के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. अंत में, हम सीडीसी पर संचार के लिए एसोसिएट निदेशक के कार्यालय में Alissa Eckert इस पांडुलिपि के फिल्मांकन के साथ जुड़े सभी कानूनी निर्देशन के लिए ग्राफिक चित्रों और जमीमा Lavelle उत्पादन के लिए स्वीकार करना होगा.

Materials: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H312-500
Ethanol Acros Organics 61509-5000
PBS Boston Bioproducts BM-2205
Dumont Fine forceps (3C) Fisher Scientific NC9906085
Silane treated microscope slides Bioworld 42763007-1
Pap pen Bioworld 21750008-1
Super frost plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-18
Pilocarpine Sigma-Aldrich P6503-5G
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714
#11 disposable scalpel Feather Safety Razor Co, Ltd. 2975#11
Nontoxic modeling clay Fisher Scientific S17307
Capillary tubes Chase Scientific Glass, Inc. 40A502

References: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

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  35. Burgdorfer, W. Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).

Ask the Author: लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

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Dear professors:
This video experiments is basically valuable! and really meaningful for me, i am now focusing on ticks as a master student.
however, our library hasn't purchased it yet, could you do me a favor to send it for me,
my email is xinwang19871216@yahoo.com,
really thanks for you~

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Posted by: sanger w.May 30, 2012, 9:59 PM

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