Développement sexuel et la libération des ascospores dans Fusarium graminearum

Brad Cavinder¹, Usha Sikhakolli², Kayla M. Fellows³, Frances Trail^2,4

¹Genetics Program, Michigan State University, ²Department of Plant Biology, Michigan State University, ³Human Biology Program, Michigan State University, ⁴Department of Plant Pathology, Michigan State University

1. Produire périthèces

1. Agar Centre carotte inoculer ¹⁰ en a 6,0 cm de diamètre boîte de Pétri avec une souche fertile de F. graminearum (PH Recommander-1).
2. Lieu inoculé plats sous les lumières lumineuses fluorescentes à température ambiante (18-24 ° C) et laisser croître jusqu'à ce que le mycélium a atteint le bord extérieur de la boîte de Pétri (3-5 jours). Les lampes domestiques commerciaux fluorescentes fonctionnent très bien pour stimuler la formation de corps de fructification et de décharge.
3. Retirez délicatement le mycélium aérien avec un cure-dent stérile.
4. Distribuer 1,0 ml de 2,5% de Tween 60 aq à la surface avec une Hockeystick verre stérile ou d'extrémité arrondie d'une tige en verre stérile.
5. Remettre les assiettes à la lumière. Ne pas ajouter de Parafilm à plaques.
6. Après 24 h, la surface des plaques doit avoir un aspect brillant. Si mycélium réapparaît, la surface gratter et une nouvelle demande de Tween-60 solution.
7. Observer le développement des périthèces cours de la semaine prochaine. Les étapes intermédiaires dedéveloppement périthèce peut être récolté en grattant doucement la surface de l'agar-agar et surgelés pour extraction de l'ARN (Figure 1).
8. Les spores mûres vont s'accumuler sur le couvercle de la plaque par jour 7. Au départ, ces ne sera visible que sous un microscope à dissection, mais le jour 9, ils se sont accumulés à une densité suffisante de manière à être visible à l'œil nu.

2. Essai de décharge des ascospores

1. Au jour 6 après l'application de la solution de Tween, couper un cercle de 1 cm de diamètre sur l'agar-agar avec un perce-bois. Alternativement, un scalpel peut être utilisé pour enlever un segment de taille similaire. Le cercle peut être coupé en deux et chaque moitié placé sur une lame de microscope en verre.
2. Orienter les pièces afin que la surface contenant les fructifications est perpendiculaire à la surface de la diapositive, et les spores sont tirés vers le bas la longueur de la glissière.
3. Placer la lame dans une chambre humide pendant la nuit sous les lumières. Les spores vont s'accumuler sur lesla lame et être visible à l'œil nu le matin suivant (Figure 2).
4. Spores accumulées peuvent être lavés de la lame à l'eau et quantifiés si vous le souhaitez.
5. Inhibiteurs potentiels de la décharge d'ascospores peuvent être analysés en les ajoutant à l'arrière du bloc de gélose pendant le montage de l'essai. Certains inhibiteurs de canaux ioniques qui permettent de réduire la décharge ont déjà été testés avec cette technique ^15.

3. Génération d'une descendance recombinante

1. Initier traverser en inoculant agar carotte avec deux souches de F. graminearum (un Nit + et l'autre à lentes), plaçant les points de inoculation sur des côtés opposés de la boîte de Petri.
2. Une fois que les hyphes ont rempli la surface, grattez partie aérienne et appliquer une solution de Tween-60 tel que décrit ci-dessus. Utilisation d'un marqueur de noter sur le côté de la boîte de Petri, où les hyphes répondre.
3. Retour cultures à la lumière et incuber jusqu'à périthèces se sont développés, et ont cirrhes êtrearmes à feu pour former de l'périthèces long de l'intersection entre les deux cultures.
4. Sous le microscope de dissection, mettre en voir les périthèces long de l'intersection des deux cultures. Utilisation une broche d'insecte, stérilisé et trempée dans de l'eau stérile, un toucher cirrhus long de ce bord légèrement avec l'extrémité de la broche. L'humidité sur la broche devrait permettre aux cirrhus de s'en tenir à la broche.
5. Rincer l'extrémité de la broche avec les cirrhus sur elle dans 200 ul d'eau stérile dans un tube Eppendorf de se laver les spores hors tension.
6. Flamme de la broche, l'humidifier et reprendre un autre cirrhus. Très 10 à 15 cirrhes, et placer chacun dans un tube séparé de l'eau.
7. Tubes vortex brièvement suspendue contenant cirrhes.
8. Retirer 60 pl de la suspension de spores avec une pipette et le lieu sur un milieu MMTS ¹ dans un plat de Pétri de 9 cm. Étaler avec une crosse de hockey stérile. La suspension de spores restant peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine et réétalées si nécessaire.
9. Incubationte à la température ambiante (la lumière n'est pas nécessaire) pendant 3-5 jours jusqu'à ce que les très petites colonies apparaissent (Figure 3). Il y aura deux sortes de phénotypes entre les colonies. Les colonies lentes aura hyphes moins nombreuses que les colonies + NIT. Cirrhes de recombinaison périthèces se montrent les deux phénotypes colonie en proportion à peu près égale. Jeter les plaques avec des colonies de seulement un phénotype unique sur eux. Notez que, parfois, plus de deux phénotypes survenir en raison de la ségrégation des autres facteurs.
10. Déplacer les colonies à V8 ou de l'agar de carotte pour le stockage. Colonies de test sur gélose de Czapek Dox (les souches lentes ne poussent pas sur Czapek Dox) et sur le PDA avec le chlorate (0,5 M chlorate de potassium; les souches + NIT ne poussent pas sur PDA avec le chlorate) pour confirmer le phénotype correcte. Examinez ces colonies pour les qualités souhaitées.

4. Les résultats représentatifs

Produire des périthèces

Le but est d'avoir une pelouse depérithèces sans mycélium ou des spores apparentes. La surface de la culture sera semblable au velours noir (Figure 1). À 24 h après l'application de Tween la surface de la gélose doit avoir un léger lustre. Si mycélium réapparaissent, puis la plaque peuvent ne pas avoir été gratté assez pour induire le développement périthèce.

Ascospores décharge

Toujours prévoir dans votre test de plusieurs blocs de gélose à partir de la souche de type sauvage. Si ceux qui ne se déclenchent pas, alors soit vos périthèces sont trop jeunes ou trop vieux. Si ils sont trop vieux, alors de nombreux hyphes apparaîtra au-dessus de la surface de la culture en lui donnant une teinte blanchâtre. Si ce n'est pas le cas, ils peuvent être trop jeune, et le dosage doit être jugé à nouveau en 24 h. Parfois, les cultures ne se déchargent pas bien, et l'expérience devra être répétée. Assurez-vous effectuer le test dans les conditions de lumière propres.

Descendance recombinante

Figure 1. Les étapes du développement périthèce sur gélose de carotte. Gauche, 72 h après l'application de Tween. Notez pigment rouge et périthèces très jeune visibles que quelques grains noirs sur la surface. A droite, à 144 h, périthèces matures ont formé. Notez l'absence quasi-complète du mycélium superficiel dans les deux cultures.

Test de décharge Figure 2.. La fiche orange carotte agar est orienté de façon thaspores t force déchargés de la périthèces matures sur sa surface peuvent s'accumuler sur la surface de la lame de verre. 15 h temps d'accumulation.

Figure 3. Les différences de croissance entre Nit nit + et des colonies sur milieu MMTS sélective. Les colonies nit-(pointes de flèches) sont plus petits. Les + de Nit colonies (flèches) montrent une croissance robuste. Photo prise au bout de 7 jours.

La capacité d'évaluer un phénotype de tir des spores peuvent être subtils dans les espèces où les spores sont de petite taille et difficiles à voir, comme Sclerotinia sclerotiorum.