The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Molecular and Microbiology Department and Center for the Study of Genomics in Liver Diseases, George Mason University, 2Translational Research Institute, Inova Health System, 3Research Center for Medical Genetics RAMS
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 184.72.184.104, User IP: 184.72.184.104, User IP Hex: 3091773544
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).
النيتروجين السائل هو عديم اللون، عديم الرائحة، بارد جدا (-196 درجة مئوية) السائلة أبقى تحت الضغط. ويشيع استخدام هذا كسائل المبردة لتخزين على المدى الطويل من مواد بيولوجية مثل خلايا الدم والأنسجة 1،2. طبيعة المبردة من النيتروجين السائل، في حين المثالي لحفظ عينة، يمكن أن يسبب التجميد السريع للأنسجة الحية في الاتصال - المعروفة باسم 'حرق المبردة "2، والذي قد يؤدي إلى قضمة الصقيع الشديد في الأشخاص الذين يشاركون عن كثب في تخزين واسترجاع عينات من Dewars. وبالإضافة إلى ذلك، والنيتروجين السائل يتبخر أنه يقلل من تركيز الأوكسجين في الهواء، وربما يسبب الاختناق، وخاصة في الأماكن الضيقة 2.
في المختبرات، وغالبا ما يتم تخزين العينات البيولوجية في cryovials أو cryoboxes مكدسة في الرفوف الفولاذ المقاوم للصدأ داخل الدبابات ديوار 1. وتقدم هذه رفوف التخزين مع رمح طويل لمنع مربعات من الانزلاق الخروج من الرفوف والى الجزء السفلي منDewars خلال التعامل مع الروتين. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، وعلب أو قوارير مع العينات الثمينة تفلت وتنزل الى القاع من خزان النتروجين السائل شغلها. في مثل هذه الحالات، يمكن أن عينات استرجاع مضجر بعد نقل النيتروجين السائل في وعاء الغيار أو رميه. يمكن للصناديق وقارورة ثم تكون بأمان نسبيا تعافى من ديوار تفرغ. ومع ذلك، فإن طبيعة المبردة من النيتروجين السائل ومعدل توسع يجعل الغارقة الخطرة استرجاع العينة. ويوصى عادة من قبل مكاتب السلامة أن يتم أبدا تنفيذ استرجاع عينة من قبل شخص واحد. وثمة بديل آخر يتمثل في استخدام الأيادي بارد المتاحة تجاريا أو ملقط لسحب قوارير 3. ومع ذلك، الرؤية محدودة داخل Dewars سائل مظلم شغل يشكل عائقا كبيرا في استخدامها.
في هذه المقالة، ونحن تصف بناء جهاز متحمل البرد استرجاع DIY، الأمر الذي يجعل استرجاع عينة من السوائل المبردة ديوار التي تحتوي على كل من آمن 1الثانية وسهل.
1. تجميع الأجهزة متحمل البرد لاسترجاع Cryoboxes
2. تجميع الأجهزة متحمل البرد لاسترجاع Cryovials
ويمكن أيضا استرداد DIY متحمل البرد جهاز تكييفها لاسترجاع cryovials. وهذا ينطوي على استبدال قاعدة مسطحة مع مصفاة الفولاذ المقاوم للصدأ كما هو موضح غيرت لشفط خارج قارورة من النيتروجين السائل (الشكل 7).
3. استرجاع Cryoboxes وCryovials من ديوار
4. ممثل النتائج
ويتمثل التحدي الرئيسي في دراسات التعبير الجيني هو أن نوعية الحمض النووي الريبي يعتمد على ظروف التخزينلكل من عينات الأنسجة المجمدة والشكل استخراج الحمض النووي الريبي 4. 10 يظهر تأثير على سلامة التعامل مع عينة من الحمض النووي الريبي مجموع. تعرض الحمض النووي الريبي مجموع من المصدر نفسه الأنسجة (الدهنية لجسم الإنسان) إلى التعامل مع عينة مختلفة. قبل التجربة، سليمة مجموع الحمض النووي الريبي preparate يظهر واضحا 28S و 18S الريباسي العصابات مع الفرقة الريباسي 28S تقريبا ضعف شديد كما الفرقة الريباسي 18S (الشكل 10، لين 1). هذه النسبة 2:1 (28S: 18S) هو إشارة إلى أن الحمض النووي الريبي غير سليمة، في حين أن الحمض النووي الريبي المتدهورة جزئيا يظهر تشويه، أو 28S لها: 18S نسبة كثافة يبتعد 02:01 5. الممرات 3-4 يصور عينات الحمض النووي الريبي مع تدهور كبير. وتعرض هذه العينات على الحمض النووي الريبي defreezing الجزئية المتكررة على المدى القصير الاسترجاع من ديوار (الطريقة أ)، والنمذجة وبالتالي تخزين على المدى الطويل مع الدوري الصب نظرا لضرورة استرجاع من قنينة الذين سقطوا ومربعات (الشكل 10، لين 3-4 ). ومع ذلك، والعينات المخزنة في خدمتها ديوارباستخدام DIY الجهاز (الطريقة ب)، وبالتالي، لا defreezing جزئي، تحتوي على الحمض النووي الريبي سليمة (الشكل 10، لين 2).
الشكل 1. A) وقاعدة تتألف من اثنين من 3 أبعاد قوي من جانب والتعادل هو مبين. كل علاقة وثيقة، يحتوي على واحد كبير قبل حفر حفرة (السهم الصلبة) والعديد من الثقوب الصغيرة (السهم الصغير) على كل وجه. ويوفر هذا الخيار للسماح الربط مع الجوز ومسامير. أيضا أصغر الثقوب تسمح الصرف السريع من النيتروجين السائل خلال استرجاع العينة. B) يتم تقويمها جانب واحد من كل من مباراة قوية مع مساعدة من كماشة لجعل L شكل قوي التعادل.
الشكل 2. يستخدم قوية التعادل حزام تي لتأمين علاقات قوية معا. مثل تحالف قوي، T-حزام واحد كبير قبل حفر حفرة (السهم الصلبة) واثنين من الثقوب الصغيرة (األصغرل السهم) في كل زاوية. وهذا يسمح بتأمين علاقات قوية على طول تي - الشريط باستخدام المكسرات، والترباس. كما أنها تمكن إبزيم حزام T-إلى لوحة فترة زمنية محددة.
الشكل 3. أ) أن تثبت كل علاقة وثيقة إلى إحدى زوايا حزام-T، على طوله باستخدام المكسرات الترباس تاج ومغالق وغسالات. B) يتم تأمين اثنين من العلاقات القوية المجاورة لبعضها البعض للمساعدة في استرداد 5 ½ بوصة × 5 ونصف cryoboxes فيها. لأصغر cryoboxes مثل 2 بوصة X 2 بوصة، ويمكن تثبيتها واحد قوي التعادل مباشرة إلى لوحة فترة زمنية محددة من دون حزام-T.
الشكل 4. مشقوق يتم استخدام لوحة مسطحة والمقبض. طول فترة زمنية محددة لوحة يعتمد على عمق ديوار. في هذه الحالة، تم استخدام 4 أقدام من لوحة فترة زمنية محددة. سماكة لوحة فترة زمنية محددة هي الصورة الحاسمةاينس لوحات رقيقة فترة زمنية محددة (<14 مقاييس) جعل الجهاز واهية في حين استرجاع عينات من النيتروجين السائل ملء ديوار.
الشكل 5. ثم يتم تأمين قاعدة شقة تتكون من علاقات قوامها وحزام تي في واحدة من نهاية فترة زمنية محددة لوحة. يتم محاذاة أكبر ثقب في الزاوية المتبقية من حزام تي مع فتحة على لوحة مسطحة وتثبيتها باستخدام عرافة الترباس والجوز. ويمكن استخدام هذا الجهاز الآن لاسترداد cryoboxes من ديوار.
يعكف الشكل 6. واحدة من نهاية فترة زمنية محددة لوحة الشقة باستخدام كماشة وغطت رغوة مع لتوفير أفضل وخاصة بالنسبة للقبضة Dewars العميقة، كما هو مبين في هذه القضية.
الشكل 7. مصفاة مع اسلاك الصلب والفولاذ المقاوم للمؤشريستخدم لاسترداد cryovials من ديوار. سيكون مطلوبا إذا لم يتم توفير مقبض مع فتحة، مع حفر بت كربيد لحفر حفرة.
الرقم 8. لتخفيف استرجاع cryovials، عازمة مصفاة على طول الرقبة باستخدام كماشة للحصول على شكل مغرفة مصفاة. إذا تم توفير مصفاة مع شفة كما في هذه الحالة، يمكن استخدام كماشة لثنيه. هذا لا يضمن مصفاة ننشغل في ديوار.
يتم تأمين الشكل 9. مصفاة لوحة في شقة واحدة في نهاية فترة زمنية محددة باستخدام عرافة الجوز والترباس.
الرقم 10. سلامة عينة من الحمض النووي الريبي مجموع يتعرضون لمختلف ظروف المناولة عينة. لاستكشاف كيفية تأثر الحمض النووي الريبي الجودة من خلال عينة التعامل مع جonditions، تعرضت مجموعة من عينات الحمض النووي الريبي من نفس المصدر إلى طريقتين من handlings. وتألفت طريقة لتخزين من الحمض النووي الريبي في ديوار تعرض لاسترجاع العينة باستخدام جهاز DIY، وبالتالي لا defreezing جزئي. وتألفت طريقة B من تخزين الحمض النووي الريبي في ديوار التعرض للdefreezing الجزئية المتكررة على المدى القصير الاسترجاع من ديوار، والنمذجة وبالتالي تخزين على المدى الطويل مع الدوري الصب لاسترجاع عينات من سقط. وقد تم تحليل الحمض النووي الريبي ثم مجموع سلامة من قبل الكهربائي للهلام. Lane1: عينة قبل تخزينها في ديوار، لين 2: عينة من ديوار التعرض للاسترجاع من خلال طريقة، لين 3 و 4: عينة من ديوار تعرض لاستردادها من قبل الطريقة ب، M: 100 شركة بريتيش بتروليوم سلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
إحدى الطرق الأكثر شيوعا لاسترداد cryoboxes وcryovials من قاع الخزان ديوار هو صب النتروجين السائل في وعاء الغيار وسحب العينات المتبقية في قارورة أو طافية في النيتروجين السائل يصب. هذا، مع ذلك، من الممارسات غير الآمنة التي يمكن أن تسبب حروقا المبردة أو الاختناق بسبب التعرض لفترات طويلة لأبخرة النيتروجين السائل 2. طريقة أخرى شائعة من استرجاع cryovials سقطوا ينطوي على استخدام ملقط cryovial 3. ومع ذلك، فإن الرؤية محدودة داخل فضاء مظلم من خزان مملوء النتروجين السائل يحد من القدرة على المناورة بها.
استرداد DIY متحمل البرد جهاز المذكورة أعلاه توفر بديلا أرخص وأكثر أمنا وأسهل لاسترجاع cryoboxes سقط وcryovials من الجزء السفلي من قوارير عميق مع الرؤية محدودة. سهولة التعامل مع الجهاز استرجاع DIY تلتف على الحاجة لتفريغ القوارير قبل استرجاعها. وعلاوة على ذلك، وأرجعوقال rieval من cryovial بمساعدة جهاز يمكن القيام بها فرد واحد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام جهاز استرجاع DIY تقصير كبير في كمية من عينات أخرى وقت المخزنة في نفس الوحدة انفاق تحت درجات الحرارة المحيطة، وبالتالي تحسين ظروف تخزين عينة 6،7.
العديد من المواد التي تستخدم عادة مثل البلاستيك، والكربون الصلب والمطاط وتصبح هشة في النيتروجين السائل، وكسر في كثير من الأحيان تحت الضغط 8،9،10. والفولاذ المقاوم للصدأ أو المجلفن المكونات المستخدمة في الجهاز DIY هي مقاومة للضرر من دون تجميد درجات الحرارة من السوائل المبردة. وعلاوة على ذلك، وهذه المكونات هي متاحة بسهولة في المتاجر المحلية ومنخفضة التكلفة مع بناء جهاز DIY تصل إلى أقل من دولار و50.00. مقبض طويل يساعد على منع المشغل من الاتصال المباشر مع السوائل المبردة وقاعدة مثقبة ومصفاة تسمح لحظة استنزاف النيتروجين السائل خلال انتعاش عينة. ص السريعetrieval يسمح التعرض إلى الحد الأدنى أبخرة النيتروجين السائل مما يجعل استرجاع عينة أكثر أمنا عملية. نظرا لتصميمها وحدات، وجهاز استرجاع DIY لديه المرونة لاستخدامها في أي من صناديق أو قوارير. علاوة على ذلك، البساطة في التصميم يسمح تكيف الجهاز لDewars متفاوتة الأشكال والأحجام، وربما للعمل مع أنواع أخرى من السوائل المبردة. ربما، واستخدام هذا الجهاز مع ذلك، أن يقتصر في حالة من الدبابات المبردة التي ليس لها قاع مسطح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
وقد تم اختبار الجهاز DIY استرجاع المبردة في سياق مشاريع "prenylation نمذجة البروتين البكتيري في الخلايا حقيقية النواة استخدام المعلوماتية الحيوية والنهج الجزيئي" التي ترعاها جائزة ماري لويز أندروز لبرنامج أبحاث السرطان، فرجينيا أكاديمية العلوم "، مما يعني الفسيولوجية لتحرير الحمض النووي الريبي في البلازما شجيري خلايا "برعاية Jeffress F. توماس وكيت ميلر Jeffress الثقة التذكارية وعقد 16.740.11.0364 الدولة (وزارة العلوم والتربية، وروسيا). نود أن نشكر بيت بعثة مراقبة الانتخابات للحصول على المساعدة مع تجربة سلامة الحمض النووي الريبي.
