Con ovuli

Karen L. Joyce¹, Will Morgan², Robert Greenberg², Meera G. Nair¹

¹Institute of Immunology, Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Pathobiology, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

1. Purificante Schistosoma mansoni Eggs

1. Infect svizzero-Webster topi con cercariae schistosoma, che è lo stadio infettivo del ciclo di vita Schistosoma ^8. In alternativa, ottenere schistosoma topi infettati dal Resource Center NIAID schistosomiasi ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). Lasciare topi di 6-7 settimane dopo l'infezione, per cui il tempo-punto, le uova sono presenti nel fegato e può essere recuperato come descritto di seguito (vedi Fig. 1).
2. Euthanize topi con CO _2, e bagnare con il 70% di etanolo. Posizionare il mouse sul retro. Utilizzare pinze smussate e forbici per tagliare via la pelle e del peritoneo sottostante. Excise il fegato, che si trova sotto la gabbia toracica e del diaframma.
3. Finemente macinata fegati e aggiungere 20 ml per fegato di miscela di digestione, composta di collagenasi / dispasi (0,5 mg / ml), penicillina (100 U / ml) e streptomicina (100 ug / ml) in PBS. Mettere MIXTure in una provetta da 50 ml Falcon ed incubare una notte a 37 ° C shaker.
4. Centrifugare miscela a 400 xg / 3 min / 20 ° C. Delicatamente versare il liquido in eccesso e riempire tubo con PBS. Centrifugare e ripetere lavaggio PBS. Dopo l'ultima centrifugazione, Risospendere il pellet in 25 ml di PBS.
5. Filtrare il sedimento risospeso attraverso un filtro metallico standard di cucina (usare una siringa da 50 ml stantuffo per schiacciare i pezzi di fegato attraverso in un bicchiere di vetro), seguita da passare la miscela attraverso un setaccio fine (utilizzare siringa da 10 ml per spingere miscela attraverso il setaccio fine in un bicchiere di vetro secondo).
6. Mettere impasto strained in una provetta da 50 ml Falcon. Centrifugare a 400 xg / 5 min / 20 ° C. Versare con cautela out surnatante senza perdere pellet. Risospendere il pellet in 3 ml di PBS.
7. Overlay mescolare delicatamente su un Percoll 20%, 40 mL di gradiente Percoll 8 ml e 32 ml di saccarosio 0,25 M (FW = 342,3 così 8,56 g sucrose/100 mL H ₂ 0).
8. Centrifugare 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipettare fuori unod scartare gelatinoso strato superiore delle cellule epatiche. Rimuovere uovo pellet in basso con una pipetta di trasferimento e messo in una provetta da 15 ml Falcon.
9. Wash 3X pellet in 10 ml di PBS / EDTA 1 mM / 1 mm impostazioni centrifuga EGTA utilizzando: 3 min / 30 xg / 20 ° C. Risospendere in 500 pl PBS.
10. Mix Overlay su una nuova Percoll 25%, 10 mL gradiente (2,5 ml di Percoll e 7,5 mL saccarosio 0,25 M) utilizzando le impostazioni centrifuga: 10 min / 800 xg / 20 ° C.
11. Lavare 3 volte in 10 ml di PBS utilizzando le impostazioni di centrifuga: 3 min / 30 xg / 20 ° C.
12. Negli ultimi 10 mL di lavaggio, rimuovere 100 ul per contare le uova. Uova risolvere rapidamente, in modo che il tubo Falcon devono essere miscelati bene prima di rimuovere campione. Diluire il campione da 100 ml con 900 microlitri di PBS. 100 microlitri della miscela dovrebbe essere considerato come gocce su un vetrino da microscopio utilizzando un microscopio da dissezione (diluizione 1:10). Wide-foro puntali devono essere utilizzati.
13. Risospendere uova a 50.000 uova / ml in PBS. Le uova possono essere conservati per alcuni mesi a -80 ° C e scongelato una o TWICe per l'uso. Prima dell'uso, ispezionare sotto un microscopio per garantire che le uova sono ancora intatte (vedi fig. 1).

2. Sensibilizzazione intraperitoneale con S. Uova mansoni: Giorno 0

1. Preparare le uova a 5.000 pl eggs/100 PBS in una provetta da 5 mL snapcap. Per l'iniezione, stimano uova 50% più del necessario.
2. Caricare un ago da 23 gauge ^3/4inch e una siringa da 1 ml con 100 microlitri di sospensione uovo al mouse. Uova risolvere, in modo da aghi di carico con le uova immediatamente prima dell'utilizzazione.
3. Roccia siringa avanti e indietro per mescolare le uova prima di ogni iniezione, e iniettare per via intraperitoneale 100 microlitri di sospensione per mouse.

3. Retro-orbitale sfida endovenosa con S. Uova mansoni: Giorno 14

1. Preparare le uova di cui sopra a 5.000 eggs/100 pl.
2. Anestetizzare topi in camera specializzata con isofluorano (4%), o intraperitoneale con xilazina (10 mg / kg) e ketamina (120 mg / kg). Profondità di Anesthesia è determinato dal pizzicamento della zampa e garantendo l'assenza di risposta fisica.
3. Dopo il caricamento della siringa da 1 ml e 23 gauge ^3/4inch con uova, utilizzare forcipe per piegare l'ago con un angolo di 90 ° con la smussatura rivolta verso il basso l'angolo. Assicurarsi che non siano presenti bolle.
4. Posizionare il mouse su un lato. Ritrarre la pelle in modo da sporgere occhio, e iniettare 100 microlitri nei vasi dietro il bulbo oculare in un angolo di 45 ° al naso.
5. Ritirare l'ago ed applicare una leggera pressione per controllare l'emorragia.

Tutte queste procedure deve essere eseguita con cura, e topi deve essere monitorata fino recupero dall'anestesia. Questi protocolli sono stati approvati dalla University of Pennsylvania Institutional Animal Care e del Comitato uso (IACUC).

4. Sperimentale Vendemmia: Day 22

1. Euthanize topi con CO _2.
2. Bagnare con il mouse etanolo al 70%, e il luogo sul retro.
3. Utilizzando blunt forceps, afferrare l'addome del mouse e fare una piccola incisione nella pelle. Rimuovere con cura la pelle con le forbici ed esporre la gabbia toracica e del peritoneo.
4. Tagliare il peritoneo. Tagliare il aorta addominale di recuperare il sangue con una pipetta Pasteur. Conservare su ghiaccio.
5. Spostare il fegato giù per esporre il diaframma. Usare le forbici per tagliare sottili il diaframma. Tagliare con cautela aperta la gabbia toracica per esporre il tessuto polmonare.
6. Recuperare i linfonodi che drenano parathymic il polmone con una pinza fine. Questi sono infilato sotto la gabbia toracica, su entrambi i lati del timo ^9. Conservare il ghiaccio in 1mL mezzi sterili (DMEM supplementato con 10% inattivato al calore siero di vitello fetale, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 2 mM L-glutammina, 50 pM 2-mercaptoetanolo, tutti disponibili da Invitrogen).
7. Per recuperare il BAL, e gonfiare i polmoni per l'analisi istologica, l'intubazione endotracheale deve essere eseguita. Esporre la trachea spostando le ghiandole salivari di lato, e placing pinza sottile sotto la trachea. Utilizzando forbici sottili, tagliare un foro al centro della trachea, e inserire tubi nei polmoni. Fissare tubi legando con filo chirurgico.
8. Fissare PBS-riempita siringa da 1 ml al tubo e gonfiare i polmoni con 1 ml di PBS. Lavare accuratamente recuperare BAL con la siringa. Conservare su ghiaccio.
9. Attaccare 4% paraformaldeide (PFA) in PBS-riempita siringa da 1 ml per il tubo e gonfiare i polmoni.
10. Rimuovere il tubo, e serrare il filo chirurgico per prevenire le infiltrazioni della PFA.
11. Analizzare attentamente le tessuto polmonare e posto in una provetta Falcon 50 ml con 5 ml 4% PFA.

5. Preparazione dei tessuti recuperati

1. Siero: memorizzazione seguito su ghiaccio per 30 minuti a 2 ore alla coagulazione del sangue, siero viene recuperato dal sangue mediante centrifugazione (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Il siero è conservato a -20 ° C e può essere utilizzato per l'ELISA citochine o S. mansoni uovo antigene-specifica isotipo IgG ELISA
2. Linfonodi: sospensioni di cellule singole sono preparati e conta delle cellule utilizzate per valutare l'entità della risposta immunitaria. Per esaminare la polarizzazione delle cellule Th2, le cellule vengono ri-stimolate con S. mansoni antigene uovo per 72 ore. Colorazione Intracellar citochina può essere esaminata mediante citometria di flusso, e supernatanti può essere recuperato e conservato a -20 ° C per ELISA di citochine Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) ^6.
3. BAL: Le cellule sono pellettizzato (400 xg / 5 min / 4 ° C). BAL viene recuperato e conservato a -20 ° C per l'analisi di citochine Th2 mediante ELISA. BAL conteggi celle vengono utilizzate come un visualizzatore per infiammazione delle vie aeree. Preparazioni di citocentrifuga 10,000-100,000 cellule (500 giri / min 5/4 ° C), seguita da colorazione Diffquik consentirà enumerazione di infiltrato infiammatorio ^{4, 6.} In alternativa, le cellule BAL può essere esaminata mediante citometria di flusso ^6.
4. Tessuto polmonare: il tessuto polmonare è stored notte a 4 ° C. Tessuto fissato è incluso in paraffina, sezionati e montati su vetrini per l'analisi istologica ed immunofluorescenza.

6. Risultati rappresentativi

Questo protocollo dettagli tutti i passaggi necessari per (i) la preparazione purificata Schistosoma mansoni uova per uso in vivo (Fig. 1), (ii) sensibilizzare e sfidare i topi con queste uova e (iii) recuperare gli organi per l'esame della risposta infiammatoria del polmone. Questo modello in vivo guida riproducibile una potente risposta infiammatoria polmonare Th2. Ciò è dimostrato da infiammazione delle vie aeree e come eosinofilia visualizzati tramite conta delle cellule del BAL e preparati citocentrifuga (Fig. 2). H & E-colorate sezioni polmonari possono essere esaminati per l'egg-indotta granulomi (Fig. 3a), e la colorazione di immunofluorescenza delle sezioni polmonari permette la visualizzazione di macrofagi attivati ​​alternativamente e Th2 citochine indotte geni come resistenzatin-come molecola (RELM) α (Fig. 3b). L'antigene-specifica risposta citochina Th2 CD4 viene esaminata da ELISA per IL-5, IL-4 e IL-13-antigene di cellule stimolate parathymic linfonodi (Fig. 4).

Figura 1 Schistosoma mansoni modello iniezione di uova foto rappresentativi di fegato granulomatose, caratteristiche di alta S.mansoni-uovo oneri, e di uova S.mansoni sono mostrati -.. Dimensione media (L) 120 micron (da W) 50 pm.

Figura 2. S. mansoni iniezione di uova guida infiammazione delle vie aeree. A. Numero di cellule BAL (x10 ⁵⁾ da naïve (N) o S.mansoni (Sm) uovo iniettato nei topi. * P <0,05. B. citocentrifuga preparazione di cellule BAL. Mac, macrofagi; Eos, eosinofili, LINFA, linfociti. Bar, 10 micron.

Figura 3. Visualizzazione di granulomi polmonari e macrofagi attivati ​​alternativamente che circondano l'uovo S.mansoni. A. Granuloma polmonare che circonda l'uovo Sm (freccia nera) è stata visualizzata in H & E-colorate sezioni polmonari. B. colorazione per immunofluorescenza RELMα (verde), recettore del mannosio (rosso) e DAPI (blu) rivela in alternativa macrofagi attivati ​​(freccia bianca) nel granuloma che circonda la autofluorescente Sm uovo (freccia nera). Bar, 50 pm.

Figura 4. S.mansoni uovo antigene-specifica risposta delle citochine Th2. Drenante parathymic cellule linfonodi di topi naïve (N) o uova Sm-iniettata sono state stimolate con Sm </ Em> antigene uovo per 72 ore, seguita da ELISA di supernatanti per IL-4, IL-5 e IL-13. Scala, ng / mL. * P <0,05.

Qui, un modello che impiega le uova Schistosoma mansoni di indurre l'infiammazione polmonare di tipo 2 viene descritto. Tratti caratteristici di questo modello includono il potente risposta immunitaria Th2, infiammazione delle vie aeree e la formazione di granuloma polmonare. Dal momento che questi parametri dipendono le risposte delle cellule CD4 Th2 ^11, questo è un modello utile per studiare gli effetti delle cancellazioni proteine ​​specifiche o lineage-specifica sulle risposte delle cellule Th2. Qui le letture includerebbe quantificazione di citochine Th2 antigene-specifici, analisi del infiltrazione di cellule nelle vie aeree, e la dimensione dei granulomi polmonari. Un ulteriore parametro che può essere misurata è uovo indotta fibrosi ^12. Questo è misurato dalla colorazione delle uova iniezione sezioni polmonari con tricromica di Masson, che permette la visualizzazione della deposizione di collagene che si verifica intorno alle navi, le vie respiratorie, e all'interno del granuloma (mostrata in ^6).

Sebbene questo protocolo impiega S. mansoni uova, una limitazione di questo modello è che non si riproduce S. mansoni infezione, che viene eseguito da infettando topi con cercarie infettiva. Tuttavia, i vantaggi di questo modello è la convenienza per l'impostazione, e che non vi è alcun rischio di infezione del ricercatore. Dopo la purificazione, le uova possono essere convenientemente congelare e utilizzare diversi mesi dopo. Una volta scongelato, le uova non sono contagiosi e possono quindi essere gestiti più facilmente le uova vivi, o cercarie infettiva. Nel preparare le uova per l'iniezione, si deve assicurare che le uova siano integri mediante ispezione al microscopio. Per minimizzare i disagi uovo, ampio foro puntali e aghi deve essere utilizzato durante la manipolazione, e pipettaggio di uova solo quando necessario. Dal momento che le uova risolvere rapidamente, è anche fondamentale per ri-sospensione dal dolce dondolio prima di contare o per via parenterale.

Anche se le uova purificati possono essere congelati, fegato infetti devono essere trattatiimmediatamente per la purificazione di successo di uova. Poiché la gravità dell'infezione, e il numero di uova presenti nel fegato di topo sono ceppo-dipendente, i punti temporali per il recupero delle uova e uova rese variano dal usati i topi. Qui svizzero-Webster femmine sono state usate, e sacrificati a 6-7 settimane dopo l'infezione per la generazione di 10,000-30,000 uova / fegato. Come un utile riferimento, Cheever et al. dettaglio gli oneri fegato a base di uova in ¹³ diversi ceppi di topi.

L'iniezione di uova non induce mortalità. Tuttavia, i topi possono soccombere se over-anestetizzato, se il preparato uovo non viene lavato accuratamente (come specificato nel protocollo), o se l'iniezione di uova provoca gravi emorragie. Un'alternativa al retro-orbitale iniezione è vena della coda iniezione delle uova. Ciò comporta anche un potente uovo indotta la risposta infiammatoria del polmone ^3. Tutte queste procedure deve essere eseguita con cura, e topi deve essere monitorata fino recupero dall'anestesia.

In conclusione, questa iniezione protocollo dettagli di S. mansoni uova per l'induzione di infiammazione polmonare e risposte di cellule Th2, ed è applicabile per lo studio di elminti indotta infiammazione, asma, allergie e malattie fibrotiche.