Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

1,2, 1, 2, 1,2, 1, 1, 1, 1, 2, 1

1Laboratory of Experimental Hematology, University of Antwerp, 2Bio Imaging Lab, University of Antwerp

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Neuroscience. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 50.19.155.235, User IP: 50.19.155.235, User IP Hex: 840145899

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

De Vocht, N., Reekmans, K., Bergwerf, I., Praet, J., Hoornaert, C., Le Blon, D., et al. Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice. J. Vis. Exp. (64), e3906, doi:10.3791/3906 (2012).

Abstract: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

خلال العقد الماضي، وقد اكتسب زرع الخلايا الجذعية اهتماما متزايدا كما علاجيا الابتدائية أو الثانوية لمجموعة متنوعة من الأمراض، سواء في الدراسات قبل السريرية والسريرية. لكن، حتى الآن نتائج بشأن نتائج وظيفية و / أو تجديد أنسجة الخلايا الجذعية زرع التالية هي متنوعة جدا. عموما، يلاحظ وجود فائدة سريرية من دون فهم عميق لآلية الكامنة (ق) 1. ولذلك، أدت جهود متعددة لتطوير مختلف طرائق التصوير الجزيئي لرصد الخلايا الجذعية ترقيع مع الهدف النهائي لتقييم بدقة البقاء على قيد الحياة، ومصيرها وعلم وظائف الأعضاء من الخلايا الجذعية المطعمة و / أو البيئة الصغيرة الخاصة بهم. قد تكون متعلقة التغييرات الملحوظة في واحد أو أكثر من المعلمات التي تحددها التصوير الجزيئي للتأثير على سريري المرصودة. في هذا السياق، لدينا دراسات تركز على الجمع بين استخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI)، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتحليل النسيجيق لتقييم الخلايا الجذعية التطعيم.

ويشيع استخدام BLI إلى غير جراحية تنفيذ تتبع ورصد خلية خلية بقاء على قيد الحياة في الوقت المناسب بعد زرع 2-7، على أساس رد الفعل البيوكيميائية حيث الخلايا التعبير عن الجينات luciferase المراسل الصحفي، هي قادرة على التفاعل ينبعث ضوء التالية مع ركيزة لها (مثل D- luciferin) 8 و 9. التصوير بالرنين المغناطيسي من ناحية أخرى هو أسلوب غير الغازية التي تنطبق سريريا (10) ويمكن استخدامها لتحديد بدقة ترقيع الخلوية مع دقة عالية جدا 11-15، على الرغم من حساسيتها يعتمد بشكل كبير على النقيض من ولدت بعد وضع العلامات الخلية مع وكيل النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي . أخيرا، بعد الوفاة تحليل النسيجي هو الأسلوب المفضل للتحقق من صحة نتائج البحوث التي تم الحصول عليها مع المنظمات غير الغازية التقنيات مع أعلى دقة وحساسية. وعلاوة على ذلك نقطة النهاية تحليل النسيجي يسمح لنا لإجراء تحليل مفصل المظهري من الخلايا المطعمة و / أو الأنسجة المحيطة بها، على درجة البكالوريوسالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على استخدام البروتينات مراسل فلوري و / أو وضع العلامات الخلية مباشرة مع أجسام مضادة محددة.

وباختصار، نحن هنا شرح بصريا التكامل بين BLI، التصوير بالرنين المغناطيسي والأنسجة لكشف مختلف الخلايا الجذعية و / أو البيئة، المرتبطة بالخصائص التالية الخلايا الجذعية التطعيم في الجهاز العصبي المركزي من الفئران. كمثال على ذلك، نخاع العظام المستمدة من الخلايا اللحمية، المهندسة وراثيا للتعبير عن الأخضر نيون تعزيز البروتين (eGFP) ويراعة luciferase المراسل (fLuc)، وصفت مع الأزرق فلوري ميكرون الحجم جسيمات أكسيد الحديد (MPIOs)، سيتم زرعها في وسيتم رصد الجهاز العصبي المركزي من المناعة المختصة الفئران والنتيجة بواسطة BLI، التصوير بالرنين المغناطيسي وعلم الأنسجة (الشكل 1).

Protocol: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

1. خلية التحضير

  1. وينبغي البدء في التجارب باستخدام الخلايا الجذعية خارج الحي مثقف السكان وراثيا للتعبير عن البروتينات مراسل luciferase وeGFP. هنا نستخدم luciferase المراسل / eGFP في التعبير عن الفئران نخاع العظام المستمدة من الخلايا اللحمية (BMSC-Luc/eGFP) سابقا كما وصفها Bergwerf وآخرون. 2 و 5.
  2. قبل يومين من وضع العلامات الخلية، وخلايا BMSC-Luc/eGFP لوحة في كثافة 8 × 5 10 خلايا لكل قارورة ثقافة T75 في 15 مل المتوسطة توسيع كاملة (CEM) تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل Puromycine.
  3. السماح للخلايا أن تنمو لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  4. إضافة 5 × 10 6 الجليدية الزرقاء أكسيد الحديد ميكرون الحجم الجسيمات (GB MPIO) في ثقافة المتوسط ​​مل للثقافة الخلية متزايد (المجموع: 75 × 10 6 جزيئات لكل 15 مل الثقافة المتوسطة في قارورة ثقافة T75).
  5. احتضان لمدة 16 ساعة للسماح امتصاص الجسيمات عن طريق الإلتقام.
  6. يغسل الجسيمات المتبقيةوالسماح للخلايا أن تنمو لمدار 24 ساعة إضافية للحصول على توزيع الخلية confluency ومتجانسة من MPIO غيغابايت.
  7. التحقق من صحة امتصاص الجسيمات بصريا باستخدام المجهر مضان من قبل احتساب نسبة من + eGFP وGB الخلايا MPIO + إلى المبلغ الإجمالي للخلايا + eGFP.
  8. غسل خلايا GB BMSC-Luc/eGFP MPIO المسمى مرتين مع برنامج تلفزيوني مل (10) والخلايا بعد الحصاد التربسين-EDTA علاج (5 مل لكل قارورة ثقافة T75 لمدة 5 دقائق).
  9. غسل خلايا المقطوع وresuspend في تركيز النهائي من 133 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني.
  10. حفاظ على الخلايا على الجليد حتى الزرع.

2. زرع الخلايا في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

  1. تخدير الفئران عن طريق حقن داخل الصفاق من الكيتامين (80 ملغ / كلغ) + زيلازين (16 ملغ / كلغ) خليط.
  2. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للفئران لتغفو.
  3. حلق الرأس الماوس للسماح للتلاعب العقيمة.
  4. ضع الماوس في إطار المجسم.
  5. Desinfect للالجلد ورطب أعين الفئران لمنع الجفاف.
  6. جعل فروة الرأس شق خط الوسط لفضح الجمجمة، وحفر حفرة في الجمجمة باستخدام الأسنان لدغ الحفر في الإحداثيات الممنوحة: 2 مم و 2 مم الخلفي الجانبي لBregma.
  7. دوامة تعليق خلية لفترة وجيزة، ونضح على تعليق خلية في المحقنة.
  8. وضع إبرة الحقنة على عمق 2.5 ملم تحت الجافية والسماح للموازنة الضغط لمدة 1 دقيقة.
  9. حقن لمدة 3 تعليق خلية ميكروليتر (4 × 10 5 خلايا) على عمق 2 ملم تحت الجافية وبسرعة 0.70 ميكروليتر / دقيقة باستخدام الآلية الدقيقة مضخة حقن.
  10. الانتظار للحصول على 5 دقائق إضافية لمنع ارتجاعي لتعليق الخلية حقن.
  11. التراجع ببطء الإبرة وتطهير الحدود الجلد قبل خياطة الجلد.
  12. حقن 300 ميكروليتر حل كلوريد الصوديوم 0.9٪ تحت الجلد لمنع جفاف، ووضع الماوس تحت مصباح التدفئة للتعافي من التخدير. إدارة عمعاهدة الفضاء الخارجي للعمليات الجراحية مسكن وفقا للمعايير المؤسسية.

3. في ضوء بارد فيفو

  1. تخدير الفئران من خلال مزيج من 3٪ isoflurane والأوكسجين.
  2. وضع الفئران في تصوير فوتون وخفض مستوى التخدير إلى 1.5٪ isoflurane والأوكسجين.
  3. حقن 150 ملغ D-luciferin لكل كيلوغرام من وزن الجسم عن طريق الوريد.
  4. الحصول على صورة لمدة 5 دقائق باستخدام برنامج رؤية الصورة.
  5. أداء معالجة الصور باستخدام برنامج M3vision. قياس إشارة المرصودة باستخدام مناطق محددة من الفائدة.

4. في فيفو التصوير بالرنين المغناطيسي

  1. تخدير الفئران مع 3٪ isoflurane في خليط من O 2: N 2 O (3:7).
  2. وضع الفئران في restrainer نظام أفقي MR 9.4T وخفض مستوى التخدير إلى 1٪ isoflurane في خليط من O 2: N 2 O (3:7).
  3. الرطب أعين الفئران لمنع dehydraنشوئها، ونعلق تحقيقا المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم ورصد معدل التنفس عن طريق وضع جهاز استشعار تحت بطن الفأرة.
  4. الحفاظ على معدل التنفس عند 110 ± 10 نفسا في الدقيقة والحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة ضمن نطاق ضيق من 37 ± 0.5 درجة مئوية.
  5. وضع لفائف الترددات اللاسلكية على سطح قمة الرأس الماوس وموقف الماوس في منتصف المغناطيس.
  6. الحصول على مجموعة من 10 الاكليلية الصور تدور T2 المرجحة (جنوب شرق) صدى للحصول على معلومات تشريحية محددة وT2 * المرجحة الانحدار الصور الصدى (GE)، من أجل دراسة الخلية الجذعية الهجرة مع قرار في الطائرة من 70 ميكرون 2. تعيين المعلمات تسلسل على النحو التالي: وقت تكرار (TR): 500 مللي، صدى الوقت (TE): 8 مللي ثانية (GE تسلسل) ومرة ​​تكرار (TR): 4200 مللي، صدى الوقت (TE): 12،16 مللي (SE تسلسل)؛ مجال الرؤية (FOV): 18x18 مم 2، مصفوفة: 256x256، شريحة سمك 1 مم و 1 فصل شريحة ملم (5.1 Paravision البرمجيات).
  7. أداء معالجة البياناتباستخدام أميرة 4.0 البرمجيات.

5. علم الأنسجة بعد الوفاة

  1. تخدير الفئران عميقا جدا عن طريق الاستنشاق من الأوكسجين isofluorane (4٪)، (0.5 لتر / دقيقة) والنيتروجين (1 لتر / دقيقة) الخليط لمدة 2 دقيقة. التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم.
  2. إزالة دماغ الفأر من الجمجمة ويحملق في أنسجة المخ في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة.
  3. يذوى أنسجة المخ من خلال وضع الدماغ في وقت لاحق في تدرجات مختلفة من السكروز: 2 ساعة في السكروز بنسبة 5٪ في برنامج تلفزيوني، 2 ساعة في السكروز 10٪ في برنامج تلفزيوني، بين عشية وضحاها في السكروز 20٪ في برنامج تلفزيوني.
  4. تجميد أنسجة المخ باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في الأنسجة في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء.
  5. قسم نسيج الدماغ في المادتين 10 ميكرون سميكة باستخدام ناظم البرد.
  6. غير ملوثين شاشة cryosections لمضان الزرقاء من الجزيئات MPIO غيغابايت ومضان أخضر من الخلايا eGFP تعبير باستخدام مجهر مضان.
  7. غير ملوثين شاشة cryosections للأخضر / أحمر مضان الخلفية من الخلايا الالتهابية.
  8. إجراء مزيد من stainings المناعى ومناعي لتحديد السكان الخلية الذاتية (على سبيل المثال الخلايا الدبقية الصغيرة، النجمية، خلايا تي، ...) التي تتفاعل مع الطعوم الخلوية.

6. ممثل النتائج

نحن هنا قدم بصريا تسلسل الأحداث الأمثل للتصوير المتعدد الوسائط بنجاح luciferase المراسل / eGFP في التعبير عن السكان الخلية (الجذعية) في الجهاز العصبي المركزي من الفئران. في البداية، ووصف وضع العلامات النتائج MPIO إجراء جيجابايت في وضع العلامات ذات كفاءة عالية من الخلايا BMSC-Luc/eGFP، والتي يمكن بسهولة يمكن التحقق من صحة باستخدام المجهر مضان (الشكل 2A). المقبل، على تطعيم MPIO GB المسمى BMSC-Luc/eGFP في الجهاز العصبي المركزي من الفئران، ويمكن رصدها من البقاء على قيد الحياة والكسب غير المشروع من قبل الخلوية في الجسم الحي BLI استنادا luciferase النشاط (2B الشكل). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن رصد التعريب الدقيق للخلايا في الجسم الحي من قبل المطعمة (الشكل 2C). أخيرا، التحليل النسيجي يسمح المصادقة على النتائج التي حصل عليها BLI والتصوير بالرنين المغناطيسي. وأكد بقاء مستقر من خلال التعبير eGFP مستقر في الوقت المناسب (الشكل 2D). لهذا، colocalization من eGFP في التعبير عن الخلايا مع MPIO فلوري أزرق يسمح لتحديد الدقيق للتوطين، والبقاء على قيد الحياة من الخلايا المطعمة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الوسم المزدوج فلوري من الخلايا الجذعية يقلل من احتمال لمراقبة نتائج إيجابية كاذبة على أساس مضان الخلفية التي أنشأتها الخلايا الالتهابية 5.

الشكل 1.
الشكل 1. نظرة عامة على التعامل مع تسلسل

  1. وسم الخلية: وصفت BMSC-Luc/eGFP مع 5 × 10 6 جزيئات MPIO غيغابايت في وسط ثقافة مل. بعد 16 ساعة من الحضانة وفترة راحة التالية من 24 ساعة، ويتم حصاد الخلايا لغرس داخل المخ.
  2. زرع الخلية: GB MPIO المسمى والمطعمة BMSC-Luc/eGFP في مخ الفأر في الإحداثيات التالية: bregma -2 مم، 2 مم حق من خط الوسط و2 مم تحت الجافية.
  3. في BLI فيفو: الوريد وعقب 150 ملغ D-luciferin/kg وزن الجسم، وكانت الشركة قد ولدت على ضوء خلال 5 دقائق باستخدام جهاز التصوير فوتون.
  4. التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي: تم الحصول على مجموعة من 10 الاكليلية الصور تدور T2 المرجحة (جنوب شرق) الصدى وT2 * المرجحة صدى الانحدار الصور (GE) مع قرار في الطائرة من 70 ميكرون 2. تسلسل المعلمات على النحو التالي: وقت تكرار (TR): 500 مللي، صدى الوقت (TE): 8 مللي ثانية (GE تسلسل) ومرة ​​تكرار (TR): 4200 مللي، صدى الوقت (TE): 12،16 مللي (SE تسلسل)؛ مجال الرؤية (FOV): 18x18 مم 2، مصفوفة: 256x256، شريحة سمك 1 مم و 1 مم فصل شريحة.
  5. كما تم عرض cryosection سميك 10μm لeGFP التعبير عن والأزرق fluorescently المسمى يو BMSC: بعد الوفاة الأنسجةالغناء المجهر مضان.

الشكل 2.
التصوير المتعدد الوسائط الرقم 2. من ترقيع الخلايا الجذعية

  1. المجهري المناعي المباشر من الجليدية MPIO (GB) الأزرق المسمى BMSC-Luc/eGFP.
  2. في BLI المجراة من حقن الفئران مع 4x10 5 غيغابايت المسمى MPIO الخلايا BMSC-Luc/eGFP في الاسبوع 1 و 2 بعد أسبوع التوطين. التحليل الإحصائي للإشارات BLI الكشف في الاسبوع 1 و 2 أسبوع بعد الزرع. يتم التعبير عن البيانات كما بلغ متوسط ​​عدد الفوتونات في الثانية لكل ستيراديان لكل سنتيمتر مربع (الرقم الهيدروجيني / S / ريال / سم 2) من فترة زمنية 5 دقائق + / - خطأ معيار محسوب من منطقة محددة من الاهتمام لدى الفئران مما يدل على إشارة واضحة BLI في موقع الحقن.
  3. الاكليلية ثنائية الأبعاد التصوير بالرنين المغناطيسي من MPIO GB المسمى BMSC-Luc/eGFP (اللوحة اليسرى: (ط) T2 المرجحة صورة صدى تدور و (ب) T2 صدى الانحدار صورة * المرجحة) والخالي من الملصقات BMSC L-جامعة كاليفورنيا / eGFP (لوحة الحق في: (الثالث) صدى تدور T2 المرجحة صورة و (السادس) T2 صدى الانحدار صورة * المرجحة) الطعوم في مخ الفأر.
  4. وصفت تحليل النسيجي للMPIO GB يزرع BMSC-Luc/eGFP في أسبوع 2 في مرحلة ما بعد الزرع. (ط) تحليل المناعي المباشر للتوطين eGFP في التعبير عن وGB ترقيع MPIO BMSC-Luc/eGFP المسمى. (ثانيا) من التفصيل التكبير العليا (ط). وصفت (ثالثا) تلطيخ مناعي للمستضد GFAP، مما يدل على تطور ندبا نجمي في المناطق المحيطة من MPIO GB BMSC-Luc/eGFP. وصفت (السادس) تلطيخ مناعي للمستضد-1 ايبا، مما يدل على الغزو والمناطق المحيطة من MPIO GB BMSC-Luc/eGFP بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول الأمثل لمزيج من ثلاثة طرائق التصوير التكميلية (BLI، التصوير بالرنين المغناطيسي وعلم الأنسجة) لوصف مفصل لعملية زرع الخلايا في الجهاز العصبي المركزي من الفئران المختصة المناعي. مزيج من العلامات الجينية مراسل من الخلايا، على أساس التعديل الجيني للجينات مراسل يراعة luciferase المراسل وeGFP، ووضع العلامات الخلية مباشرة مع MPIO غيغابايت، ويؤدي إلى إجراء تقييم دقيق لترقيع الخلايا الجذعية في الجسم الحي.

لوضع العلامات جسيم من BMSC، يقترح الجسيمات MPIO GB حجم (1.63μm) في تركيبة مع سطح أنيوني (بدائل الكربوكسيل) لتسهيل امتصاص endocytotic هذه الجسيمات من غير أكلة خلايا 16-18. ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن فترة حضانة للحصول على كفاءة عالية الوسم هو نوع من الخلايا التابعة. على سبيل المثال، الخلايا البلعمية (مثل الضامة، والخلايا الجذعية) هي قادرة على استيعاب هذه الجسيمات بسرعة أكبر (فترة حضانة من 0.5 - 1 ساعة) بالمقارنة مع أنواع الخلايا غير phaghocytic (مثل الخلايا الجذعية BMSC أو العصبية)، والتي تحتاج الى فترة حضانة من 16 ساعة والحد الأدنى لوضع العلامات كفاءة. هذا يحتاج إلى أن تؤخذ في الاعتبار أثناء تنفيذ التجارب وضع العلامات الخلية والكفاءة لوضع العلامات وينبغي دائما أن تحدد مقدما باستخدام المجهر مضان و / أو تحليل تدفق cytometric. كما وصفها للسكان الخلية مع MPIOs GB لا تؤثر على بقاء الخلية، تكاثر الخلايا أو النمط الظاهري الخلية 5، مزيج من أكسيد الحديد وfluorophore 1 في هذه الجسيمات يخلق ذلك فرصة مثالية لتصور لهم على حد سواء عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير الضوئي. وعلاوة على ذلك، ونظرا لمحتوى الحديد عالية وكبيرة حجم الجسيمات، ويمكن استخدام الجزيئات MPIO للخلية واحدة واحدة 12،19،20 التصوير جسيم 21 عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي. هذا مثير للاهتمام للغاية عندما يتعلق الأمر الى دراسة هجرة الخلية كما يمكن ملاحظة الخلايا واحدة. ومع ذلك، فإن محتوى الحديد عالية من MPIO غيغابايت تستخدمجسيمات لديها أيضا بعض العيوب عندما تهدف لتحديد الحجم الدقيق للموقع الكسب غير المشروع عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي. محتوى الحديد عالية جدا من MPIOs ليس فقط يخلق التجانس المغناطيسي في موقع الزرع، ولكن أيضا في المناطق المحيطة لزرع الخلايا، مما أدى إلى المبالغة في تقدير حجم عملية الزرع موقع والتمييز أقل دقة بين الخلايا المزروعة والأنسجة المحيطة بها. وبناء على ذلك، ونوع من الجسيمات، ووضع العلامات اللازمة للخلية، وسوف تعتمد على تصميم الدراسة. عندما تهدف إلى تحديد الخلية الجذعية الهجرة، وحساسية عالية جدا، وبالتالي تحتوي على الحديد عالية وستكون هناك حاجة MPIOs. من ناحية أخرى، قد عندما يصوب على توطين دقيقة من ترقيع الخلايا الجذعية، أصغر SPIOs مع محتوى أقل من الحديد يكون بديلا أفضل 22. وعلاوة على ذلك، تولد جزيئات الحديد المقابل سلبي إدخال مشكلة أخرى تتعلق بالتمييز بين الخلايا المزروعة ونزيف الخلية بعد التطعيم. لذلك الكثير من البحث يجريعلى نحو استخدام عوامل التباين إيجابية لوضع العلامات الخلية. بجانب نوع الجسيمات، ونوع من تسلسل المستخدمة لاقتناء التصوير بالرنين المغناطيسي يعتمد أيضا على الهدف من هذه الدراسة. عندما يتم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي لتحديد عملية الزرع للحصول على معلومات دقيقة عن مكان وجود الزرع وحجم الغرسة، وتسلسل T2 (صدى تدور) هو إيجابي، حيث أنه يوفر معلومات التشريحية بدقة عالية. من ناحية أخرى، تسلسل * T2 (تدرج الصدى) هو سلسلة تستخدم لدراسة الهجرة ممكن من الخلايا المطعمة وهذا التسلسل يأخذ في الاعتبار جميع inhomogenities المجال المغناطيسي تقديم أعلى حساسية تجاه مركبات تؤثر على المجال المغناطيسي. هذا التسلسل هو ضروري للغاية عندما يتعلق الامر الى الكشف عن كمية صغيرة من الخلايا التي قد هاجروا من المنطقة المزروعة. باستخدام هذا التسلسل استطعنا أن نستنتج أن الخلايا BMSC-Luc/eGFP لا تهاجر بعد غرس الجسم المخطط في الجهاز العصبي المركزي من الفئران.

في حينالتصوير بالرنين المغناطيسي يوفر بيانات حول توطين زرع الخلية، إضافية BLI تحليل البيانات المتعلقة يوفر خلية بقاء زرع 2،4،11. كما رد الفعل الأنزيمية بين الانزيم luciferase المراسل وluciferin الركيزة يحتاج وجود O 2 و ATP، بل هو أسلوب موثوق بها لدراسة بقاء الخلية. وخلايا نخرية لا تعبر عن انزيم luciferase المراسل وليس O 2 و ATP سيكون حاضرا. وعلاوة على ذلك، والخلايا فقط التعبير عن انزيم luciferase المراسل قادرة على تحفيز رد الفعل، مما يؤدي إلى إنتاج الضوء، التي تشبه الحساسية العالية للتقنية. لا يمكن أن يؤديها BLI بطريقة كمية وذلك لأن كمية الضوء المنتجة يتناسب مع كمية luciferase المراسل في التعبير عن الخلايا. ومع ذلك، اعتبارات هامة يجب أن تؤخذ في الاعتبار أثناء تنفيذ BLI كميا وعدة عوامل أخرى غير مبالغ الخلية يمكن أن تؤثر في مستوى التعبير عن luciferase المراسل أو كمية الضوء الكشف عنها. على سبيل المثال، anesthesiيمكن لمستوى التأثير على انزيم luciferase المراسل و / أو توافر luciferin 23، العوامل المختلفة والمركبات يمكن أن تؤثر على توافر الركيزة و / أو نشاط امتصاص 24-26 أو 27-30 المروج، مما أدى إلى خلافات في الناتج إشارة. وعلاوة على ذلك ويقتصر استخدام BLI إلى الحيوانات الصغيرة كما يتم تقييد هذه التقنية لاختراق النسيج منخفضة من الضوء. وبالتالي، عندما تهدف إلى تنفيذ BLI كمي لمتابعة البقاء على قيد الحياة بعد زرع الخلايا، جميع المعلمات التي تؤثر ربما اختلافات إشارة يجب أن يوضع وفقا لمعايير ممكن. على سبيل المثال، عمق زرع الطعوم الخلوية والتخدير مستوى ومسار إدارة / كمية من الركيزة تدار من قبل اكتساب BLI، الحلاقة المناسب للجلد الحيوان، الخ.

مع الأخذ في الاعتبار ما ورد أعلاه من المزايا والعيوب المذكورة من التصوير الجزيئي، والنتائج التي تم الحصول عليها دائما بحاجة إلى أن التصديق عليها من قبل التحليل النسيجي. فاريو هناويمكن لنا الظواهر الخلوية والتفاعلات الخلوية بين أنواع مختلفة من الخلايا يمكن تصور مع آخر بالغ الحساسية بعد الوفاة. على الرغم من أن هذه التقنية هي أداة التحقق من صحة الاختيار، فإن وجود مضان الخلفية التي أنشأتها الخلايا الالتهابية المحيطة و / أو غزو موقع الكسب غير المشروع تحتاج إلى النظر فيها، لأن ذلك قد يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة. ومع ذلك، فإن استخدام العلامات مزدوج مع جين مراسل فلوري، مثل eGFP، وتحقيقا فلوري، مثل MPIO غيغابايت، ويقلل من احتمال عدم التعرف (الخلايا المطعمة أي يجب عرض كل fluorescences محددة، دون عرض مضان الخلفية في ضوء غير ذي صلة قنوات).

يلخص، في حين BLI هي تقنية فريدة من نوعها لرصد بقاء الخلية في الوقت المناسب بطريقة كمية مع حساسية عالية جدا ولكن القرار منخفضة، والتصوير بالرنين المغناطيسي هو تقنية من خيار للتغلب على قرار منخفض حصل مع BLI. مزيج من هذه techni في الجسم الحيسؤال كان يجعل ما يكفي من المعلومات حول البقاء على قيد الحياة وتوطين الخلايا المطعمة في الجسم الحي بطريقة غير الغازية. أخيرا، يمكن بسهولة التفاعلات الخلوية الكسب غير المشروع مع الأنسجة المحيطة و / أو خلايا التهابية داخلية يمكن رصدها باستخدام الأنسجة بعد الوفاة. على الرغم من أن، في هذه اللحظة، وهذا الأخير لا يزال يتعين القيام به من قبل التحليل النسيجي، والتحديات الرئيسية في المستقبل أن يكون لتحسين القائمة في طرائق فيفو التصوير الجزيئي للسماح في الوقت الحقيقي وتقييم المعلمات مع قرار مماثل وحساسية كما تم الحصول عليها باستخدام تحليل النسيجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

Materials: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Lonza Inc. BE12-722F Component of the cell growth medium CEM
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 10270-106 Component of the cell growth medium CEM
Horse serum GIBCO, by Life Technologies 1605-122 Component of the cell growth medium CEM
Penicillin-streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140 Component of the cell growth medium CEM
Fungizone GIBCO, by Life Technologies 15290-018 Component of the cell growth medium CEM
PBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Puromycine Invitrogen ant-pr-1
trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300
GB MPIO Bangs Laboratories ME04F/7833
D-luciferin Promega Corp. E1601
Ketamine (Ketalar) Pfizer Pharma GmbH
Xylazine (Rompun) Bayer AG
Isoflurane Isoflo 05260-05
0.9% NaCl solution Baxter Internationl Inc.
paraformaldehyde Merck & Co., Inc. 1.04005.1000
sucrose Applichem A1125
Micro-injection pump KD scientific KDS100
Photon imager Biospace Lab
9.4T MR scanner Bruker Corporation Biospec 94/20 USR
BX51 microscope Olympus Corporation BX51
Mycrom HM cryostat Prosan HM525
syringe Hamilton Co 7635-01
30 gauge needle Hamilton Co 7762-03
Photo Vision software Biospace Lab
M3vision software Biospace Lab
Paravision 5.1 software Bruker Corporation
Amira 4.0 software Visage Imaging

References: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

  1. Rodriguez-Porcel, M., Wu, J.C., & Gambhir, S.S. Molecular imaging of stem cells. (2008).
  2. Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B., et al. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).
  3. Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N., et al. Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
  4. Bradbury, M.S., Panagiotakos, G., Chan, B.K., et al. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
  5. De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G., et al. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol., (2011).
  6. Reekmans, K., Praet, J., Daans, J., et al. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev., (2011).
  7. Reekmans, K.P., Praet, J., De Vocht, N., et al. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice? Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
  8. Contag, C.H. & Bachmann, M.H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
  9. Sadikot, R.T. & Blackwell, T.S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 537-540, 511-532 (2005).
  10. Sykova, E., Jendelova, P., & Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
  11. Daadi, M.M., Li, Z., Arac, A., et al. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat brain. Mol. Ther. 17, 1282-1291 (2009).
  12. Heyn, C., Ronald, J.A., Ramadan, S.S., et al. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
  13. Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
  14. Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J., et al. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
  15. Modo, M., Mellodew, K., Cash, D., et al. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
  16. Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I., et al. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
  17. Mailander, V., Lorenz, M.R., Holzapfel, V., et al. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
  18. Modo, M., Hoehn, M., & Bulte, J.W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
  19. Hinds, K.A., Hill, J.M., Shapiro, E.M., et al. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
  20. Shapiro, E.M., Sharer, K., Skrtic, S., et al. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
  21. Shapiro, E.M., Skrtic, S., Sharer, K., et al. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
  22. Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T., et al. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
  23. Szarecka, A., Xu, Y., & Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
  24. Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L.O., et al. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
  25. Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T.J., et al. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
  26. Zhang, Y., Bressler, J.P., Neal, J., et al. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
  27. Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E., et al. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
  28. Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R., et al. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
  29. Krishnan, M., Park, J.M., Cao, F., et al. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
  30. Svensson, R.U., Barnes, J.M., Rokhlin, O.W., et al. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).

Ask the Author: التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter