Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

1. Preparación de la célula

1. Los experimentos se debe iniciar con ex vivo de células madre cultivadas de poblaciones genéticamente modificadas para expresar las proteínas reportero luciferasa y eGFP. Aquí se utiliza luciferasa / eGFP expresando murinos derivados de médula ósea células del estroma (BMSC-Luc/eGFP) como se ha descrito por Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. Dos días antes de marcado de la célula, las células de la placa BMSC-Luc/eGFP a una densidad de 8 x 10 ⁵ células por matraz de cultivo T75 en 15 ml de medio de expansión completa (CEM), suplementado con 1 mg / ml Puromycine.
3. Permiten a las células a crecer durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO _2.
4. Añadir 5 x 10 ⁶ azul glacial micras de tamaño de partículas de óxido de hierro (GB MPIO) por medio de cultivo ml para el cultivo celular cada vez más (total: 75 x 10 ⁶ partículas por 15 ml de medio de cultivo en un frasco de cultivo T75).
5. Incubar durante 16 horas para permitir la captación de partículas a través de la endocitosis.
6. Eliminar las partículas que quedany permitir que las células crecen para un período adicional de 24 h para obtener la distribución de células confluencia y homogénea de la MPIO GB.
7. Validar la captación de partículas visualmente utilizando microscopía de fluorescencia, contando la relación de eGFP + y células MPIO GB + para la cantidad total de eGFP + en las células.
8. Lavar GB MPIO células marcadas BMSC-Luc/eGFP dos veces con 10 ml de PBS y las células después de la cosecha de tripsina-EDTA tratamiento (5 ml por matraz de cultivo T75 durante 5 minutos).
9. Lavar las células cosechadas y resuspender en concentración final de 133 x 10 ⁶ células / ml en PBS.
10. Mantener las células en hielo hasta el trasplante.

2. Implante celular en el SNC de ratones

1. Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de una ketamina (80 mg / kg) + xilazina (16 mg / kg) mezcla.
2. Espere 5 minutos para permitir que los ratones para conciliar el sueño.
3. Afeitarse la cabeza del ratón para permitir manipulaciones estériles.
4. Coloque el ratón en un marco estereotáctico.
5. Desinfectar ella piel y la humedad de los ojos de los ratones para prevenir la deshidratación.
6. Haga una incisión del cuero cabelludo línea media para exponer el cráneo, y perfore un agujero en el cráneo con un taladro dental de rebabas en las coordenadas dadas: 2 mm por detrás y 2 mm lateral a Bregma.
7. La suspensión de células vórtice brevemente y aspirar la suspensión de células en la jeringa.
8. Colocar la aguja de la jeringa a una profundidad de 2,5 mm bajo la duramadre y permitir el equilibrio de presión durante 1 minuto.
9. Inyectar una suspensión de células 3 l (4 x 10 ⁵ células) a una profundidad de 2 mm por debajo de la duramadre y a una velocidad de 0,70 l / min utilizando un sistema automatizado de micro-inyección de la bomba.
10. Esperar 5 minutos adicionales para evitar el reflujo de la suspensión celular inyectada.
11. Poco a poco retraer la aguja y desinfectar las fronteras de la piel antes de suturar la piel.
12. Inyectar 300 l solución NaCl al 0,9% por vía subcutánea con el fin de evitar la deshidratación, y colocar el ratón bajo una lámpara de calentamiento para recuperarse de la anestesia. Administrar post-operatorio analgésico en conformidad con las normas institucionales.

3. En bioluminiscencia in vivo

1. Anestesiar los ratones por una mezcla de 3% de isoflurano y oxígeno.
2. Coloque los ratones en el reproductor de imágenes de fotones y reducir el nivel de la anestesia con isoflurano al 1,5% y el oxígeno.
3. Inyectar 150 mg de D-luciferina por kg de peso corporal por vía intravenosa.
4. Adquirir la imagen durante 5 minutos utilizando el software de visión de fotos.
5. Lleve a cabo el procesamiento de imágenes utilizando el software M3vision. Cuantificar la señal observada con las regiones de interés fijas.

4. En vivo de imágenes de resonancia magnética

1. Anestesiar los ratones con 3% de isoflurano en una mezcla de O _2: N ₂ O (3:7).
2. Coloque los ratones en la inmovilización de un sistema horizontal 9.4T MR y reducir el nivel de anestesia a 1% de isoflurano en una mezcla de O _2: N ₂ O (3:7).
3. Humedezca los ojos de los ratones para evitar la deshidrataciónción, conecte una sonda rectal para controlar la temperatura corporal y controlar la tasa de respiración mediante la colocación de un sensor debajo del vientre del ratón.
4. Mantener la tasa de respiración a 110 ± 10 respiraciones por minuto y mantener la temperatura corporal constante dentro de un estrecho rango de 37 ± 0,5 ° C.
5. Colocar la bobina de RF en la superficie superior de la cabeza del ratón y la posición del ratón en el centro del imán.
6. Adquirir un conjunto de 10 coronales potenciadas en T2 eco del espín (SE) en las imágenes para obtener información específica anatómica y T2 * imágenes de eco de gradiente (GE) con el fin de estudiar la migración de células madre con una resolución en el plano de 70 m ^2. Establezca los parámetros de la secuencia de la siguiente manera: tiempo de repetición (TR): 500 ms, tiempo de eco (TE): 8 ms (secuencia GE) y el tiempo de repetición (TR): 4200 ms, tiempo de eco (TE): 12,16 m (SE secuencia); campo de visión (FOV): 18x18 mm ^2, la matriz: 256x256, un grosor de corte mm y una separación de corte mm (5,1 Paravision de software).
7. Lleve a cabo el procesamiento de datosutilizando el software Amira 4.0.

5. Post Mortem Histología

1. Anestesiar los ratones muy profundamente por la inhalación de un oxígeno isofluorano (4%), (0,5 l / min) y nitrógeno (1 l / min) mezcla durante 2 minutos. El sacrificio de los ratones por dislocación cervical.
2. Retire el cerebro del ratón en el cráneo y fijar el tejido cerebral en paraformaldehído al 4% en PBS durante 2 horas.
3. Deshidratar el tejido cerebral mediante la colocación del cerebro posteriormente en diferentes gradientes de sacarosa: 2 horas en 5% de sacarosa en PBS, 2 h en 10% de sacarosa en PBS, durante toda la noche en 20% de sacarosa en PBS.
4. Congelar el tejido cerebral utilizando nitrógeno líquido y almacenar el tejido a -80 ° C hasta que el corte.
5. Sección del tejido cerebral en 10 secciones m de espesor con un criostato.
6. Pantalla sin mancha cryosections de fluorescencia azul de las partículas GB MPIO y la fluorescencia verde de las células que expresan eGFP utilizando un microscopio de fluorescencia.
7. Pantalla sin mancha de cryosectionsverde / rojo de fondo de fluorescencia de las células inflamatorias.
8. Realizar tinciones inmunohistoquímicas y de inmunofluorescencia más para identificar las poblaciones endógenas de células (por ejemplo, la microglia, astrocitos, células T, ...) que interactúan con los injertos celulares.

6. Los resultados representativos

Estamos aquí presentada visualmente una secuencia optimizada de eventos para el éxito de imagen multimodal de las poblaciones de luciferasa / eGFP célula que expresa (STEM) en el sistema nervioso central de ratones. Al principio, los que se describen GB MPIO los resultados del procedimiento de etiquetado en los alimentos de alta eficiencia de las células BMSC-Luc/eGFP, que fácilmente pueden ser validados mediante microscopía de fluorescencia (Figura 2A). A continuación, sobre el injerto de GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP en el SNC de ratones, la supervivencia del injerto celular puede ser controlado por in vivo BLI basado en la actividad de luciferasa (Figura 2B). Además, la localización exacta de las células injertadas pueden ser controlados por in vivo (Figura 2C). Finalmente, el análisis histológico permite la validación de los resultados obtenidos por BLI y RMN. Estable la supervivencia fue confirmada por un eGFP expresión estable en el tiempo (Figura 2). Para esto, colocalización de eGFP-expresión de las células con azul fluorescente MPIO permite la determinación exacta de la localización y la supervivencia de las células injertadas. Además, este doble etiquetado fluorescente de las células madre reduce la posibilidad de observar resultados positivos falsos basados ​​en fluorescencia de fondo creado por las células inflamatorias ^5.

Figura 1. Visión general de la secuencia de manejo

1. Etiquetado de la célula: BMSC-Luc/eGFP están etiquetados con 5 x 10 ⁶ partículas GB MPIO por medio de cultivo ml. Después de 16 horas de incubación y un período de descanso de la siguiente 24 horas, las células se cosechan parala implantación intracerebral.
2. Implantación de las células: GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP se injertan en el cerebro de ratones en las siguientes coordenadas: bregma -2 mm, 2 mm de la derecha de la línea media y 2 mm en la duramadre.
3. En vivo BLI: Después de la administración intravenosa de 150 mg D-luciferin/kg peso corporal, la luz generada fue adquirida durante 5 minutos usando el reproductor de imágenes de fotones.
4. En vivo RM: Un conjunto de 10 coronales potenciadas en T2 eco del espín (SE), las imágenes y T2 * imágenes eco de gradiente (GE) con una resolución en el plano de 70 m ² fueron adquiridas. Parámetros de la secuencia fueron los siguientes: tiempo de repetición (TR): 500 ms, tiempo de eco (TE): 8 ms (secuencia GE) y el tiempo de repetición (TR): 4200 ms, tiempo de eco (TE): 12,16 m (secuencia SE); campo de visión (FOV): 18x18 mm ^2, la matriz: 256x256, un grosor de corte mm y 1 mm de separación corte.
5. La histología post-mortem: criosección 10μm de espesor fueron seleccionados para expresar eGFP y azul marcado con fluorescencia u BMSCcantar un microscopio de fluorescencia.

Figura 2. Multimodal de imágenes de los injertos de células madre

1. Microscopio de inmunofluorescencia directa de azul glacial (GB) MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP.
2. En vivo BLI de los ratones inyectados con 4x10 ⁵ GB MPIO células marcadas BMSC-Luc/eGFP en la semana 1 y 2 semanas después de la implantación. El análisis estadístico de las señales detectadas de BLI en la semana 1 y 2 semanas después de la implantación. Los datos se expresan como el número promedio de fotones por segundo por estereorradián por centímetro cuadrado (ph / s / sr / cm ²⁾ a partir de un período de tiempo de 5 minutos + / - error estándar calculado a partir de una región de interés fijo en ratones que muestran una clara señal de BLI en el sitio de inyección.
3. Coronal de dos dimensiones de la resonancia magnética GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP (a la izquierda del panel: (i) en T2 la imagen eco de espín y (ii) T2 * imagen de eco de gradiente) y sin etiqueta BMSC L-UC / eGFP (panel de la derecha: (iii) la imagen ponderada en T2 eco de espín y (vi) T2 * imagen de eco de gradiente) injertos en el cerebro del ratón.
4. El análisis histológico de los implantes GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP en la semana 2 post-implantación. (I) el análisis de inmunofluorescencia directa para la localización de eGFP de expresar y GB MPIO etiquetados injertos BMSC-Luc/eGFP. (Ii) los detalles a gran aumento de (i). (Iii) la tinción de inmunofluorescencia para el antígeno de GFAP, lo que indica el desarrollo de tejido cicatrizal los astrocitos en los alrededores de la etiqueta BMSC-Luc/eGFP GB MPIO. (Vi) la tinción de inmunofluorescencia para el antígeno de Iba-1, lo que indica la invasión y los alrededores de GB MPIO BMSC-Luc/eGFP etiquetados por la microglia.

En este reporte se describe un protocolo optimizado para la combinación de tres técnicas de imagen complementarias (BLI, la resonancia magnética y la histología) para la caracterización detallada de los implantes celulares en el sistema nervioso central de ratones inmunes competentes. Una combinación de etiquetado del gen de las células, sobre la base de la modificación genética con los genes reporteros de luciferasa de luciérnaga y eGFP, y un etiquetado directo de células con GB MPIO, conduce a una evaluación precisa de los injertos de células madre in vivo.

Para el etiquetado de partícula de BMSC, el tamaño de partícula GB MPIO (1.63μm) en combinación con la superficie aniónico (sustitutos carboxilo) se sugiere para facilitar la absorción endocitótica de estas partículas por células no fagocíticas ^16-18. Sin embargo, hay que mencionar que el tiempo de incubación para obtener eficiencia etiquetado alto es el tipo de células dependiente. Por ejemplo, las células fagocíticas (como macrófagos y células dendríticas) son capaces de internalizar estas partículas más rápidamente (tiempo de incubación de 0,5 a 1 hora), en comparación con los tipos de células no-phaghocytic (como células madre BMSC o neural), que necesitan un tiempo de incubación de mínimo 16 horas para el etiquetado eficiente. Esto debe tenerse en cuenta al realizar experimentos con células de etiquetado y la eficiencia de etiquetado siempre debe ser determinado de antemano mediante microscopía de fluorescencia y / o análisis de citometría de flujo. Como el etiquetado de las poblaciones de células con GB MPIOs no influye en la viabilidad celular, proliferación celular o fenotipo de células ^5, la combinación de óxido de hierro y un fluoróforo en estas partículas por lo tanto, crea una oportunidad ideal para visualizar tanto por resonancia magnética y óptica. Además, debido al contenido de hierro de alta y gran tamaño de partícula, las partículas MPIO puede ser utilizado para sola célula ^12,19,20 y de imagen única partícula ²¹ por resonancia magnética. Esto es extremadamente interesante cuando se trata de estudiar la migración de células como células individuales pueden ser observadas. Sin embargo, el alto contenido de hierro de la utilizada MPIO GBpartículas también tiene ciertas desventajas cuando se pretende delimitar el tamaño exacto del sitio del injerto por resonancia magnética. El contenido de hierro muy alto de MPIOs no sólo crea inhomogeneidades magnéticas en el sitio de implante, sino también en los alrededores del implante celular, resultando en una sobreestimación del volumen sitio del implante y una discriminación menos precisa entre células implantadas y el tejido circundante. En consecuencia, el tipo de partícula, necesaria para el etiquetado de células, dependerá del diseño del estudio. Cuando el objetivo de determinar la migración de células madre, una sensibilidad muy alta y por lo tanto con alto contenido de hierro MPIOs será necesario. Por otro lado, cuando se pretende para la localización precisa de los injertos de células madre, más pequeños SPIOs con un contenido de hierro inferior podría ser una alternativa preferible ^22. Además, las partículas de hierro generar contraste negativo introducir otro problema relativo a la discriminación entre las células implantadas y sangrado celular después de injerto. Por lo tanto una gran cantidad de investigación que está pasandoen dirección a la utilización de agentes de contraste positivos para el etiquetado de células. Junto al tipo de partícula, el tipo de secuencia utilizada para la adquisición MRI también depende del objetivo del estudio. Cuando se utiliza la IRM para delinear el implante para obtener información precisa sobre la ubicación del implante y el volumen del implante, la secuencia de T2 (espín eco) es favorable, ya que proporciona información anatómica con gran precisión. Por otro lado, la secuencia T2 * (gradiente eco) es una secuencia utilizado para estudiar la posible migración de células injertadas como esta secuencia tiene en cuenta todas las inhomogeneidades del campo magnético representar una mayor sensibilidad hacia compuestos que influyen en el campo magnético. Esta secuencia es absolutamente necesario cuando se trata de la detección de una pequeña cantidad de células que podrían haber migrado fuera de la región implantado. Usando esta secuencia hemos sido capaces de llegar a la conclusión de que las células BMSC-Luc/eGFP no emigran después de la implantación del estriado en el SNC de ratones.

Mientras queUna resonancia magnética proporciona datos sobre la localización celular del implante, el análisis adicional de BLI ofrece datos sobre la supervivencia celular del implante ^2,4,11. A medida que la reacción enzimática entre la enzima luciferasa y la luciferina sustrato necesita la presencia de O ₂ y ATP, es una técnica fiable para estudiar la supervivencia celular. Las células necróticas no expresan la enzima luciferasa y no O ₂ y ATP estarán presentes. Además, sólo las células que expresan la enzima luciferasa son capaces de catalizar la reacción, dando como resultado la producción de luz, que se asemeja a la alta sensibilidad de la técnica. BLI se puede realizar de una manera cuantitativa, porque la cantidad de luz producida es proporcional a la cantidad de células que expresan luciferasa. Sin embargo, las consideraciones importantes deben tenerse en cuenta al realizar BLI cuantitativamente como varios factores distintos de cantidades de células pueden influir en el nivel de expresión de luciferasa o la cantidad de luz detectada. Por ejemplo, anestesiólogoun nivel pueden influir en la enzima luciferasa y / o la disponibilidad luciferina ^23, distintos factores y compuestos pueden influir en la disponibilidad de sustrato y / o actividad captación ^24-26 o ^27-30 promotor, dando lugar a diferencias en la señal de salida. Además, el uso de BLI se limita a los animales pequeños como la técnica se limita a la penetración del tejido bajo de la luz. En consecuencia, cuando el objetivo de realizar BLI cuantitativo para el seguimiento de la supervivencia de células después del trasplante, todos los parámetros posiblemente influyen en las variaciones de señal deben mantenerse lo más estándar posible. Por ejemplo, la implantación de injertos celulares profundidad, el nivel de anestesia y vía de administración / cantidad del sustrato administrada antes de la adquisición de BLI, afeitado adecuado de la piel del animal, etc

Teniendo en cuenta lo anterior se describen las ventajas y desventajas de la imagen molecular, los resultados obtenidos siempre deben ser validados por el análisis histológico. Por la presente varionosotros los fenotipos celulares y de las interacciones celulares entre los diferentes tipos de células pueden ser visualizados con el post mortem más alta sensibilidad. A pesar de que esta técnica es la herramienta de validación de elección, la presencia de fluorescencia de fondo creado por células inflamatorias que rodean y / o invadir el sitio del injerto debe tenerse en cuenta, ya que esto podría conducir a resultados falsos positivos. Sin embargo, el uso de un doble etiquetado con un gen reportero fluorescente, tal como eGFP, y una sonda fluorescente, tal como GB MPIO, reduce la posibilidad de errores de identificación (es decir, las células injertadas debe mostrar ambas fluorescencias específicas, sin mostrar fluorescencia de fondo a la luz irrelevante canales).

Resumiendo, mientras que BLI es una técnica única para controlar la supervivencia celular en el tiempo de una manera cuantitativa con una sensibilidad muy alta, pero de baja resolución, la RM es la técnica de elección para superar la baja resolución obtenida con BLI. La combinación de estos in vivo técnicacuestión hace suficiente información sobre la supervivencia y la localización de las células injertadas in vivo en una forma no invasiva. Finalmente, las interacciones celulares injerto con tejido circundante y / o endógenos células inflamatorias pueden ser fácilmente controlados post-mortem mediante histología. Aunque, por el momento, este último aún se necesita hacer un análisis histológico, los principales desafíos para el futuro será la mejora existente en vivo modalidades de imágenes moleculares para permitir la evaluación en tiempo real de los parámetros con resolución similar y la sensibilidad que se obtiene utilizando el análisis histológico.