Multimodal Imaging av stamceller implanteras i centrala nervsystemet hos möss

1. Cellberedning

1. Experiment ska påbörjas med ex vivo odlade populationer stamceller genetiskt modifierade att uttrycka Luciferas och EGFP reporter proteiner. Här används Luciferas / EGFP-uttryckande murin benmärg-härledda stromaceller (BMSC-Luc/eGFP) såsom tidigare beskrivits av Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. Två dagar före cellmärkning, plattan celler BMSC-Luc/eGFP vid en densitet av 8 x 10 ⁵ celler per T75 odlingskolv i 15 ml komplett expansionsmedium (CEM) kompletterat med 1 ng / ml Puromycine.
3. Tillåta cellerna att växa under 48 h vid 37 ° C och _5% CO2.
4. Tillsätt 5 x 10 ⁶ Glaciala Blue mikrometerstorlek järnoxidpartiklar (GB MPIO) per ml odlingsmedium till den växande cellkultur (totalt: 75 x 10 ⁶ partiklar per 15 ml odlingsmedium i en T75 odlingskolv).
5. Inkubera under 16 h för att låta partikeln upptag via endocytos.
6. Tvätta bort kvarvarande partiklaroch låta cellerna växa under ytterligare 24 timmar för att erhålla celler konfluens och homogen fördelning av den GB MPIO.
7. Validera partikelupptagning visuellt med användning av fluorescensmikroskopi genom räkning av förhållandet av EGFP + och GB MPIO + celler på den totala mängden av EGFP +-celler.
8. Tvättbetingelser GB MPIO-märkta BMSC-Luc/eGFP cellerna två gånger med 10 ml PBS och cellerna skörd efter trypsin-EDTA-behandling (5 ml per T75 odlingskolv i 5 minuter).
9. Tvätta skördade celler och slamma i sista koncentration av 133 x 10 ⁶ celler / ml i PBS.
10. Hålla cellerna på is tills transplantation.

2. Cellimplantation i CNS hos möss

1. Söva möss genom en intraperitoneal injektion av en ketamin (80 mg / kg) + xylazin (16 mg / kg)-blandning.
2. Vänta 5 minuter så att möss för att somna.
3. Raka musen huvudet för att möjliggöra för sterila manipulationer.
4. Placera musen i en stereotaktisk ram.
5. Desinficera denhud och våta ögon mössen för att förhindra uttorkning.
6. Gör en mittlinje hårbotten snitt för att exponera skallen, och borra ett hål i skallen med en tandläkarborr grader vid den angivna koordinater: 2 mm bakre och 2 mm lateralt Bregma.
7. Virvel cellsuspensionen snabbt och aspirera cellsuspensionen i sprutan.
8. Placera injektionsnålen på ett djup av 2,5 mm under dura och tillåta tryckutjämning under 1 minut.
9. Injicera en 3 | il cellsuspension (4 x 10 ^5-celler) vid ett djup av 2 mm under dura och vid en hastighet av 0,70 | il / min med användning av en automatiserad mikro-insprutningspumpen.
10. Vänta på ytterligare 5 minuter för att förhindra backflöde av den injicerade cellsuspensionen.
11. Sakta dra nålen och desinficera huden gränser innan suturering huden.
12. Injicera 300 ^ 0,9% NaCl-lösning subkutant för att förhindra uttorkning och placera musen under en värmelampa att återhämta sig från anestesi. Administrera pOst-operativ smärtstillande i enlighet med institutionella standarder.

3. In vivo Bioluminescens

1. Söva mössen genom en blandning av 3% isofluran och syre.
2. Placera mössen i Photon Imager och minska anestesi nivå till 1,5% isofluran och syre.
3. Injicera 150 mg D-luciferin per kg kroppsvikt intravenöst.
4. Skaffa bilden för 5 minuter med hjälp av programmet Photo Vision.
5. Utför bildbehandling med M3vision programvaran. Kvantifiera observerade signalen med hjälp av fasta områden av intresse.

4. In vivo Magnetic Resonance Imaging

1. Söva mössen med 3% isofluran i en blandning av O _2: ^ _{2 ^} (3:7).
2. Placera mössen i restrainer av en horisontell 9.4T MR-systemet och minska anestesi nivå till 1% isofluran i en blandning av O _2: ^ _{2 ^} (3:7).
3. Väta ögonen hos mössen för att förhindra dehydration, bifoga en rektal sond för att övervaka kroppstemperatur och övervaka andning genom att placera en sensor under musen magen.
4. Bibehålla andningshastighet på 110 ± 10 andetag per minut och hålla kroppstemperatur konstant inom ett snävt intervall av 37 ± 0,5 ° C.
5. Placera spolen ytan RF ovanpå mus huvudet och placera mus i mitten av magneten.
6. Skaffa en uppsättning av 10 koronala T2-viktade (SE) spinneko bilder för att få specifik anatomisk information och T2 *-viktade gradienteko (GE) bilder för att studera migration stamceller med en i planet upplösning på 70 m ^2. Ställ sekvens parametrar enligt följande: repetitionstid (TR): 500 ms, eko tid (TE): 8 ms (GE sekvens) och upprepning tid (TR): 4200 ms, eko tid (TE): 12,16 ms (SE sekvens); synfält (FOV): 18x18 mm ^2, matris: 256x256, 1 mm skivtjocklek och 1 mm skiva separation (Paravision 5,1 programvara).
7. Utför databehandlinganvändning Amira 4,0 mjukvara.

5. Post mortem Histologi

1. Söva mössen mycket djupt genom inhalation av en isofluoran (4%), syre (0,5 L / min) och kväve (1 liter / minut) blandning under 2 minuter. Offra mössen genom cervikal dislokation.
2. Avlägsna mushjärna från skallen och fixera hjärnvävnad i 4% paraformaldehyd i PBS under 2 timmar.
3. Dehydratisera hjärnvävnad genom att placera hjärnan därefter i olika gradienter av sackaros: 2 h i 5% sackaros i PBS, 2 timmar i 10% sackaros i PBS, över natt i 20% sackaros i PBS.
4. Frysa hjärnvävnad med användning av vätska kväve och lagra vävnaden vid -80 ° C tills snittning.
5. § hjärnvävnaden i 10 ^ m tjocka sektioner med hjälp av en kryostat.
6. Skärmen ofärgade kryosnitt för blå fluorescens från GB MPIO partiklarna och grön fluorescens från egfp uttryckande celler med användning av ett fluorescensmikroskop.
7. Skärmen ofärgade kryosnitt förgrön / röd bakgrundsfluorescens från inflammatoriska celler.
8. Utföra ytterligare immunhistokemiska och immunofluorescerande färgningar för att identifiera endogena cellpopulationer (t.ex. mikroglia, astrocyter, T-celler ...) som interagerar med cellulära transplantat.

6. Representativa resultat

Vi här presenteras visuellt en optimerad sekvens av händelser som för en framgångsrik multimodal avbildning av luciferas / EGFP-uttryckande (STEM) cellpopulationer i CNS hos möss. Vid första, de beskrivna GB MPIO märkning förfarande resulterar i effektiv märkning av BMSC-Luc/eGFP celler, som lätt kan valideras med användning av fluorescensmikroskopi (Fig. 2A). Därefter vid ympning i GB MPIO märkt BMSC-Luc/eGFP i CNS hos möss, kan överleva i det cellulära transplantat övervakas genom in vivo BLI baserat på luciferasaktivitet (Figur 2B). Dessutom kan den exakta lokaliseringen av ympade celler övervakas genom in vivo- (figur 2C). Slutligen medger histologisk analys validering av de resultat som erhållits genom BLI och MRI. Stabil överlevnad bekräftades genom en stabil EGFP expression i tiden (figur 2D). För detta samlokalisering av EGFP-uttryckande celler med blå fluorescerande MPIO medger exakt bestämning av lokalisering och överlevnad av transplanterade celler. Dessutom minskar denna dubbla fluorescerande märkning av stamcellema möjligheten att observera falska positiva resultat baserat på bakgrundsfluorescens som skapas av inflammatoriska celler ^5.

Figur 1. Översikt över hanteringen sekvensen

1. Cellmärkning: BMSC-Luc/eGFP märks med 5 x 10 ⁶ GB MPIO partiklar per ml odlingsmedium. Efter 16 h av inkubation och en följande viloperiod av 24 h skördas cellerna förintracerebral implantation.
2. Cellimplantation: GB MPIO märkta BMSC-Luc/eGFP ympas i mus hjärnan på följande koordinater: bregma -2 mm, 2 mm direkt från mittlinjen och 2 mm under dura.
3. In vivo BLI: Efter intravenös administrering av 150 mg D-luciferin/kg kroppsvikt, var den genererade ljuset som förvärvats under 5 minuter med användning av Photon Imager.
4. In vivo MRI: var En uppsättning 10 koronala T2-viktade (SE) spinneko bilder och T2 *-viktade gradienteko (GE) bilder med en i planet upplösning på 70 m ² förvärvas. Sekvens var som följer: repetitionstid (TR): 500 ms, ekot tid (TE): 8 ms (GE-sekvensen) och repetitionstid (TR): 4200 ms, ekot tid (TE): 12,16 ms (SO-sekvens); synfält (FOV): 18x18 mm ^2, matris: 256x256, 1 mm skivtjocklek och 1 mm skiva separation.
5. Post-mortem histologi: 10 pm tjocka kryosnitt screenades för EGFP uttrycka och blå fluorescensmärkta BMSC usjunger en fluorescensmikroskop.

Figur 2. Multimodal avbildning av transplantat stamceller

1. Direkt immunofluorescensmikroskopi av is blue (GB) MPIO märkta BMSC-Luc/eGFP.
2. In vivo BLI att möss som injicerats med 4x10 ⁵ GB MPIO märkta BMSC-Luc/eGFP celler vid vecka 1 och vecka 2 efter implantation. Statistisk analys av upptäckta BLI signaler vecka 1 och vecka 2 efter implantation. Data uttrycks som medelantalet fotoner per sekund per steradian per kvadratcentimeter (ph / s / sr / cm ²⁾ från en 5 minuters tidsperiod + / - standardfel beräknas från en fast region av intresse hos möss visar en tydlig signal BLI vid injektionsstället.
3. Koronala två-dimensionell MRI enligt GB MPIO märkt BMSC-Luc/eGFP (vänster panel: (i) T2-viktad spinneko bild och (ii) T2 *-viktad gradient eko bild) och omärkt BMSC-LUC / EGFP (höger panel: (iii) T2-viktad spinneko bild och (vi) T2 *-viktad gradient eko bild) transplantat i mushjärna.
4. Histologisk analys av GB MPIO märkt BMSC-Luc/eGFP implantat vid vecka 2 efter implantation. (I) Direkt immunofluorescens analys för lokalisering av EGFP-uttrycka och GB MPIO märkta transplantat BMSC-Luc/eGFP. (Ii) Hög förstoring detalj av (i). (Iii) Immunfluorescensinfärgning för GFAP-antigen, vilket indikerar att utveckla astrocytisk ärrvävnad i den omgivande enligt GB MPIO märkt BMSC-Luc/eGFP. (Vi) Immunfluorescensinfärgning för Iba-1 antigen, vilket indikerar invasionen och omgivande av GB MPIO märkta BMSC-Luc/eGFP av mikroglia.

I denna rapport beskriver vi en optimerad protokoll för en kombination av tre kompletterande avbildningsmetoder (BLI, MRI och histologi) för detaljerad karakterisering av cellulära implantat i CNS hos immunkompetenta möss. En kombination av reportergenen märkning av celler, baserat på genetisk modifiering med reportergener eldflugeluciferas och EGFP och en direkt cellmärkning med GB MPIO, leder till en korrekt bedömning av transplantat stamceller in vivo.

För partikel märkning av BMSC är GB MPIO partikelstorlek (1.63μm) i kombination med anjoniska ytan (karboxyl substitut) föreslagits för att underlätta endocytotisk upptagning av dessa partiklar av icke-fagocytiska celler ^16-18. Men måste det nämnas att inkubationstiden för att med hög märkning effektivitet är celltyp beroende. Exempelvis fagocytiska celler (såsom makrofager och dendritiska celler) kan internalisera dessa partiklar snabbare (inkubationstid av 0,5 - 1 h) jämfört med icke-phaghocytic celltyper (såsom BMSC eller neurala stamceller), som behöver en inkubationstid av minst 16 h för effektiv märkning. Detta måste beaktas när de utför experiment cellmärkning och effektivitet för märkning bör alltid bestämmas i förväg med hjälp fluorescensmikroskopi och / eller flödescytometrisk analys. Som märkning av cellpopulationer med GB MPIOs inte påverkar cellviabilitet, cellproliferation eller cell fenotyp ^5, skapar kombinationen av järnoxid och en fluorofor i dessa partiklar därför ett utmärkt tillfälle att visualisera dem både med MRI och optisk avbildning. Dessutom, beroende på den höga järnhalten och stor partikelstorlek, kan MPIO partiklar användas för en enda cell ^12,19,20 och enda partikel avbildning ²¹ av MRI. Detta är mycket intressant när det gäller att studera cell migration som enskilda celler kan observeras. Emellertid den höga järnhalten i det använda GB MPIOPartiklarna har också vissa nackdelar när syftet är att avgränsa den exakta storleken på transplantationsstället med MRI. Den mycket höga järnhalten i MPIOs skapar inte bara magnetiska inhomogeniteter på implantatstället, men också i den omgivande av den cellulära implantatet, vilket resulterar i en överskattning av implantatstället volym och en mindre noggrann diskriminering mellan implanterade celler och den omgivande vävnaden. Följaktligen den typ av partikel, som behövs för cellmärkning, kommer att bero på studiens utformning. När syftet är att fastställa migrering stamcell, en mycket hög känslighet och därmed hög järn innehållande MPIOs kommer att behövas. Å andra sidan kan när syftet för korrekt lokalisering av transplantat stamceller, små SPIOs med en lägre järnhalt vara ett bättre alternativ ^22. Dessutom järnpartiklar genererar negativ kontrast införa ett annat problem om diskriminering mellan implanterade celler och blödande efter cell transplantation. Därför är en hel del forskning pågårvidare mot användningen av positiva kontrastmedel för cellmärkning. Intill partikeltyp, beror typen av sekvensen som används för MRT-inhämtningssystemet också på syftet med studien. Då MR används för att beskriva implantatet för att få korrekt information om platsen för implantatet och implantatet volym, T2 sekvens (spin eko) är positivt, eftersom det ger anatomisk information med hög noggrannhet. Å andra sidan är T2 * sekvensen (gradient eko) en sekvens som används för att studera möjlig migration av transplanterade celler som denna sekvens tar hänsyn till alla inhomogeniteter i det magnetiska fältet gör en högre känslighet mot föreningar som påverkar det magnetiska fältet. Denna sekvens är absolut nödvändigt när det gäller detektering av en liten mängd av celler som kan ha vandrat av det implanterade området. Med denna sekvens kunde vi konstatera att BMSC-Luc/eGFP celler inte migrerar efter striatala implantation i CNS hos möss.

MedanMRT ger uppgifter om cell implantat lokalisering, ger ytterligare BLI analysen uppgifter om överlevnadsutrymme implantat ^2,4,11. Såsom den enzymatiska reaktionen mellan luciferas-enzymet och substratet luciferin behöver närvaron av O ₂ och ATP är det en tillförlitlig teknik för att studera cellöverlevnad. Nekrotiska celler kommer inte att uttrycka luciferas-enzymet, och nr O ₂ och ATP kommer att vara närvarande. Dessutom, endast celler som uttrycker luciferas-enzymet är i stånd att katalysera reaktionen, vilket resulterar i produktion av ljus, som liknar den höga känsligheten hos denna teknik. BLI kan utföras på ett kvantitativt sätt, eftersom den mängd ljus som produceras är proportionell med mängden luciferas-uttryckande celler. Men viktiga överväganden måste beaktas när de utför BLI kvantitativt som flera andra faktorer än cell mängder kan påverka uttrycket nivån av luciferas eller mängden detekterat ljus. Till exempel, anesthesien nivå kan påverka luciferas-enzymet och / eller luciferin tillgänglighet ^23, olika faktorer och föreningar kan påverka substratet tillgänglighet och / eller upptaget ^24-26 eller promotoraktivitet ^27-30, vilket resulterar i skillnader i utsignalen. Dessutom användningen av BLI är begränsad till små djur som tekniken är begränsad till låga vävnadspenetrering av ljus. Följaktligen, när som syftar till att genomföra kvantitativa BLI att följa upp cellöverlevnad efter transplantation, alla parametrar eventuellt påverkar signalvariationer måste hållas som standard som möjligt. Till exempel, implantation djupet av cellulära transplantat, anestesi nivå och administreringssätt / mängd av substratet administreras före BLI förvärvet, korrekt rakning av djurets hud etc.

Med hänsyn till ovan beskrivna fördelar och nackdelar med molekylär avbildning, de erhållna resultaten måste alltid godkännas av histologisk analys. Härmed variooss cellulära fenotyper och cellulära interaktioner mellan olika celltyper kan visualiseras med högsta känsligheten obduktion. Trots det faktum att denna teknik är att validera bästa sättet kan närvaron av bakgrundsfluorescens som skapas av inflammatoriska celler som omger och / eller invadera transplantationsstället måste övervägas, eftersom detta kan leda till falska positiva resultat. Emellertid reducerar användningen av en dubbel märkning med en fluorescerande reporter-gen, såsom EGFP, och en fluorescerande sond, såsom GB MPIO, möjligheten att felaktig identifiering (dvs transplanterade celler bör uppvisa både specifika fluorescensen, utan att visa bakgrundsfluorescens i irrelevant ljus kanaler).

Sammanfatta, medan BLI är en unik teknik för att övervaka cellöverlevnad i tid på ett kvantitativt sätt med mycket hög känslighet, men låg upplösning, är MR tekniken att valet att övervinna den låga upplösning som erhölls med BLI. Kombinationen av dessa in vivo-tekfrågan gör tillräcklig information om överlevnad och lokalisering av transplanterade celler in vivo på ett icke-invasivt sätt. Slutligen kan cellulära transplantat interaktioner med omgivande vävnad och / eller endogena inflammatoriska celler lätt övervakas obduktion med användning histologi. Även för närvarande, den senare fortfarande behöver göras av histologisk analys, kommer de främsta utmaningarna för framtiden är att förbättra befintlig in vivo molecular imaging metoder för att i realtid bedömning av de parametrar med liknande upplösning och känslighet som erhölls med histologisk analys.