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डिजाइन डीएनए विरोधी भावना कूजन द्वारा शाही सेना के लक्ष्य का चयनात्मक पुनर्प्राप्ति के लिए जांच खपरैल का छत.
डिजाइन विरोधी भावना oligo पर ऑनलाइन जांच डिजाइनर का उपयोग कर जांच singlemoleculefish.com18.
इन मापदंडों का उपयोग करें: = शाही सेना लंबाई की जांच 1/100 बीपी जांच की संख्या 2) लक्ष्य जीसी = 45%; 3) Oligonucleotide लंबाई = 20; के बीच की दूरी 4) = लंबाई 60-80. क्षेत्रों में डिजाइनर के लिए अगर बहुत देर शाही सेना तोड़. दोहराता या व्यापक अनुरूपता के क्षेत्रों में न आना.
विरोधी भावना क्रम 3 प्रधानमंत्री अंत में BiotinTEG साथ डीएनए जांच.
शाही सेना के साथ उनकी स्थिति के अनुसार लेबल जांच. उन्हें दो पूल में अलग ताकि "भी" पूल सारे जांच नंबर 2, 4, 6, आदि और "अजीब" पूल एक नंबर जांच, 3, 5, आदि 100 माइक्रोन एकाग्रता को जांच के पूल पतला और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान
सभी प्रयोगों के लिए उपयोग किया जादोनों पूल, जो एक दूसरे के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. असली संकेत शाही सेना पर निर्भर दोनों पूल से उपस्थित हो सकता है, जबकि जांच के विशिष्ट शोर प्रत्येक पूल के लिए अद्वितीय होगा. यह दोनों कूजन qPCR और कूजन - seq के लिए लागू होता है.
2. फसल कक्ष
कोशिकाओं कि कूजन प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा लीजिए.
टिशू कल्चर प्लेट या confluency के लिए बोतल में कोशिकाओं को विकसित. फॉस्फेट के साथ कुल्ला खारा (पीबीएस) एक बार बफर और trypsinize है. > मीडिया की 2x मात्रा के साथ बुझाना trypsin, विंदुक ऊपर और नीचे करने के लिए कोशिकाओं को जगह देना और एकल कक्ष निलंबन में resuspend. 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में स्थानांतरण सभी मीडिया और resuspended कोशिकाओं. 20 मिलियन कोशिकाओं को आमतौर पर एक कूजन नमूना के लिए पर्याप्त है.
800RCF में 4 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन. महाप्राण (व्यंजन) और पीबीएस के 40 मिलीलीटर में मीडिया resuspend 40 मिलियन कोशिकाओं, ट्यूब गठबंधन यदि आवश्यक हो. 800RCF में 4 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन. छानना पीबीएस, ध्यान से शेष तरल कोण पर महाप्राण (व्यंजन).
3. क्रॉस - लिंक कोशिकाओं और सेल गोली लीजिए
Crosslink के आरएनए Chromatin बातचीत के संरक्षण और सेल गोली तैयार glutaraldehyde के साथ कोशिकाओं एकत्र.
कमरे के तापमान पर सभी चरणों का पालन करें.
कमरे के तापमान पीबीएस में 1% glutaraldehyde के तैयार. 10 मिलियन कोशिकाओं (0.4 एमएल 25% glutaraldehyde का + शेयर 9.6 एमएल पीबीएस) प्रति 10 मिलीलीटर तैयार. Glutaraldehyde ताजा किया जाना चाहिए.
फाल्कन ट्यूबों के नीचे ठोकर छर्रों को जगह देना. Resuspend सेल गोली 1% glutaraldehyde में में, एक छोटे विखंडू से बचने की मात्रा के साथ शुरू है, तो पूरी मात्रा करने के ऊपर है. मिश्रण पलटना. Crosslink पर कमरे के तापमान पर 10min के लिए एक अंत करने के अंत में एक प्रकार के बरतन या अंग को घुमानेवाली पेशी.
5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1.25 एम ग्लाइसिन के 1/10th मात्रा के साथ पार से जोड़ने की प्रतिक्रिया बुझाना.
5 मिनट के लिए 2000RCF में स्पिन. 20 एमएल पीबीएस एक बार ठंडा, 5 मिनट के लिए 2000RCF में कताई के साथ सतह पर तैरनेवाला और धोने गोली महाप्राण (व्यंजन).
महाप्राण (व्यंजन) और डब्ल्यू resuspendashed, गोली पार से जुड़े 20 मिलियन कोशिकाओं प्रति 1 मिलीलीटर ठंडा. पीबीएस के साथ. Eppendorf ट्यूब और स्पिन 4 सी. पर 3 मिनट के लिए प्रत्येक मिलीलीटर 2000RCF पर स्थानांतरण संभव के रूप में के रूप में ज्यादा पीबीएस विंदुक टिप के साथ ध्यान से निकालें.
-80 में तरल नाइट्रोजन और दुकान में सेल छर्रों फ्लैश स्थिर ° अनिश्चित काल सी.
4. सेल
Crosslinked कोशिकाओं Lyse सेल lysate तैयार करने के लिए.
कमरे के तापमान पर पिघलना जमे हुए सेल छर्रों. कठिन नल के लिए जगह देना और सेल गोली मिश्रण. नीचे में 3 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए गोली स्पिन 2000RCF पर किसी भी शेष पीबीएस हटाने के एक तेज 10 μl विंदुक टिप का उपयोग करें.
एक इलेक्ट्रॉनिक संतुलन (1mg करने के लिए सही) धड़ा एक खाली Eppendorf ट्यूब के के द्रव्यमान पर (हमारे ट्यूबों बहुत लगातार 1.060 ग्राम वजन). प्रत्येक गोली वजन और अपने वजन का रिकॉर्ड है. एक पूर्ण 15 crosslinked HELA कोशिकाओं के सेमी पकवान आम तौर पर 100 मिलीग्राम वजन का होता है.
अनुपूरक fres साथ lysis बफर (गोली की 10X जन, जैसे 100mg के लिए 1 मिलीग्राम)ज protease अवरोध करनेवाला, PMSF और Superase - में (संलग्न बफर सूची देखें). मिश्रण अच्छी तरह से.
प्रत्येक ट्यूब 10X मात्रा पूरक lysis बफर जोड़ें और गोली resuspend के. के छोटे छर्रों के लिए <25 मिलीग्राम, 250 μl पूरक lysis बफर में resuspend. निलंबन चिकनी होना चाहिए. यदि नहीं, 500 μl aliquots में निलंबन को विभाजित है और एक motorized गोली मिक्सर का उपयोग करने के clumps को तोड़ने. Sonication के लिए तुरंत आगे बढ़ें.
5. Sonication
Crosslinked सेल lysates sonicating कतरनी डीएनए.
ट्यूबों में 15 मिलीलीटर फाल्कन Bioruptor में सेल lysate Sonicate करें. प्रत्येक ट्यूब में <1.5 मिलीलीटर lysate का प्रयोग करें, और तेजी से sonication के लिए, एक समय में कोई दो से अधिक ट्यूबों sonicate.
पर नाड़ी अंतराल बंद 45 सेकंड एक 4 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड के साथ उच्चतम सेटिंग में पानी के स्नान में Sonicate. हर 30 मिनट lysate की जाँच करें. Sonicating जारी रखें जब तक सेल lysate अब turbid है. यह रूप में छोटा रूप में 30 मिनट और के रूप में कई के रूप में 4 घंटे लग सकते हैं. संख्याट्यूबों के नमूना मात्रा, स्नान के तापमान, और sonication समय की अवधि को प्रभावित करेगा कि कैसे प्रक्रिया लंबे समय लेता है. ट्यूब की संभावना अलग दरों पर sonicate होगा, तो उन्हें एक साथ हर 30 मिनट और मूल ट्यूब में फिर से विभाजित करने के लिए एकरूपता सुनिश्चित पूल. नोट: glutaraldehyde - crosslinked कोशिकाओं काफी लंबे समय तक लेने के लिए formaldehyde के समकक्ष से sonicate.
जब lysate स्पष्ट हो जाता है, एक ताजा Eppendorf ट्यूब 5 μL lysate हस्तांतरण. 90 μL डीएनए Protease कश्मीर (पी) (बफर सूची देखें) बफर और 5 μL पीके जोड़ें. भंवर मिश्रण और नीचे संक्षिप्त स्पिन. 50 में 45 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस
डीएनए क्विएज़न पीसीआर शुद्धि किट के साथ निकालें. 30 μL क्विएज़न क्षालन बफर (EB) में elute डीएनए और 1% agarose जेल पर डीएनए आकार की जाँच करें. यदि डीएनए धब्बा के थोक 100-500 बीपी है, sonication पूरा हो गया है. यदि नहीं, sonicate जारी है.
16100RCF पर sonicated नमूने 4 बजे 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस 1 एमएल नमूने और फ्लैश फ्रीज में तरल nitroge में supernatants, अशेष भाजक का मिश्रणएन. -80 में दुकान डिग्री सेल्सियस
6. कूजन
संकरण करना biotinylated डीएनए जांच के लिए शाही सेना और बाध्य chromatin से अलग है.
Chromatin के कमरे के तापमान पर पिघलना ट्यूबों.
संकरण बफर तैयार (बफर सूची देखने के लिए, chromatin की मिलीलीटर प्रति 2 मिलीलीटर तैयार है). मिश्रण भंवर.
एक ठेठ कूजन lysate के 1 मिलीग्राम का उपयोग नमूना के लिए, डीएनए और ट्यूबों Eppendorf में निवेश स्थान के लिए शाही सेना निवेश और 10 μL के लिए 10 μL हटा दें. आगे उपयोग तक बर्फ पर रखें.
1 एमएल chromatin से 15 एमएल फाल्कन ट्यूब के लिए स्थानांतरण. प्रत्येक ट्यूब 2 एमएल संकरण बफर जोड़ें. कुल मात्रा के लिए <1.5 मिलीग्राम, Eppendorf ट्यूबों का उपयोग करें.
कमरे के तापमान पर जांच का पिघलना. Nanodrop अगर तुम यह एक लंबे समय में उपयोग नहीं किया है के लिए राशि की जांच जांच (100 माइक्रोन जांच कल्पना ~ करना चाहिए 500-600 एनजी / μl भी कतरा डीएनए सेटिंग का उपयोग करते हुए). विशिष्ट ट्यूबों (1 एमएल chromatin के प्रति 100 pmol जांच, 1 1 एमएल chromatin के प्रति 100 pmol μL / जांच की μL) के लिए जांच की उचित मात्रा में जोड़ें.मिश्रण अच्छी तरह से. झटकों के साथ 4 घंटे के लिए 37 ° सी में सेते हैं.
20 मिनट संकरण के लिए शेष के साथ, चुंबकीय मोतियों सी 1 डिग्री सेल्सियस 4 में संग्रहीत तैयार. जांच के 100 pmol प्रति 100 μL का प्रयोग करें. 1 एमएल unsupplemented lysis बफर के साथ तीन बार, अलग मोती बफर से चुंबक DynaMag-2 पट्टी का उपयोग कर धो लें.
Lysis बफर के मूल मात्रा में resuspend मोती, ताजा PMSF, पीआई और Superase के में साथ पूरक. 4 घंटा संकरण प्रतिक्रिया के बाद पूरा हो गया है, प्रत्येक ट्यूब 100 μL मोती जोड़ें. मिश्रण अच्छी तरह से. झटकों के साथ 30 मिनट के लिए 37 ° सी में सेते हैं.
धो बफर (नमूना प्रति 5 एमएल) के लिए तैयार है. मिश्रण भंवर. पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस उपयोग करने से पहले PMSF जोड़ें.
1 एमएल धो बफर पांच बार के साथ मोती धो लें. पहले धो, 1 एमएल धो बफर में अलग मोती, छानना, और resuspend DynaMag-15 चुंबकीय पट्टी का उपयोग करें. 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब मात्रा स्थानांतरण. 5 मिनट के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
बाद washes पर एक minicentrifuge पर प्रत्येक ट्यूब स्पिन, DynaMag 2 1 मिनट के लिए चुंबकीय पट्टी पर नमूना सेट. छानना नमूना, एक Kimwipe, 1 एमएल धो बफर में resuspend के साथ कोई भी भरी पोछ लो. 5 मिनट के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. पाँच कुल washes के लिए दोहराएँ.
पिछले धोने पर, मोती अच्छी तरह resuspend. 100 μL निकालें और शाही सेना के अलगाव के लिए अलग सेट. रिजर्व डीएनए के अंश के लिए 900 μL. DynaMag दो चुंबकीय पट्टी पर सभी ट्यूबों प्लेस और धो बफर हटा दें. संक्षिप्त नीचे सभी ट्यूबों स्पिन, चुंबक पट्टी पर उन्हें जगह है. धो बफर के अंतिम बिट पूरी तरह से निकालें एक तेज 10 μl विंदुक टिप के साथ.
7. शाही सेना अलगाव
कूजन नमूने से शाही सेना के अंश निकालने के लिए qRT - पीसीआर द्वारा quantitate.
100 μL मनका के नमूने और 10 μL शाही सेना निवेश नमूना ले लो. 85 μL शाही सेना पीके बफर पीएच 7.0 जोड़ने के लिए निवेश शाही सेना. 95 μL पीके शाही सेना बफर पीएच 7.0 में resuspend मोती. अंत करने के लिए अंत हिला के साथ 45 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 5 μL Proteinease कश्मीर और सेते हैं जोड़ें.
संक्षेप में नीचे सभी ट्यूबों स्पिन औरब्लॉक गर्मी पर 10 मिनट के लिए 95 नमूने फोड़ा डिग्री सेल्सियस
बर्फ पर नमूने शांत रहो, 500 μL TRIzol भंवर, तेजी से जोड़ने 10 सेकंड के लिए. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. -80 में स्टोर डिग्री सेल्सियस या चरण 4 पर जाएँ.
TRIzol इलाज के नमूने के लिए 100 μL क्लोरोफॉर्म जोड़ें. 10 सेकंड के लिए सख्ती भंवर. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक benchtop अपकेंद्रित्र पर 16100RCF पर स्पिन
~ 400 μL जलीय सतह पर तैरनेवाला निकालें, जैविक और इंटरफ़ेस से परहेज.
600 (1.5 मात्रा) μL 100% इथेनॉल जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. MIRNeasy मिनी कॉलम के माध्यम से नमूना स्पिन. RWT (MIRNeasy मिनी किट), निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार RPE साथ 2x साथ 1x धो लें. 30 μL nuclease मुक्त एच 2 हे (nfH 2 हे) के साथ Elute.
साथ निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए शाही सेना प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक समझो. प्रतिक्रिया के बाद पूरा हो गया है, 15 मिनट के लिए 65 में नमूना ° सी गर्मी पूरी तरह से किसी भी शेष DNase निष्क्रिय करने के लिए.
1 μL शाही सेना का उपयोग करें qRT-पीसीआर विश्लेषण के लिए प्रति अच्छी तरह से अलग करने के लिए lncRNA की पुष्टिपुनर्प्राप्ति. GAPDH अक्सर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है.
8. डीएनए अलगाव
कूजन नमूनों से डीएनए अनुक्रमण द्वारा की पहचान या qPCR द्वारा quantitate अंश निकालें.
डीएनए क्षालन (बफर सूची देखें) बफर, नमूना प्रति 150 μl में सहित डीएनए निवेश, तैयार हो जाओ.
1 0μL RNase (10 मिलीग्राम / एमएल) एक और 10 μL RNase एच (10 यू / μl) डीएनए क्षालन बफर के प्रति मिलीलीटर, और भंवर के लिए मिश्रण जोड़ें.
क्षालन बफर डीएनए RNases साथ 150 μL में मोतियों की प्रत्येक नमूना Resuspend के. (140 μL में Resuspend डीएनए निवेश के) झटकों साथ 30 मिनट के लिए 37 ° C पर सेते हैं.
DynaMag 2 चुंबकीय पट्टी पर अलग मोती और सतह पर तैरनेवाला. सतह पर तैरनेवाला निकालें और लेबल ट्यूबों के लिए जोड़ें.
10 μL RNase (10 मिलीग्राम / एमएल) एक और RNaseH (10 यू / μL) बिल्कुल के रूप में 8.2 में किया) के साथ डीएनए क्षालन बफर के एक दूसरे अशेष भाजक तैयार. प्रत्येक नमूना (डीएनए निवेश सहित), सेते हैं 150 μL जोड़ें, और सतह पर तैरनेवाला हटाने के. सभी (सतह पर तैरनेवाला shoul लीजिएघ हो ~ 300 μL).
प्रत्येक नमूने के लिए 15 μL पीके जोड़ें. झटकों के साथ 45 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
नीचे पीले चरण ताला जेल ट्यूब (5PRIME) के पूर्व स्पिन. चरण ताला जेल ट्यूबों के डीएनए नमूनों का हस्तांतरण, और 300 μL PhOH: नमूना: प्रति Isoamyl को क्लोरोफॉर्म. 10 मिनट के लिए सख्ती से हिला, और 5 मिनट के लिए एक 16100RCF पर benchtop अपकेंद्रित्र पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन शीर्ष (~ 300 μL) से जलीय लो. जोड़ें 3 μL GlycoBlue, 30 μL NaOAc के, और 900 μL 100% EtOH. -20 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से और दुकान रातोंरात मिक्स.
16100RCF पर नमूने 4 बजे 30 मिनट के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस
छानना ध्यान से सतह पर तैरनेवाला. 1 एमएल 70% EtOH है और मिश्रण करने के भंवर में जोड़ें. 5 मिनट के लिए 16100RCF में स्पिन. विंदुक से निकालें सतह पर तैरनेवाला. एयर 1min के लिए सूखी. 30 μL EB में Resuspend.
डीएनए के नमूने qPCR या उच्च throughput Illumina प्रोटोकॉल प्रति अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार हैं.
10. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 चित्रा 2 enriches. GAPDH अधिक HELA कोशिकाओं से मानव टेलोमिरेज (TERC), शाही सेना एक प्रचुर मात्रा में सेलुलर शाही सेना है कि एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है के संवर्धन से पता चलता है. TERC (~ 88%) RNAs कक्ष में मौजूद अधिकांश कूजन प्रदर्शन से नीचे खींच रहे थे, जबकि GAPDH शाही सेना के केवल 0.46% पुनः प्राप्त किया गया था, ~ 200 गुना की एक संवर्धन कारक प्रदर्शन. जांच LacZ शाही सेना, जो स्तनधारी कोशिकाओं (चित्रा 2) में नहीं व्यक्त की है लक्ष्यीकरण के रूप में nonspecific जांच अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
डीएनए के लिए लक्ष्य lncRNA बाँध की उम्मीद क्षेत्रों को आम तौर पर नकारात्मक क्षेत्रों जब qPCR द्वारा मापा से अधिक समृद्ध कर रहे हैं चित्रा 3. QPCR चार प्राथमिक मानव चमड़ी fibroblasts में HOTAIR जाने वाली साइटों है कि हम एक ही सेल लाइन में कूजन seq प्रदर्शन द्वारा निर्धारित की मान्यता को दर्शाता है, जबकि TERC और GAPDH डीएनए साइटों सेनकारात्मक नियंत्रण क्षेत्रों के रूप में RVE. दोनों "भी" और "अजीब" जांच झुकेंगे उम्मीद नकारात्मक क्षेत्रों, सच lncRNA बाध्यकारी साइटों की एक बानगी भर HOTAIR जाने वाली साइटों की तुलना संवर्धन सेट.
उच्च throughput कूजन समृद्ध डीएनए अनुक्रमण lncRNA बाध्यकारी साइटों की एक वैश्विक नक्शा पैदावार. ड्रोसोफिला lncRNA roX2 एक तरह से है कि खुराक मुआवजा के लिए आवश्यक है में एक्स गुणसूत्र के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है. एक्स गुणसूत्र के एक वर्ग में चित्रा 4 roX2 बाध्यकारी प्रोफ़ाइल से पता चलता है. दोनों "भी" और "अजीब नमूने अनुक्रम निर्धारण किया गया है और उनके अद्वितीय शोर अतिव्यापी संकेतों के एक ट्रैक का उत्पादन करने के लिए समाप्त कर दिया है. प्रत्येक "पीक" यहाँ roX2 बंधन के एक मजबूत साइट इंगित करता है. पूरा ट्रैक और roX2 लक्ष्य जीन की सूची चू एट अल में वर्णित किया गया है 172011.
चित्रा 1. कूजन प्रक्रिया के प्रवाह चार्टdure. Chromatin lncRNA crosslinked: vivo में प्रोटीन adducts Biotinylated खपरैल का छत जांच कर रहे हैं lncRNA लक्षित संकरित, और chromatin के परिसरों चुंबकीय streptavidin मोती का उपयोग कर शुद्ध कर रहे हैं, कड़े washes के द्वारा पीछा किया. हम एक ख्यात lncRNA बाध्यकारी अनुक्रम नारंगी में schematized है Rnase से एक और एच. के एक कॉकटेल के साथ lncRNA बाध्य डीएनए या प्रोटीन elute. 2011 पहले चू एट अल में प्रकाशित है.17.
चित्रा 2. कूजन समृद्ध मानव TERC शाही सेना के लिए. TERC asDNA जांच सेलुलर TERC शाही सेना और अनभिज्ञेय GAPDH ~ 88% पुनः प्राप्त. LacZ - asDNA जांच नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और न RNAs को पुनः प्राप्त. + मीन एसडी दिखाए जाते हैं. 2011 पहले चू एट अल में प्रकाशित है.17.
चित्रा 3 के लिए प्राथमिक मानव में HOTAIR कूजन - qPCR.fibroblasts eskin. NFKBIA, HOXD3 4, SERINC5, और ABCA2 क्षेत्रों कि HOTAIR साथ बातचीत कर रहे हैं. TERC और GAPDH नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की. + मीन एसडी दिखाए जाते हैं. 2011 पहले चू एट अल में प्रकाशित है.17.
चित्रा 4 कूजन seq SL2 ड्रोसोफिला कोशिकाओं में roX2 शाही सेना के डेटा. "यहाँ तक कि" और "अजीब" अलग अनुक्रम थे, उनके डेटा दोनों में ही आम चोटियों को प्रतिबिंबित मर्ज. मर्ज किए गए ट्रैक दिखाया गया है. 2011 पहले चू एट अल में प्रकाशित है.17.
यहाँ हम कूजन seq, vivo में lncRNA बाध्यकारी जीनोम चौड़ा साइटों में मानचित्रण का एक विधि का वर्णन किया. सफलता के लिए कुंजी पैरामीटर oligonucleotide जांच और glutaraldehyde crosslinking खपरैल का छत के विभाजन पूल हैं. संबंध जांच की डिजाइन शाही सेना अनुक्रम दिया सरल है और शाही सेना की संरचना या कार्यात्मक डोमेन का कोई पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है. दो प्रजातियों में तीन नहीं बल्कि विभिन्न RNAs - roX2, TERC, और HOTAIR साथ हमारी सफलता से पता चलता है कि कूजन seq संभावना कई lncRNAs generalizable है. सभी प्रयोगों के साथ के रूप में, देखभाल और उचित नियंत्रण करने के लिए परिणामों की व्याख्या करने के लिए आवश्यक हैं. विभिन्न lncRNA शर्तों के अनुमापन, और अलग आत्मीयता जांच या crosslinkers के चयन के रूप में इस तरह की स्थितियों का विवेकपूर्ण परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है, शाही सेना chromatin के बातचीत के विभिन्न पहलुओं पर प्रकाश डाला सकता है. चिप seq तरह, सभी बाध्यकारी नहीं घटनाओं जरूरी कार्य कर रहे हैं, और अतिरिक्त अध्ययन के लिए शाही सेना ओ के जैविक परिणाम का पता लगाने के लिए आवश्यक हैंchromatin पर ccupancy. बहरहाल, हम अन्य chromatin से जुड़े lncRNAs, जो अब 8,9 हजारों में संख्या के शोधकर्ताओं के लिए इस तकनीक के कई दिलचस्प आवेदनों की उम्मीद है. बस के रूप में चिप seq डीएनए प्रोटीन बातचीत के जीनोम चौड़ा अन्वेषणों के लिए दरवाजा खोल दिया है, कूजन 'आरएनए interactome' की seq अध्ययन जीव विज्ञान के कई नए रास्ते प्रकट हो सकता है.
हम टी. त्रिशंकु, एम सी धन्यवाद. Tsai, ओ मनोर, ई. सहगल, एम. कुरोडा, टी. Swigut, और विचार विमर्श के लिए मैं Shestopalov. विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान (सीसी) सिंगापुर, R01 CA118750 एनआईएच और R01 HG004361 (HYC), और पुनर्योजी चिकित्सा HYC () के लिए और कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट की एजेंसी द्वारा समर्थित है. HYC हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट जल्दी कैरियर वैज्ञानिक है.
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0 10 mM EDTA 1% SDS Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl 10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 1 mM EDTA 0.5% SDS Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl 1% SDS 50 mM Tris-Cl pH 7.0 1 mM EDTA 15% formamide (store in the dark at 4°C) Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 0.5% SDS Always add PMSF fresh before use
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Hi there, thanks for the interest in our paper. As you pointed out the original article lacked the buffer list, which we have uploaded a while ago. Hope it helps!
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Hello, I'm trying to perform ChIRP experiments and your protocol is very helpful to me.
However, I have a question about the final concentration of biotinylated probes and the volume of the beads.
My probes are 100µM so 1µL corresponds to 100pmol. I have 50 probes and my question is : should I use 100µL of magnetic C1 beads per 100pmol of probe, so in my case, 50 probes x 100µL = 5mL of beads ?
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Hi guys, thanks for the interest in our paper. That's indeed a common question I get, so apologize for not explaining that more clearly in the paper. The 100uM concentration refers to all probes, so if you have 2 probes in the pool the individual concentration is 50uM per probe, and if you have 50 probes it's 2uM per probe. It follows that as you scale up number of probes in the pool you do not have to scale up the amount of beads to add. As a caution though, we have noticed that when I use too many probes the concentration of each probe drops too much and it actually adversely affects yield. Try not to use more than 50 probes if possible.
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Hi, I refer to your paper in HOTAIR ChIRP. You used 48 oligo probes for this ncRNA. I am trying to do a HOTAIR ChIRP. I am wondering if the number of probes can be smaller to reduce cost without a huge compromise on specificity. Furthermore, I am not doing sequencing but a specific check on a genomic region of interest, so I supposed the background noise may be lower? Thank you!
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We share your desire to reduce number of probes used. In preliminary testing I've found that you can use as few as 1 probe per 200 nucleotide of RNA target RNA. But that number has to be doubled considering if you need both "even" and "odd" set, so effectively tiling density is 1 probe / 100nt.
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Hello,
I enjoyed your paper very much.
At the end of the video, and in the figure, you mention that in this process you can isolate RNA binding proteins that were associated with the RNA. My questions are: have you had success in doing this? What is the protocol for isolating the proteins? Do you just isolate the protein fraction from the Trizol, or is there a more specialized method? Is there a paper that may lay out use of this method?
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Hi,
Great protocol. Just one question. You mention that all ChIRP steps have to be performed at 37C. I can imagine this is important for the hybridisation steps, but I was wondering why this was needed for the washing steps as well?
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The washing should be performed at 37C just like you would wash a northern blot at elevated temperatures. If this is logistically difficult for you, just warming up the buffer to 37C and washing on a room temp. shaker works well too.
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Hello,
Thanks for the detailed and very helpful protocol. Can you tell me what kind of DNA yields to expect from the pull down per input cell amount? I know it will depend on the lncRNA targeted, but I need an idea of what kind of amounts to expect. Could you tell me what you got for your HOTAIR hybridizations? My own hybs only result in a few nanograms of DNA, and I don't know how to determine whether that is nonspecific DNA binding to my beads or whether it is actual lncRNA-bound DNA? How do you control for this? Thank you for your help in advance.
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ReplyPosted by: tang n.May 5, 2012, 4:16 AM