En musemodel for muskeltræning ved Neuromuskulær elektrisk stimulering

Ambrosio, F., Fitzgerald, G. K., Ferrari, R., Distefano, G., Carvell, G. A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (63), e3914, doi:10.3791/3914 (2012).

Neuromuskulær elektrisk stimulering (NMES) er et almindeligt klinisk modalitet, som er meget anvendt til at genoprette ^en opretholde ² eller forøge ^3-5 muskel funktionelle kapacitet. Transkutan overflade stimulering af skeletmusklen involverer en strøm mellem en katode og en anode, hvorved der induceres spændingen motorenheden og de omgivende muskelfibre.

NMES er en attraktiv modalitet til at evaluere skeletmuskelceller adaptive reaktioner af flere grunde. For det første tilvejebringer en reproducerbar eksperimentel model, hvor fysiologiske tilpasninger, såsom myofiber hypertophy og muskelstyrkning ^6, angiogenese ^7-9, vækstfaktor sekretion ^9-11, og muskel precursor celleaktivering ¹² er veldokumenteret. Sådanne fysiologiske reaktioner kan være omhyggeligt titreres ved hjælp af forskellige parametre for stimulation (for Cochrane review, ¹³ se). Desuden NMES rekruttermotorenheder ikke-selektivt, og i et rumligt fastgjort og tidsmæssigt synkroniseret måde ^14, giver den fordel, at udøve en virkning af behandlingen alle fibre, uanset fibertype. Selv om der er bestemte kontraindikationer for NMES i kliniske populationer, inklusive perifere venøse lidelser eller malignitet, for eksempel, er NMES sikkert og muligt, selv for dem, der er syge og / eller sengeliggende og for bestande, hvor strenge motion kan være en stor prøvelse.

Her vil vi demonstrere protokollen for at tilpasse kommercielt tilgængelige elektroder og udføre en NMES protokol ved hjælp af en murin model. Denne dyremodel har den fordel, at anvendelse af en klinisk tilgængelig enhed, og at tilvejebringe øjeblikkelig tilbagemelding om placeringen af ​​elektroden til at fremkalde den ønskede muskel kontraktile virkning. Med henblik på dette manuskript, vil vi beskrive protokol for muskel stimulering af den forreste rum musklerne i en mus bagben.

1. Elektrode Forberedelse

• Skær en 1 cm x 1 cm sektion af vektoren kredsløbspladen.
• Stabiliser 2 wirewrap ben ved hjælp af en skruestik greb, med ben afstand ca 3,5 mm fra hinanden. Den togrenede enderne af tappene skal vende opad.
• Bøje wirewrap stifter i en 90 ° vinkel, omtrent halvvejs langs deres længde ved hjælp needlenose tænger.
• Udsætte kobbertråde med stik, ca 7 cm fra spidsen forbindelse, ved at fjerne den ledningsisolering.
• Lodde et af kobbertråde til togrenede enden af ​​en af ​​de wirewrap tappene. Gentag lodning trin for de andre wirewrap pin.
• Træk krympeflex ved loddede forbindelse mellem kobbertråde og guldpins for at isolere og stabiliseres. Opvarme slangen ved hjælp af lodning spidsen.
• Indsætte unsoldered spidser wirewrap tappene til tilstødende åbninger breadboard kredsløbspladen.
• Sikre, at wirewrap tappene er parallelle med hinanden og mick gennem breadboard sådan at spidserne er placeret i samme afstand, når de placeres gennem bestyrelsen.
• Indlejre loddede ender af tappene i klare epoxy. Lad epoxyen hærde i ca 10 minutter, eller indtil den er helt tør.
• Gentage anvendelse af epoxy, indtil tappene og vektoren kredsløbskortet er fuldstændig indlejret for at tilvejebringe strukturel integritet og aflastning for ledninger.
• Sand ned epoxy med et metal fil for at blotlægge spidserne af guldpins.
• Brug et multimeter til at sikre, at de to ledere ikke er elektrisk kortsluttet, og at ledningerne har en ordentlig kontinuitet
• Sæt elektroden fører fra NMES enhed til kvindelige 2-vejs leder stik (Pomona patch kabel).

2. Animal Forberedelse

• Dyr bedøves ved inhalation under anvendelse af 2% isofluoran (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) i _100% O2-gas. Dyret bør forblive bedøvede hele than NMES session.
• Før påbegyndelse af NMES protokollen udføre en tå klemme for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet.
• Dyr bør kontrolleres regelmæssigt for respons på stimulering med henblik på at sikre den anæstetiske er tilstrækkeligt. Anæstesi skal justeres efter behov. Bevægelse andet end det stimulerede ben, ændringer i luftvejene dybde og farve af slimhinder bør alle vurderes løbende at overvåge dybden af ​​anæstesi.
• Placer dyret i sideleje.
• Anvendelse ophthalmisk smøremiddel til øjnene for at forhindre hornhinden tørring under proceduren.
• Barbering bagbenet område, der skal behandles, og tørres med alkohol.
• Tør elektrode med 3% blegemiddel, skyl derefter med vand.
• Påføre et lag af ledende gel på den lokalitet, hvor elektroden skal anvendes. Genanvende nødvendigt hele NMES protokol til at sikre strøm mellem elektroden og huden.
• En varmelampe or cirkulerende vand tæppe skal anvendes til at opretholde normale kernelegemet intervaller.
• Bemærk: Alle procedurer er blevet gennemgået og godkendt af University of Pittsburgh Institutional Animal Care og brug Udvalg og udføres i sikret PHS og AAALAC Int. akkrediteret program og faciliteter.

3. Stimulation

• Elektrode placering:
  • Til stimulering af anteriore kammer muskler, herunder tibialis anterior og extensor digitorum longus-musklen, anbringes på overfladen elektroden direkte over dyrets dybe fibular nerve, hvilket er en distal forgrener sig i den fælles peronealnerve og er placeret lige foran den i fibular hoved.
  • Til stimulering af forreste rum muskler, er placeringen af ​​elektroden bekræftet, da stimulation udløser fuld ankel dorsiflexion og fuld udvidelse af cifre. På den anden side dorsalfleksion i fravær af ciffer forlængelse antyder, at kun tibialis anterior muskel bliver stimuleret. En sådan målrettet kontraktile respons kan være ønskeligt, afhængigt studie.
  • Den muskelkontraktion er opdelt i 2 faser stimulation: et frit bevægelig, koncentrisk fase, som forekommer under den indledende ~ 0,5 sekunder. I denne første fase, flytter pote fra en hvileposition til maksimal dorsiflexion og ciffer forlængelse. Den anden fase af stimulation er en isometrisk kontraktion opretholdt ved udgangen-range dorsiflexion og ciffer forlængelse.
• Stimulation parametre:
  • Denne NMES model udnytter den 300 PV Empi multifunktions elektroterapi enhed, som giver 2 kanaler af konventionelle NMES (se tabel). Med henblik på denne model, er kun en kanal, der anvendes.
  • Anvendte parametre omfatter symmetrisk bølgeform, en impulsvarighed på 150 mikrosekunder og en frekvens på 50 Hz. Stimulationstid er indstillet til 5 sekunder, med en 0,5 sekunders ramp op og en 0,5 sekunders ramp ned. Dette vil gøre det muligt for musklen at mere gradvist acclimate til stimulation. I den nuværende protokol, blev slukket gang i mellem veerne sat til 10 sekunder, men dette kan justeres afhængigt af den ønskede effekt. Faldet ud gange vil resultere i en hurtigere påbegyndelse af muskeltræthed. Disse stimulering parametre var baseret på kliniske protokoller designet til at øge muskelstyrken med neuromuskulær elektrisk stimulation, uden nævneværdig skeletmuskelskade ^{1, 15, 16.}
  • Mus fuldføre to sæt 10 kontraktioner med en 5 minutters hvile mellem sættene.
  • For voksne dyr er NMES intensiteten typisk indledt ved 9 mA. Fra vores erfaring, er det omtrentlige at den maksimale start intensitet, som ikke inducerer en mærkbar gangart værdiforringelse umiddelbart efter stimulation. For efterfølgende NMES sessioner, er intensiteten øges med 1 mA hver gang dyrene er i stand til at fuldføre 20 fulde dorsiflexions.
• Efter afslutning af stimuleringen protokol og Recomeget fra anæstesi, dyr typisk udvise en normal gangart og kropsholdning. Bevægelse skal forblive upåvirket under hele den NMES programmet.

4. Repræsentative resultater

Den NMES protokol beskrevet i denne artikel er blevet implementeret i flere musestammer, herunder: Wild Type (B6/10), B6.SCID og MDX / SCID mus. Repræsentative resultater af NMES udført i løbet af 4 uger (20 sessioner) i 3-5 måneder gammel MDX / SCID præsenteres.

Dyrene blev humant aflivet ved cervikal dislokation, mens under anæstesi. Tibialis anterior muskel blev høstet og straks nedfrosset i 2-methyl-butan forhånd afkølet i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Serielle snit (10 um) blev opnået og monteret på objektglas. Statistiske analyser blev udført under anvendelse af standard statistiske programpakker (SPSS, v19.0 software). Først blev Levene 's test, der anvendes til at vurdere, om der was lige afvigelser. Uafhængige prøver t-test blev derefter udført for at undersøge forskelle mellem NMES og kontrolgrupper.

Hematoxylin og eosin (H & E) pletter blev udført for at undersøge, om NMES protokol ville resultere i forøget skade i dystrofisk musklen. En sektion blev udvalgt, og billeder blev opnået under anvendelse af et lysmikroskop (Nikon Eclipse E800, Nikon, Japan). Det totale antal fibre og antallet af fibre med centralt placeret kerner blev manuelt talt under anvendelse af National Institutes of Health (NIH) - udviklet Image Analysis software, Billedet J. Der var ingen signifikant stigning i regenerering indeks (antal centralt nukleerede fibre / totale antal fibre) i dyr, der NMES, sammenlignet med kontroller (p = 0,802, figur 1). Dette antyder, at anvendelsen af ​​NMES ikke øger nedbrydningen-regenerering kaskade observeret i dystrofe dyr, og er derfor ikke sandsynligt,at inducere en forøget muskel skade.

Immunofluorescent farvning for CD31 blev udført for at undersøge virkningen af ​​4-ugers NMES protokol på muskel vaskularisering. Kort fortalt blev muskel sektioner fikseret i 4% formalin og blokeret med 5% hesteserum (HS). Snittene blev inkuberet med et rotte-anti-muse-primært antistof (1:300 fortynding i 5% HS) og behandlet med en 555-mærket gede-anti-rotte sekundært antistof (1:300 fortynding i 5% HS). At bestemme den samlede antal CD31-positive celler, blev en del udvalgt, og fotograferet under anvendelse af fluorescensmikroskopi (Nikon Eclipse E800, Japan). Det totale antal kapillærer blev manuelt talt under anvendelse af Northern Eclipse Software (Empix Imaging Inc.). Der var en signifikant stigning i antallet af CD31 positive celler i de dyr, der NMES sammenlignet med kontroller (p <0,01, figur 2), hvilket indikerer, at NMES protokol som beskrevet fremmer skeletmuskel angiogenese.

In situ kontraktile test: Fire uger efter afslutningen af en NMES protokol, blev kontraktile test af den forreste rum musklerne udført ved hjælp af en in situ test apparat (Model 809B, Aurora Scientific Inc., Canada), stimulator (Model 701C, Aurora Scientific Inc , Canada), og krafttransducer (Aurora Scientific Inc., Canada). Kort fortalt blev peronealnerve af bedøvede dyr isoleres gennem et lille snit lateral til knæet. Mus blev derefter anbragt i rygleje på en platform, og foden testes blev anbragt på fodpladen. Bagbenet anvendes til testning blev stabiliseret med klud tape på knæet og foden. Musklerne blev stimuleret med en krog elektroder indsat under huden. Muskel tetanisk kontraktion blev testet ved en frekvens på 150 Hz for 350 ms for at undersøge, hvorvidt 4-ugers NMES protokol ville inducere forbedringer i muskelkraft. Resultaterne blev normaliseret til våd muskel vægt. Der var en 30% stigning i tetanic sammentrækning af dyr, der NMES, sammenlignet med kontroller (p = 0,005) (figur 3), hvilket tyder på den beskrevne protokol forbedrer skeletmuskel styrke i mdx / SCID dyr.

. Figur 1 hematoxylin og eosin skeletmuskel farvning af dystrofisk (MDX) / immunodeficiente mus (4-5 måneder) (10x forstørrelse): a) ubehandlede kontroller, B) efter 4 ugers NMES.

Figur 2. CD31 immunofluorescens (rød), som en markør for skeletmuskel vaskularitet i skeletmuskel af dystrofisk (MDX) / immunodeficiente mus (4-5 måneder) (20x forstørrelse) A) ubehandlede kontroller, B) efter 4 ugers NMES.

Figur 3. Kontraktile testningaf den forreste rum musklerne i kontrollen og dyr behandlet med NMES i 4 uger. mNm = millisekunder Newtonmeter. Klik her for at se større figur .

Disse resultater antyder, at vores udviklede murin model af NMES fremmer skeletmuskel angiogenese (fig. 2) og styrke (figur 3), men inducerer ikke skeletmuskel beskadigelse (figur 1).

Det skal bemærkes, at stimuleringen parametrene beskrevet her er konstrueret til at inducere en muskel overbelastning til den forreste rum muskler. Ligesom det er tilfældet for kliniske scenarier kan elektrodeplacering justeres til at stimulere andre muskelgrupper, selvom musklen reaktion NMES kan være forskellige afhængigt af fibertype sammensætning. NMES varighed, det samlede antal behandlinger, og det samlede antal af gentagelser kan ændres efter at studere design.

Som med enhver protokol, har denne metode begrænsninger, som bør bemærkes. I den foreliggende undersøgelse blev stimulation udført over den dybe fibular nerve. Imidlertid, i klinikken, i stimulerings typisk administreres på motorenheden. I dyremodellen, vil stimulering af nerven kræve en lavere intensitet for at fremkalde fuldstændig muskelkontraktion. En anden begrænsning af modellen som præsenteret er, at vi ikke er i stand til at indhente oplysninger om komfort niveau under anvendelse af NMES, at dyrene er bedøvede. Derfor, tolerabiliteten af ​​sammenlignelige intensiteter i en klinisk population er vanskeligt at vurdere. Imidlertid vores histologiske resultater tyder vores NMES model, som beskrevet, ikke fremkalder muskelskade.

Udviklingen af ​​dyr modeller, der efterligner modaliteter implementeres i fællesskab i klinikken give os nyttige laboratorium værktøjer, der giver mulighed for en bedre forståelse af cellulære og molekylære reaktioner på behandling interventioner. Hertil kommer, at sådanne modeller nyttigt at gennemføre prækliniske studier med både forfine eksisterende rehabilitering protokoller og udvikle nye indikationer.

Vi har intet at afsløre.

Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (NIH) K12 for fysiske og ergoterapeuter-Omfattende muligheder i Rehabiliterings Forskeruddannelse (K12 HD055931), grundlaget for fysioterapi og Pittsburgh Claude D. Pepper ældre amerikanere Uafhængighed Center (P30 AG024827 ).

1. Snyder-Mackler, L., Delitto, A., Bailey, S.L., & Stralka, S.W. Strength of the quadriceps femoris muscle and functional recovery after reconstruction of the anterior cruciate ligament. A prospective, randomized clinical trial of electrical stimulation. Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume. 77 (8), 1166-73 (1995).
2. Gibson, J.N., Smith, K., & Rennie, M.J. Prevention of disuse muscle atrophy by means of electrical stimulation: maintenance of protein synthesis. Lancet. 2, 767-70 (1988).
3. Malatesta, D., Cattaneo, F., Dugnani, S., & Maffiuletti, N.A. Effects of electromyostimulation training and volleyball practice on jumping ability. Journal of Strength & Conditioning Research. 17 (3), 573-9 (2003).
4. Maffiuletti, N.A., Dugnani, S., Folz, M., Di Pierno, E., & Mauro, F. Effect of combined electrostimulation and plyometric training on vertical jump height. Med. Sci. Sports Exerc. 34, 1638-44 (2002).
5. Pichon, F., Chatard, J.C., Martin, A., & Cometti, G. Electrical stimulation and swimming performance. Med. Sci. Sports Exerc. 27, 1671-6 (1995).
6. Gondin, J., Guette, M., Ballay, Y., & Martin, A. Electromyostimulation training effects on neural drive and muscle architecture. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 1291-9 (2005).
7. Mathieu-Costello, O., Agey, P.J., Wu, L., Hang, J., & Adair, T.H. Capillary-to-fiber surface ratio in rat fast-twitch hindlimb muscles after chronic electrical stimulation. Journal of Applied Physiology. 80 (3), 904-9 (1996).
8. Ebina, T., Hoshi, N., Kobayashi, M., et al. Physiological angiogenesis in electrically stimulated skeletal muscle in rabbits: characterization of capillary sprouting by ultrastructural 3-D reconstruction study. Pathology International. 52 (11), 702-12 (2002).
9. Zhao, M., Huai, B., Wang, E., Forrester, J.V., & McCaig, C.D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. Journal of Cell Science. 117, 397-405 (2004).
10. Nagasaka, M., Kohzuki, M., Fujii, T., et al. Effect of low-voltage electrical stimulation on angiogenic growth factors in ischaemic rat skeletal muscle. Clinical & Experimental Pharmacology & Physiology. 33 (7), 623-7 (2006).
11. Brutsaert, T.D., Gavin, T.P., Fu, Z., et al. Regional differences in expression of VEGF mRNA in rat gastrocnemius following 1 hr exercise or electrical stimulation. BMC Physiology. 2, 8 (2002).
12. Putman, C.T., Dusterhoft, S., & Pette, D. Changes in satellite cell content and myosin isoforms in low-frequency-stimulated fast muscle of hypothyroid rat. Journal of Applied Physiology. 86 (1), 40-51 (1999).
13. Monaghan, B., Caulfield, B., & O'Mathuna, D.P. Surface neuromuscular electrical stimulation for quadriceps strengthening pre and post total knee replacement. Cochrane Database Syst. Rev., CD007177 (2010).
14. Jubeau, M., Gondin, J., Martin, A., Sartorio, A., & Maffiuletti, N.A. Random motor unit activation by electrostimulation. Int. J. Sports Med. 28, 901-4 (2007).
15. Piva, S.R., Goodnite, E.A., Azuma, K., et al. Neuromuscular electrical stimulation and volitional exercise for individuals with rheumatoid arthritis: a multiple-patient case report. Physical Therapy. 87 (8), 1064-77 (2007).
16. Delitto, A., Rose, S.J., McKowen, J.M., Lehman, R.C., Thomas, J.A., & Shively, R.A. Electrical stimulation versus voluntary exercise in strengthening thigh musculature after anterior cruciate ligament surgery.[erratum appears in Phys Ther 1988 Jul;68(7):1145]. Physical Therapy. 68 (5), 660-3 (1988).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.