En musmodell av Muscle Training med neuromuskulära Elektrisk stimulering

Ambrosio, F., Fitzgerald, G. K., Ferrari, R., Distefano, G., Carvell, G. A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (63), e3914, doi:10.3791/3914 (2012).

Neuromuskulär elektrisk stimulering (NMES) är ett vanligt kliniskt tillvägagångssätt som ofta används för att återställa ^1, underhålla ² eller förbättra ^3-5 muskler funktionsförmåga. Transkutan ytan stimulering av skelett-muskel innebär en strömflöde mellan en katod och en anod, vilket inducerar spänning motorenheten och de omgivande muskelfibrer.

NMES är en attraktiv modalitet för att utvärdera skelettmuskelavslappnande adaptiva responser av flera skäl. Det första ger det ett reproducerbart experimentell modell, i vilken fysiologiska anpassningar, såsom myofiber hypertophy och muskelstärkande ^6, angiogenes ^7-9, tillväxtfaktorsekretion ^9-11, och muskel-prekursor-cellaktivering ¹² är väl dokumenterade. Sådana fysiologiska reaktioner kan titreras noggrant med hjälp av olika parametrar för stimulering (till Cochrane-översikt, se punkt ^13). Dessutom NMES rekryterarmotorenheterna icke-selektivt, och i en rumsligt fixerad och temporalt synkront sätt ¹⁴ som erbjuder den fördelen att utöva en behandlingseffekt på alla fibrer, oavsett vilken typ av fiber. Även om det finns särskilda kontraindikationer för NMES i kliniska populationer, inklusive perifera venösa sjukdomar eller malignitet, till exempel, är NMES säkert och genomförbart, även för dem som är sjuka och / eller sängliggande och för befolkningen i vilka rigorös träning kan vara utmanande.

Här visar vi protokollet för anpassning kommersiellt tillgängliga elektroderna och utför en NMES protokoll med användning av en murin modell. Denna djurmodell har fördelen av att använda en kliniskt tillgänglig anordning och ger omedelbar återkoppling om positionering av elektroden för att framkalla den önskade muskeln kontraktila effekten. För detta manuskript, kommer vi att beskriva protokollet för muskelstimulering av främre facket musklerna i en mus bakben.

1. Elektroden Framställning

• Skära en 1 cm X 1 cm sektion av vektorn kretskortet.
• Stabilisera 2 wirewrap stift med hjälp av en vice grepp, med stift placerade ca 3,5 mm från varandra. De förgrenade ändarna av stiften ska vara vänd uppåt.
• Böj wirewrap stift vid en 90 ° vinkel, ungefär halvvägs längs deras längd, med användning av näbbtång.
• Exponera koppartrådar av kontaktdon, cirka 7 cm från bly anslutning, genom strippning tråden isoleringen.
• Löd en av de koppartrådar till grenade slutet av en de wirewrap stiften. Upprepa steg lödning för den andra wirewrap tappen.
• Dra krympslang vid lödd koppling mellan koppar och guld stift för att isolera och stabiliseras. Värma slangen med användning av lödspets.
• Sätt unsoldered spetsarna på wirewrap stiften i angränsande öppningar skärbräda kretskortet.
• Säkerställa att wirewrap stiften är parallella med varandra och mICK genom kopplingsdäcket så att spetsarna är belägna på samma avstånd när den är placerad genom styrelsen.
• Bädda lödda ändarna av stiften i klar epoxi. Låt epoxin härda i ungefär 10 minuter, eller tills den är helt torr.
• Upprepa appliceringen av epoxi tills stiften och vektorn kretskortet är helt inbäddade i syfte att tillhandahålla strukturell integritet och spänningsavlastning för ledningstrådarna.
• Slipa epoxin med en metall-fil att exponera spetsarna på guld stiften.
• Använd en multimeter för att säkerställa att båda ledningarna är inte elektriskt kortslutna och att ledningarna har rätt kontinuitet
• Fäst elektroden leder från NMES enheten till kvinnliga 2-vägs sladdkopplingsdonet (Pomona korskopplingskabel).

2. Djur Framställning

• Djuren bedövas genom inhalation med användning av 2% isofluoran (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) i _100% O2-gas. Djuret ska vara sövd under tHan NMES session.
• Innan du börjar NMES protokollet utföra en tå nypa för att se till att djuret är helt bedövad.
• Djur bör kontrolleras regelbundet för svar på stimulering för att säkerställa den anestetiska nivå är tillräcklig. Anestesi bör justeras efter behov. Rörelse än den stimulerade benet, förändringar i luftvägarna djup och färg slemhinnor bör alla utvärderas regelbundet för att övervaka djupet av anestesi.
• Placera djuret i sidled VILA.
• Tillämpas oftalmisk smörjmedel till ögonen för att förhindra korneala torkning under förfarandet.
• Raka bakben område som ska behandlas och torka med alkohol.
• Torka av elektroden med 3% blekmedel och skölj sedan med vatten.
• Applicera ett skikt av ledande gel över den plats där elektroden kommer att tillämpas. Återapplicera efter behov under hela NMES protokollet för att säkerställa strömflöde mellan elektroden och huden.
• En värmelampa or cirkulerande vattnet täcke ska användas för att upprätthålla normala värden centrala kropp.
• OBS: Alla förfaranden har granskats och godkänts av University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use kommittén och utförs i säkerställd PHS och AAALAC Int. ackrediterat program och anläggningar.

3. Stimulering

• Elektrod placering:
  • För stimulering av främre kupé muskler, inklusive den främre tibialis-och extensor digitorum longus-muskeln, placera ytelektroden direkt över djurets djupa fibular nerv, som är en distal avgrena av den gemensamma peronealnerven, och är belägen precis främre till den fibular huvud.
  • För stimulering av främre fack muskler, är placering av elektroden bekräftas när stimulering framkallar fullt fotleden dorsalflexion och full utbyggnad av siffrorna. Å andra sidan, dorsiflexion, i frånvaro av siffran förlängning antyder att endast den tibialis förhandInterior muskeln stimuleras. En sådan riktad kontraktila svaret kan vara önskvärt, beroende på studiedesign.
  • Den muskelkontraktion är uppdelat i 2 faser stimuleringen: ett fritt rörliga, koncentrisk fas, som uppträder under den initiala ~ 0,5 sekunder. Under denna första fas, flyttar tassen från ett viloläge till maximal dorsalflexion och siffran förlängning. Den andra fasen av stimulans är en isometrisk kontraktion kvar på slutet sortiment dorsalflexion och siffran förlängning.
• Stimulation parametrar:
  • Detta NMES modell utnyttjar 300 PV Empi multifunktionell elektroterapi anordning, som ger 2 kanaler av konventionella NMES (se tabell). Vid tillämpningen av denna modell, endast 1 kanal som används.
  • Använda parametrarna innefattar symmetrisk vågform, en pulsvaraktighet på 150 ps och en frekvens av 50 Hz. Stimulering är satt till 5 sekunder, med ett 0,5 sekunders upprampning och en 0,5 andra ramp ned. Detta gör det möjligt att muskeln mer gradvis acclimate till stimulans. I det nuvarande protokollet, var off tid mellan värkarna satt till 10 sekunder, men detta kan justeras beroende på önskad effekt. Minskade från gånger kommer att resultera i en snabbare initiering av muskeltrötthet. Dessa stimulering parametrar baseras på kliniska protokoll för att öka muskelstyrkan med neuromuskulär elektrisk stimulering, utan att inducera betydande skelett muskelskada ^{1, 15, 16.}
  • Möss fylla två uppsättningar av 10 sammandragningar, med en 5 minuters vila mellan set.
  • För vuxna djur är NMES intensiteten vanligen initieras vid 9 mA. Från vår erfarenhet är detta ungefärliga att den maximala start intensitet som inte inducerar ett märkbar gång nedskrivning omedelbart efter stimulering. För efterföljande NMES sessioner är intensiteten ökas med 1 mA varje gång djuren kunna slutföra 20 fulla dorsiflexions.
• Efter slutförandet av stimuleringsprotokoll och recomycket från anestesi, djur visar oftast en normal gång och hållning. Rörelser bör förbli oförändrade under hela den tid som NMES programmet.

4. Representativa resultat

Den NMES protokoll som beskrivs i denna artikel har genomförts i flera musstammar, inklusive: Wild Type (B6/10) B6.SCID och MDX / SCID möss. Representativa resultat av NMES som utförts under 4 veckor (20 sessioner) i 3-5 månader gamla MDX / SCID presenteras.

Djuren humant avlivades genom cervikal dislokation under anestesi. Den främre tibialis-muskeln skördades och frystes omedelbart i 2-metyl-butan förväg kyld i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C. Seriella tvärsnitt (10 fim) erhölls och monterades på objektglas. Statistiska analyser utfördes med användning av vanliga statistiska programpaket (SPSS, v19.0 programvara). Först Levene-test används för att bedöma om det was lika varianser. Oberoende sampel t-test utfördes sedan för att undersöka skillnader mellan NMES och kontrollgrupperna.

Hematoxylin och eosin (H & E) fläckar utfördes för att undersöka om NMES protokollet skulle leda till ökad skada i dystrofisk muskeln. Ett avsnitt valdes, och bilder erhölls genom att använda ett ljusmikroskop (Nikon Eclipse E800, Nikon, Japan). Det totala antalet fibrer och antalet fibrer med centralt läge kärnorna manuellt räknades med National Institutes of Health (NIH) - utvecklad mjukvara för bildanalys, bild J. Det fanns ingen signifikant ökning i förnyelse index (antal centralt kärnförsedda fibrer / totalt antal fibrer) i djur som utsätts för NMES, jämfört med kontroller (p = 0,802, Figur 1). Detta tyder på att tillämpningen av NMES inte ökar degenerering-förnyelse kaskad observerats i dystrofa djur, och är därför inte troligtatt inducera en ökad muskelskada.

Immunofluorescerande färgning för CD31 utfördes för att undersöka effekten av 4-veckors NMES protokollet på muskel vaskularitet. I korthet var muskel sektioner fixerades i 4% formalin och blockeras med hjälp 5% hästserum (HS). Sektionerna inkuberades med en rått-anti-mus-primär antikropp (1:300 utspädning i 5% HS) och behandlades med en 555-märkt get-anti-rått-sekundär antikropp (1:300 utspädning i 5% HS). För att kvantifiera det totala antalet CD31-positiva celler var en sektion väljs, och fotograferades med användning av fluorescensmikroskopi (Nikon Eclipse E800; Japan). Det totala antalet kapillärer var manuellt räknades med användning av Northern Eclipse (Empix Imaging Inc.). Det fanns en signifikant ökning i antalet CD31-positiva celler i de djur som utsätts för NMES jämfört med kontrollerna (p <0,01, fig 2), vilket indikerar att NMES protokoll som beskrivits främjar skelettmuskel angiogenes.

In situ kontraktila test: Fyra veckor efter slutförandet av en NMES protokoll var kontraktila provning av främre facket musklerna som utförs med hjälp av en in situ testapparater (Model 809B, Aurora Scientific Inc, Kanada), stimulator (modell 701C, Aurora Scientific Inc , Kanada) och kraftomvandlare (Aurora Scientific Inc, Kanada). Kortfattat peronealnerven hos bedövade djur isoleras genom ett litet snitt i sidled till knäet. Mössen placerades sedan i ryggläge på en plattform och foten som testades placerad på fotplattan. Det bakben som används för testning stabiliserades med tyg tejp på knäet och foten. Muskler som stimulerades med en krok elektroder införda under huden. Muscle tetanisk kontraktion testades vid en frekvens av 150 Hz för 350ms att undersöka om 4-veckors NMES protokollet skulle leda till förbättringar i muskelstyrka. Resultaten normaliserades till våt muskelvikt. Det fanns en approximativt 30% ökning i tetanic kontraktion av djur som utsätts för NMES, jämfört med kontroller (p = 0,005) (Figur 3), vilket tyder på det protokoll som beskrivs förbättrar skelettmuskulaturen styrka i mdx / SCID djur.

. Figur 1 Hematoxylin & Eosin skelettmuskulaturen färgning av dystrofisk (MDX) / immundefekta möss (4-5 månader) (10x förstoring): a) obehandlade kontroller, B) efter 4 veckors NMES.

Figur 2. CD31 immunofluorescens (röd), som en markör för skelettmuskel vaskularitet, i skelettmuskulaturen av dystrofisk (MDX) / immundefekta möss (4-5 månader) (20x förstoring) A) obehandlade kontroller, B) efter 4 veckors NMES.

Figur 3. Kontraktil testningav de främre facket musklerna i kontroll och djur som behandlats med NMES för 4 veckor. mNm = milli Newtonmeter. Klicka här för att visa en större bild .

Dessa resultat tyder på att vår utvecklad musmodell av NMES främjar skelettmuskler angiogenes (figur 2) och förstärkning (Figur 3), men inte inducerar skelettmuskler skador (figur 1).

Det bör noteras att de stimulerande egenskaper som beskrivs här har konstruerats för att inducera en muskel överbelastning till de främre avdelningen muskler. Liksom är fallet med avseende på kliniska scenarier, kan elektroden placering justeras för att stimulera andra muskelgrupper, även om muskeln svar på NMES kan vara olika, beroende på fibertyp komposition. NMES löptid, det totala antalet behandlingstillfällen, och det totala antalet repetitioner kan modifieras enligt för att studera design.

Som med alla protokoll, har denna metod begränsningar som bör noteras. I den aktuella studien var stimulering utförs över den djupa fibular nerven. Men på kliniken, stimulans is ges vanligtvis på motorenheten. I djurmodellen, skulle stimulering av nerven kräver en lägre intensitet för att framkalla fullständig muskelsammandragning. En annan begränsning av modellen som presenterades är att vi inte kan få information om komfort vid tillämpningen av NMES, med tanke på att djuren bedövas. Därför är toleransen av jämförbara intensiteter i en klinisk population är svårt att bedöma. Men våra histologiska resultat tyder vår NMES modell, som beskrivits, inte inducerar muskelskada.

Utvecklingen av djurmodeller som efterliknar villkoren ofta genomförs i kliniken ger oss användbara laboratorium verktyg som möjliggör en bättre förståelse av cellulära och molekylära svar behandlingsåtgärder. Dessutom sådana modeller är användbara för att genomföra prekliniska studier för att både förfina befintliga rehabilitering protokoll och utveckla nya indikationer.

Vi har inget att lämna ut.

Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health (NIH) K12 för fysiska och arbetsterapeuter-Omfattande möjligheter i rehabiliteringsforskning utbildning (K12 HD055931), Stiftelsen för sjukgymnastik och Pittsburgh Claude D. Pepper äldre amerikaner Independence Center (P30 AG024827 ).

1. Snyder-Mackler, L., Delitto, A., Bailey, S.L., & Stralka, S.W. Strength of the quadriceps femoris muscle and functional recovery after reconstruction of the anterior cruciate ligament. A prospective, randomized clinical trial of electrical stimulation. Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume. 77 (8), 1166-73 (1995).
2. Gibson, J.N., Smith, K., & Rennie, M.J. Prevention of disuse muscle atrophy by means of electrical stimulation: maintenance of protein synthesis. Lancet. 2, 767-70 (1988).
3. Malatesta, D., Cattaneo, F., Dugnani, S., & Maffiuletti, N.A. Effects of electromyostimulation training and volleyball practice on jumping ability. Journal of Strength & Conditioning Research. 17 (3), 573-9 (2003).
4. Maffiuletti, N.A., Dugnani, S., Folz, M., Di Pierno, E., & Mauro, F. Effect of combined electrostimulation and plyometric training on vertical jump height. Med. Sci. Sports Exerc. 34, 1638-44 (2002).
5. Pichon, F., Chatard, J.C., Martin, A., & Cometti, G. Electrical stimulation and swimming performance. Med. Sci. Sports Exerc. 27, 1671-6 (1995).
6. Gondin, J., Guette, M., Ballay, Y., & Martin, A. Electromyostimulation training effects on neural drive and muscle architecture. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 1291-9 (2005).
7. Mathieu-Costello, O., Agey, P.J., Wu, L., Hang, J., & Adair, T.H. Capillary-to-fiber surface ratio in rat fast-twitch hindlimb muscles after chronic electrical stimulation. Journal of Applied Physiology. 80 (3), 904-9 (1996).
8. Ebina, T., Hoshi, N., Kobayashi, M., et al. Physiological angiogenesis in electrically stimulated skeletal muscle in rabbits: characterization of capillary sprouting by ultrastructural 3-D reconstruction study. Pathology International. 52 (11), 702-12 (2002).
9. Zhao, M., Huai, B., Wang, E., Forrester, J.V., & McCaig, C.D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. Journal of Cell Science. 117, 397-405 (2004).
10. Nagasaka, M., Kohzuki, M., Fujii, T., et al. Effect of low-voltage electrical stimulation on angiogenic growth factors in ischaemic rat skeletal muscle. Clinical & Experimental Pharmacology & Physiology. 33 (7), 623-7 (2006).
11. Brutsaert, T.D., Gavin, T.P., Fu, Z., et al. Regional differences in expression of VEGF mRNA in rat gastrocnemius following 1 hr exercise or electrical stimulation. BMC Physiology. 2, 8 (2002).
12. Putman, C.T., Dusterhoft, S., & Pette, D. Changes in satellite cell content and myosin isoforms in low-frequency-stimulated fast muscle of hypothyroid rat. Journal of Applied Physiology. 86 (1), 40-51 (1999).
13. Monaghan, B., Caulfield, B., & O'Mathuna, D.P. Surface neuromuscular electrical stimulation for quadriceps strengthening pre and post total knee replacement. Cochrane Database Syst. Rev., CD007177 (2010).
14. Jubeau, M., Gondin, J., Martin, A., Sartorio, A., & Maffiuletti, N.A. Random motor unit activation by electrostimulation. Int. J. Sports Med. 28, 901-4 (2007).
15. Piva, S.R., Goodnite, E.A., Azuma, K., et al. Neuromuscular electrical stimulation and volitional exercise for individuals with rheumatoid arthritis: a multiple-patient case report. Physical Therapy. 87 (8), 1064-77 (2007).
16. Delitto, A., Rose, S.J., McKowen, J.M., Lehman, R.C., Thomas, J.A., & Shively, R.A. Electrical stimulation versus voluntary exercise in strengthening thigh musculature after anterior cruciate ligament surgery.[erratum appears in Phys Ther 1988 Jul;68(7):1145]. Physical Therapy. 68 (5), 660-3 (1988).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.