Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

1. Voorbereiding van bacteriën voor LPS Extraction

1. Start een nacht cultuur in 5 ml Luria Broth (LB), aangevuld met antibiotica indien nodig. Groei cultuur overnacht (12-18 uur) in een schudincubator bij 37 ° C en 200 rpm.
2. Verdun de cultuur 1:10 met LB en neem een OD ₆₀₀ lezing in een spectrofotometer. Op basis van de OD ₆₀₀ lezen, maak dan een 1,5 ml schorsing van uw bacteriën om een OD ₆₀₀ van 0,5.
3. Pellet de bacteriën in een microcentrifuge bij 10.600 x g gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof. De pellet kan worden opgeslagen bij -20 ° C, indien LPS niet zal onmiddellijk geëxtraheerd.

2. Extractie van LPS

1. In de eerste plaats voor te bereiden 2x SDS buffer. Een 50 ml oplossing van 4% β-mercaptoethanol (BME), 4% SDS en 20% glycerol in 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Voeg een snufje broomfenolblauw om de oplossing te verven. Maak een 1x SDS-buffer voorraad door te verdunnen 2X stock 1:1 in steriel gedistilleerd H ₂ O. Dit kan bij kamertemperatuur bewaard.
2. Merk drie afzonderlijke 10 mg / ml oplossing van DNase I, RNase en Proteinase K in steriel gedestilleerd _H2O
3. Resuspenderen de gepelleteerde bacteriën stap 1,3 in 200 ul 1 x SDS-buffer. Zorg ervoor dat de pellet volledig geresuspendeerd door pipetteren de oplossing op en neer te langzaam. Doe niet vortex.
4. Kook de gesuspendeerde bacteriën in een waterbad gedurende 15 minuten. Laat de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten afkoelen.
5. Voeg 5 pi van zowel DNase I en RNase bereide 2.2. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 30 minuten. * Deze stap is optioneel, er nauwelijks verschil in de kwaliteit van LPS tussen nuclease behandeld en onbehandeld monsters.
6. Voeg 10 ul van de Proteinase K bereid in 2.2. Incubeer de monsters bij 59 ° C gedurende 3 uur. Deze stap kan 's nachts worden uitgevoerd, als er tijdsdruk.
7. Voor elk monster, add 200 ul ijskoude Tris-verzadigde fenol (water verzadigde fenol kunnen worden gebruikt als vervanging of Tris-verzadigde fenol niet beschikbaar is). Controleer de doppen op de buizen stevig gesloten en vortex elk monster gedurende 5 tot 10 seconden.
8. Incubeer de monsters bij 65 ° C gedurende 15 minuten, toe te vortexen. Na incubatie afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens 1 ml kamertemperatuur diethylether aan elk monster en vortex 5 tot 10 seconden. Zorg ervoor dat u handvat ether uit te voeren in een zuurkast, want het is vluchtig.
9. Centrifugeer de monsters 20600 x g gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de monsters uit de centrifuge en haal de onderste blauwe laag. Zorg ervoor dat de bovenste, heldere laag te voorkomen. Achterlating van een kleine hoeveelheid van de blauwe laag voorkeur besmetting met de bovenste laag.
10. Opnieuw uit te pakken de monsters door het herhalen van de stappen 2.7 - 2.9. Twee extracties meestal voldoende. Als de monsters lijkt troebel, kan meer extracties worden de presenced. Voeg 200 ul 2x SDS-buffer aan elk van de geëxtraheerde monsters voor scheiden door SDS-PAGE. Monsters kunnen worden uitgevoerd op 8% -15% SDS-polyacrylamide gels. Vijf tot vijftien ul van LPS opgesteld op basis van deze methode is meestal voldoende voor visualisatie.

3. Representatieve resultaten

LPS monsters bereid zoals hierboven gevisualiseerd door aankleuring direct volgend scheiding op SDS-PAGE met een standaard zilver kleuringsprotocol of een commercieel verkrijgbare kit LPS kleuring. Als alternatief kan LPS gescheiden op een polyacrylamide gel worden overgebracht naar een nitrocellulose membraan onderworpen aan Western immunoblotting met LPS-specifieke antisera. Voor dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit (Molecular Probes), en volgde de instructies van de fabrikant.

In figuur 1 is een Pro-Q Emerald 300 gekleurde 12% SDS-polyacrylamidegel. Elke baan bevat 15 pi LPS bereid uit diflende stammen van Burkholderia dolosa geïsoleerd uit sputum monsters van cystic fibrosis patiënten. Verschillende LPS strepen ladder patronen reflecterende verschillende getallen O-antigen herhalende eenheden aan kern oligosaccharide, zijn duidelijk deze methode, bijvoorbeeld monsters in laan 1 en 6 hebben soortgelijke bandenpatronen elkaar (doos in rood).

Figuur 1. Pro-Q Emerald 300 gekleurde LPS van Burkholderia dolosa klinische isolaten. LPS zeven B. dolosa stammen van een uitbraak bij cystic fibrosis patiënten werden geïsoleerd zoals beschreven in dit protocol. Vijftien ul werden gescheiden op een 12% SDS-polyacrylamidegel en gekleurd met Pro-Q Emerald 300 volgens de instructies van de fabrikant. LPS kern is aangegeven een pijl, en LPS met soortgelijke strepen patronen van O-antigeen herhalingen zijn verpakt in rood. M = molecuulmassa marker.

Wij hebben een werkwijze beschreven voor het zuiveren van LPS afstand van andere cellulaire componenten, zoals nucleïnezuren en eiwitten. Deze methode levert hoogwaardige LPS die gebruikt kunnen worden in verschillende gebruikelijke methoden, zoals koolhydraten kleuring van SDS-PAGE gels, zoals weergegeven in figuur 1. Deze methode kan worden gebruikt om LPS serotype van verschillende stammen, met specifieke antisera, of verwantschap tonen tussen isolaten door directe visualisatie. Bijvoorbeeld, een recente genoom-brede sequencing project in combinatie met LPS karakterisering van een uitbraak van B. dolosa geleid tot de ontdekking van een nucleotide polymorfisme (SNP) dat samenhangt met de aanwezigheid en afwezigheid van LPS in deze stammen ^11. Wij denken dat deze methode de voorkeur om de behandeling van volledige protease-cellysaten beschreven Hitchcock en Brown ^9, omdat dit een relatief snel, maar zwaar genoeg om hoogwaardige LPS voor verdere analyse opleverens.

Hoewel we alleen een voorbeeld volgens de Burkholderia dolosa kan dit protocol worden aangepast aan andere Gram-negatieve soorten. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze protocol om uit te pakken en LPS visualiseren van andere Burkholderia spp., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa en Salmonella spp. Als het protocol levert weinig of geen LPS opbrengst kan het zijn dat de LPS fractioneert naar een andere laag in de extractiestappen, 2,7-2,9. Om deze problemen, het protocol te herhalen en opslaan van een steekproef van elke laag bij de extractie stappen, kunnen deze worden gevisualiseerd door kleuring een SDS-PAGE gel om waar de LPS fractioneert te bepalen, en het protocol dienovereenkomstig kunnen worden gewijzigd. Ook moet worden opgemerkt dat dit protocol, maar ideaal voor analytische doeleinden, niet LPS die geschikt is voor andere toepassingen, zoals structurele analyses opleveren.