Høj opløsning Live-Imaging af celle adfærd i udviklingslandene neuroepitel

Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920, doi:10.3791/3920 (2012).

Den embryoniske rygmarv består af cykler neurale progenitorceller, der giver anledning til en stor procentdel af de neuronale og gliale celler i centralnervesystemet (CNS). Selvom meget vides om de molekylære mekanismer, der mønster rygmarven og fremkalde neuronal differentiering ^{1, 2,} mangler vi en dyb forståelse af disse tidlige begivenheder på niveauet af celle adfærd. Det er således afgørende at studere opførsel af neurale progenitorceller i realtid, når de underkastes neurogenese.

Tidligere tidstro billeddannelse af tidlig embryonisk væv er begrænset af celler / væv levedygtighed i kultur samt fototoksiske virkning af fluorescerende billeddannelse. Her udgør en hidtil ukendt assay for billeddannelse sådant væv i længere tidsperioder, under anvendelse af en hidtil ukendt ex vivo skive kultur protokol og bredt område fluorescensmikroskopi (fig. 1). Denne fremgangsmåde opnår langsigtet time-lapse overvågning af Chick embryonale sPinal ledningen stamceller med høj rumlig og tidsmæssig opløsning.

Denne analyse kan modificeres til billede en række embryonale væv ^{3, 4} Ud over observation af cellulære og subcellulære adfærd, udvikling af nye og meget følsomme journalister for geners aktivitet (for eksempel, Notch signalering ⁵⁾ gør denne analyse et magtfuldt redskab til at forstå, hvordan signalering regulerer celle adfærd under fosterudviklingen.

1. Dish Forberedelse

1. Retter, der anvendes til skive kultur er glasbund (med et dækglas som base) (WillCo retter). Disse er placeret på linsevævet i en 6 cm vævsdyrkningsskål at holde glasset bunden ren.
2. På dagen før forsøget, der tilsættes 2 ml 0,1% poly-L-lysinopløsningen til glasset bund skålen og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur for at tillade poly-L-lysin til overtrækning af glasset bunden.
3. Fjerne poly-L-lysinopløsningen og skylles tre gange i deioniseret vand og derefter en gang i 70% ethanol.
4. Lad det tørre natten over. Retter kan også tørres ved forsigtigt at opvarme i en mikrobølgeovn med lav effekt i 30-45 sekunder.

2. Embryo Elektroporation

1. Inkuberes æggene ved 37 ° C i Hamburger-Hamilton (HH) trin 10 (ca. 36 timer) (eller anden ønsket stadium).
2. Inden du begynder forberede glas nåle (vi bruger en Flaming / Brown model p87 mikrokapillær aftrækker) og brække spidsen af ​​needle hjælp af en fin pincet under et dissektionsmikroskop. Den ende af kanylen skal være skarp nok til at gennembore embryo uden at være så smal, at det hæmmer injektion af DNA-opløsning.
3. Window æg og placere elektroder (5mm mellemrum) på hver side af fosteret
4. Injicere DNA (~ 0,025-0,5 mg / ul i deioniseret vand farvet med en lille mængde fast green) i neuralrøret.
5. Anvend nuværende - 12-17 V tre gange, 50ms pulslængde med 950 ms mellem pulser.
6. Vi bruger lave koncentrationer af DNA og lave elektroporeringsteknikker spændinger til at opnå mosaik udtryk, så vi kan følge de enkelte celler.
7. Dæk vindue i æggeskallen med tape, og sørg for at det er forseglet.
8. Tillad embryoner at inddrive i 3-4 timer eller natten over ved 37 ° C.

3. Kollagen og Slice dyrkninqsmedium Forberedelse

1. Forbered kollagen mix og skive dyrkningsmediet cirka en time før udskæring.
2. Til 300 gl tART en collagen tilsættes 100 ul 0,1% eddikesyre-opløsning og 100 gl 5 x L15 medium. Vortex grundigt efter hver tilsætning. Løsningen skal blive gul.
3. Nu tilsættes 15-20 ul 7,5% natriumbicarbonat og grundigt vortex. Opløsningen bør være svagt lyserødt, og mængden af ​​natriumbicarbonat der kræves til denne kan variere. Hold på is og fyldes op frisk hver gang.
4. Til 10 ml Neurobasal medium tilsættes B-27 supplement og Glutamax, at en 1 x slutkoncentration, og 10 pi Gentamicin-opløsning.
5. Sted medium i en 37 ° C inkubator pufret med _5% CO2. Forlader toppen af beholderen løs for at gøre det muligt at ækvilibrere med _CO2.

4. Slice Kultur

1. Fjern embryoner fra æg og vaskes i L15 medium.
2. Sted i en vævskulturskål med et lag af Sylgard ved bunden og pin dem ud gennem de omgivende ekstra-embryonale membraner, så de er spændt.
3. Ved hjælp af en mikrofonroknife, skive foster så lige som muligt gennem region af interesse. For rygmarv, bør skiverne være mellem 1-2 somitter tykke. Lad skiver knyttet til embryo, mens du skærer andre embryoner, så du ikke mister dem.
4. Fremstilling af en 200 gl mikropipettespids ved afskæring ~ 1 mm af spidsen og fastgøre denne til en p2 eller p10. Denne spids vil blive anvendt til at overføre rygmarv skiver til glasset bunden skål. En 10 gl tip er ikke bred nok til at opfange skiver.
5. Coat indersiden af ​​spidsen med collagen ved pipettering af 1 ul collagen blandes fremstillet tidligere. Lad i 1-2 minutter og skyl derefter med L15 medium. Dette vil forhindre vævet i at klæbe til indersiden af ​​spidsen.
6. Frigør skive fra embryoer ved hjælp af en microknife og fjerne fra skålen ved anvendelse af en P2 eller p10 forsynet med en 200 ul spids og sat til en pi. Forsøger at optage så lidt medium som muligt.
7. Vortex kollagen blandingen og dråbe 5-8 ul af denne på poly-L-lysin-overtrukne skål.
8. Immediadigt sikrer sat embryo skive i kollagen og position på plads med et par fine tænger. Skiver skal anbringes, så at siden, der skal afbildes flugter med dækglas. Vævet bør klæbe til poly-L-lysin belægning på dækglasset.
9. Gentag dette indtil du har flere skiver på dækglasset. Vi kan som regel placere 6-9 skiver på en tallerken.
10. Når alle skiverne er på plads, omfatter skålen og tillade collagen for at indstille i 20 minutter. Nogle af de tidligste placeret kollagen måske allerede er begyndt at tørre ud. For at forhindre dette tilføje en lille mængde L15 til disse, før der dækker.
11. Når de er indstillet, tilsættes forsigtigt 2 ml skive dyrkningsmedium, som er blevet ækvilibreret i _5% CO2 ved 37 ° C i mindst en time. Må drages omsorg for ikke at frigøre kollagen fra dækglasset.
12. Sted i et 37 ° C / _5% CO2 inkubator og tillade skiver til at komme sig i mindst 3 timer før imagografi. Hvis der ikke er nogen fugtighed, sted skål i en Perspex-kasse vidha lidt fugtigt papir i det ene hjørne.

5. Imaging Embryo Skiver

1. Vi bruger en DeltaVision Core bredt felt mikroskop udstyret med en Weatherstation miljømæssigt kammer til billede skiver. Kammeret holdes konstant ved 37 ° C med en CO ₂ perfusion apparat til at opretholde mikroskopbordet ved _5% CO2 / 95% luft.
2. Imaging normalt udføres ved hjælp af en 40 x / 1,30 NA olieimmersion objektiv og billeder er taget med et CoolSnap HQ2 afkølet CCD-kamera.
3. Z-snit taget hver 1,5 um til 45 um væv. Ekspositionsperioden holdes så lavt som muligt. Vi normalt udsættes for 5-50 ms for hver Z-sektion. Billeder er fanget hver 7 minutter og op til 9 skiver kan besøges ved hjælp af DeltaVision systemets præcise punkt besøge funktion.

6. Repræsentative resultater

Et eksempel tidsforløb sekvens af en rygmarven progenitorcelle ervist i fig. 2a og tilsvarende film 1. Imaging blev startet på en rygmarven skive fra en to dage gammel (HH trin 12) embryo. Denne celle blev transficeret med en konstruktion, som udtrykker GFP-αTubulin. Under denne tidlige fase underkastes neurale progenitorceller overvejende progenitor-stamceller tilstand divisioner under hvilken cellerne deler at frembringe to yderligere cykling progenitorceller. Fig. 2b og tilsvarende film 2 viser en celle transficeret med GFP-GPI (GPI-forankret GFP), mærkning cellemembranen. Denne celle gennemgår en division, hvor den basale proces, deler sig i to, og er lige arvet af datteren celler.

Figur 1. Slice kultur protokol for time-lapse billeddannelse.

Figur 2. Celle behavior under normal rygmarv udvikling. (a) udvalgte billeder fra Film 1. Celle, der udtrykker GFP-tubulin opdeler en spaltning plan som er vinkelret på den apikale overflade (2 h 20 min), hvilket genererer to datterceller, som deler igen (24 h 23 min og 25 h 54 min). (B) Udvalgte billeder fra Movie 2. Celle transficeret med GFP-GPI undergår celledeling, i hvilken den basale fremgangsmåde spaltes (hvide pile) og ligeledes arves af datterceller.

Movie 1. Klik her for at se filmen .

Movie 2. Klik her for at se filmen .

Vi præsenterer her en ny time-lapse imaging-analysen til overvågning celle adfærd i kylling embryonale skive kultur. Denne analyse muliggør høj opløsning billeddannelse af levende væv i op til 70 timer, selv om tidsfristerne mellem 24-48 timer er nemmere at fange. Anvendelsen af ​​en høj NA olie formål og relativt korte intervaller mellem tidspunkter muliggør billedoptagelse ved høj opløsning, samt tillader os at overvåge celle adfærd, der ofte forekommer hurtigt, og kan let glemte under konventionel tidsforløb billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi.

Den største fordel ved dette assay er evnen til at afbilde celler over lange tidsperioder. Anvendelse af bredt felt ⁶ i stedet for konfokal laser scanning ⁷ mikroskopi er kritisk for denne. Konfokal mikroskopi har traditionelt tilbudt flere fordele i forhold til brede felt mikroskopi, herunder evnen til at tage optiske sektioner og eliminere ude af fokus oplysninger direkte 8, bortset fra en betydelig mængde information, og nødvendiggør længere eksponeringstider. Bredt synsfelt mikroskopi på den anden side bruger hele feltbelysning og al lyset passerer gennem det formål sendes til detektoren. Dette koblet med en høj kvantevirkningsgraden afkølet coupled device (CCD) kamera sikrer billeddannelse med et højt signal-til-støj-forholdet sammenlignet med konfokal mikroskopi ^9, med meget hurtige eksponeringstid. I vores ansøgning, skal vi billedet i lange perioder, optage 3D-stakke og i sidste ende løse små-nær-diffraktion begrænsede strukturer. Selv konfokal mikroskopi forhindrer ud-af-fokus lys fra nogensinde at nå detektoren og således reducerer baggrunden for tykke, tæt-mærkede prøver ^{7, 8,} der kun opnås en brugbart signal-støj-forhold med meget større lys input end bred- felt mikroskopi ^10. For meget lysfølsomme sparsely-mærkede prøver som vores elektroporerede rygmarvs skiver, derfor bredt felt mikroskopi præsterer bedre end konfokal mikroskopi. Når det kombineres med billede restaurering af udfoldning, som fjerner ude af fokus information og forbedrer kontrast, bred-feltet er så særlig god til påvisning af små, lyssvage ting ^11. Selvom det ikke er hensigtsmæssigt for alle væv billedbehandling eksperiment, har denne fremgangsmåde været meget effektiv til vores live cell imaging program.

Valget af fluorescerende protein er en vigtig faktor, der kan påvirke celleoverlevelse. Vi finder, at de bedste resultater opnås ud fra konstruktioner, der anvender grønt fluorescerende protein (GFP) ¹² som en markør. Vi vurderer i øjeblikket en række af røde fluorescerende proteiner, der effektivt kan anvendes i kombination med GFP for dual-kanal tid-bortfalder. Der er en række af sådanne proteiner tilgængelige ^13.. Selv om mange proteiner er stabile som fusioner med et fluorescerende proteinKan nogle proteiner gøres ustabil ved fusion, hvilket resulterer i reduceret cellelevedygtighed. I sådanne tilfælde er anvendelsen af ​​konstruktioner indeholdende en indre ribosom-adgangssite (IRES) nyttigt at adskille proteinet af interesse fra det fluorescerende protein.

Når billedbehandling rygmarvs skiver, skal der drages omsorg for at minimere udsættelse for fluorescerende lys. De mikroskop okularer må kun anvendes med lys (lysfelt) til at lokalisere og position skiver. Fluorescerende billeder bør altid erhverves ved hjælp af mikroskop software ved hjælp af minimal eksponering gange. Disse bør holdes i området 5-50 ms, og anvendelsen af ​​neutralfiltre bør eksperimenteret med. Skønt længere eksponeringstider indledningsvis kan frembringe klare billeder kan fototoksiske effekt af fluorescerende lys udsættelse føre til celledød. De første 5-10 um væv, der er tættest på dækglasset bør ikke afbildes som denne region indeholder væv, der kan være blevet beskadiget underudskæring.

Selv om eksemplerne her, er af embryoner elektroporeret på HH stadium 10 og filmede 6-7 timer senere, kan denne metode bruges til embryoner op til HH scenen 18. På senere stadier, er det rygmarvsvæv meget større, og således er vanskeligt at skære i hånden. I disse tilfælde kan indlejring embryoner i agarose med lavt smeltepunkt og udskæring med en vibratome giver bedre resultater. Selvom vi præsentere dette assay som en fremgangsmåde til billeddannelse celler i den udviklende rygmarv, er denne fremgangsmåde også blevet modificeret til at afbilde andre embryoniske væv, herunder den sensoriske placodes ^3.

Ingen interessekonflikter erklæret.

1. Ulloa, F. & Briscoe, J. Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord. Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).
2. Briscoe, J. & Novitch, B.G. Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).
3. Shiau, C., Das, R., & Storey, K. An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis. BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).
4. Wilcock, A.C., Swedlow, J.R., & Storey, K.G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
5. Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J.R., Storey, K.G., & Henrique, D. A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis. BMC Biology. 9, 58 (2011).
6. Herman, B. Fluorescence microscopy. Bios Scientific Publishers, (1998).
7. Conchello, J.-A. & Lichtman, J.W. Optical sectioning microscopy. Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).
8. Pawley, J.B. Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J.B., ed., Springer US, 20-42 (2006).
9. Swedlow, J.R., Hu, K., Andrews, P.D., Roos, D.S., & Murray, J.M. Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).
10. Murray, J.M., Appleton, P.L., Swedlow, J.R., & Waters, J.C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).
11. Biggs, D.S.C. 3D Deconvolution Microscopy. In: Current Protocols in Cytometry., John Wiley & Sons, Inc., (2001).
12. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., & Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
13. Wiedenmann, J., Oswald, F., & Nienhaus, G.U. Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.