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 JoVE Biology

Électrophorèse sur gel d'agarose pour la séparation de fragments d'ADN

1, 1, 1, 1

1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California Los Angeles

Article
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    Summary

    Un protocole de base pour la séparation des fragments d'ADN sur gel d'agarose en utilisant est décrite.

    Date Published: 4/20/2012, Issue 62; doi: 10.3791/3923

    Cite this Article

    Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).

    Abstract

    Électrophorèse sur gel est le moyen le plus efficace de séparer des fragments d'ADN de différentes tailles allant de 100 pb à 25 kb 1. Agarose est isolé de la génération d'algues Gelidium et Gracilaria, et se compose de agarobiose répétée (L et D-galactose) sous-unités 2. Pendant la gélification, les polymères d'agarose associer de manière non covalente et forment un réseau de faisceaux dont les tailles des pores de déterminer une moléculaires gel de propriétés de tamisage. L'utilisation de gel d'agarose a révolutionné la séparation de l'ADN. Avant l'adoption des gels d'agarose, l'ADN a été principalement séparées par centrifugation sur gradient de saccharose de densité, qui ne donnent qu'une approximation de la taille. Pour séparer l'ADN en utilisant électrophorèse sur gel, l'ADN est chargé dans préfabriqués puits dans le gel et un courant appliqué. Le squelette phosphate de l'ADN (et ARN) molécule chargée négativement est, par conséquent, lorsqu'il est placé dans un champ électrique, des fragments d'ADN de migrer vers l'positively chargée d'anode. Fait que l'ADN a une uniforme rapport masse / charge, des molécules d'ADN sont séparés par la taille dans un gel d'agarose dans un motif de telle sorte que la distance parcourue est inversement proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire 3. Le modèle de premier plan pour un mouvement d'ADN à travers un gel d'agarose est "polarisée reptation", grâce à quoi le bord d'attaque se déplace vers l'avant et tire le reste de la molécule long 4. Le taux de migration d'une molécule d'ADN dans un gel est déterminée par le suivant: 1) taille de molécule d'ADN; 2) la concentration d'agarose; conformation de l'ADN 3) 5, 4) de tension appliquées, 5) la présence de bromure d'éthidium, 6) de type de tampon d'électrophorèse agarose et 7). Après la séparation, les molécules d'ADN peuvent être visualisés sous lumière UV après coloration avec un colorant approprié. En suivant ce protocole, les élèves devraient être en mesure de:

    1. Comprendre le mécanisme par lequel des fragments d'ADN sont séparés au sein d'une matrice de gel
    2. Comprendre comment la conformation de laMolécule d'ADN permettra de déterminer sa mobilité grâce à une matrice de gel
    3. Identifier une solution d'agarose à la concentration appropriée à leurs besoins
    4. Préparer un gel d'agarose pour l'électrophorèse d'échantillons d'ADN
    5. Mettre en place l'appareil d'électrophorèse sur gel et l'alimentation
    6. Sélectionner une tension appropriée pour la séparation de fragments d'ADN
    7. Comprendre le mécanisme par lequel le bromure d'éthidium permet la visualisation des bandes d'ADN
    8. Déterminez la taille de fragments d'ADN séparés

    Protocol

    1. Préparation du gel

    1. Peser la masse appropriée d'agarose dans un erlenmeyer. Gels d'agarose sont préparés en utilisant aw / solution pourcentage v. La concentration d'agarose dans un gel dépend des tailles des fragments d'ADN à séparer, avec la plupart des gels comprises entre 0,5% -2%. Le volume de la mémoire tampon ne doit pas être supérieure à 1/3 de la capacité du ballon.
    2. Ajouter en cours d'exécution dans le ballon tampon d'agarose contenant. Agiter pour mélanger. Le gel le plus commun en cours d'exécution tampons sont TAE (40 mM Tris-acétate, 1 mM EDTA) et l'encéphalite à tiques (45 mM Tris-borate, EDTA 1 mM).
    3. Faire fondre le mélange d'agarose / tampon. Ceci est le plus souvent effectuée par chauffage dans un micro-ondes, mais peut aussi être fait sur un bec Bunsen. A intervalles s 30, retirer la fiole et agiter le contenu pour bien mélanger. Répétez jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous.
    4. Ajouter du bromure d'éthidium (BET) à une concentration de 0,5 ug / ml. Sinon, le gel peut également être coloré après électrophorèse dans la gestion de tampon contenant 0,5 pg / ml EtBr pendant 15-30 min, suivie par décoloration dans la gestion de mémoire tampon pour une longueur égale de temps.

    Remarque: EtBr est un carcinogène présumé et doit être correctement éliminés conformément aux règlements des institutions. Les gants doivent toujours être portés lors de la manipulation des gels contenant EtBr. Colorants alternatives pour la coloration de l'ADN sont disponibles, mais EtBr reste le plus populaire en raison de sa sensibilité et de coût.

    1. Permettre à de l'agarose pour refroidir directement sur la table ou par incubation dans un bain de 65 ° C l'eau. Ne pas le faire se déformera la gouttière.
    2. Placez le plateau de gel dans l'appareil de coulée. Alternativement, on peut aussi coller les bords ouverts d'un plateau de gel pour créer un moule. Placez un peigne approprié dans le moule de gel pour créer des puits.
    3. Verser l'agarose fondu dans le moule de gel. Laisser l'agarose à mettre à la température ambiante. Retirer le peigne et placer le gel dans la boîte de gel. Alternativement, le gel peut aussi être emballé dans une pellicule plastique et conservés à 4 ° C jusqu'à son utilisation (Fig. 1).

    2. Mise en place des appareils de gel et de la séparation de fragments d'ADN

    1. Ajouter le colorant de charge à des échantillons d'ADN à séparer (fig. 2). Gel colorant de chargement est généralement faite à la concentration 6X (0,25% bleu de bromophénol, cyanol xylène 0,25%, 30% de glycérol). Chargement de colorant permet de suivre dans quelle mesure votre échantillon d'ADN a voyagé, et permet également l'échantillon de sombrer dans le gel.
    2. Programme l'alimentation de tension de consigne (1-5V/cm entre des électrodes).
    3. Ajouter suffisamment de mémoire tampon en cours d'exécution afin de couvrir la surface du gel. Il est important d'utiliser le même tampon en cours d'exécution que celui utilisé pour préparer le gel.
    4. Attacher les conducteurs de la boîte de gel à l'alimentation électrique. Allumez l'alimentation électrique et vérifier que la boîte de gel à la fois et l'alimentation sont de travail.
    5. Retirez le couvercle. Lentementet charger soigneusement l'échantillon d'ADN (s) dans le gel (fig. 3). Un marqueur d'ADN appropriée taille doit toujours être chargé avec des échantillons expérimentaux.
    6. Replacez le couvercle de la boîte de gel. La cathode (fils noirs) devrait être plus proche des puits que l'anode (fil rouge). Vérifiez que les électrodes sont branchées sur les emplacements corrects dans l'alimentation.
    7. Tournez sur la puissance. Exécuter le gel jusqu'à ce que le colorant a migré à une distance appropriée.

    3. Observant des fragments d'ADN séparés

    1. Lorsque l'électrophorèse est terminée, éteignez l'alimentation et retirez le couvercle de la boîte de gel.
    2. Retirer le gel à partir de la boîte de gel. Égoutter le tampon en excès de la surface du gel. Placez le plateau de gel sur du papier absorbant pour absorber tout tampon supplémentaire en cours d'exécution.
    3. Retirer le gel à partir de la gouttière et d'exposer le gel à la lumière UV. Cela est généralement fait en utilisant un système de documentation de gel (fig. 4). Les bandes d'ADN devrait montreren tant oranges bandes fluorescentes. Prenez une photo du gel (Fig. 5).
    4. Mettre au rebut le gel et le tampon en cours d'exécution par les règlements des institutions.

    4. Les résultats représentatifs

    La figure 5 représente un résultat typique après électrophorèse sur gel d'agarose des produits de PCR Après la séparation, les fragments d'ADN résultants sont visibles sous forme de bandes clairement définies. La norme d'ADN ou de l'échelle doivent être séparés à un degré qui permet de déterminer utile de la taille des bandes de l'échantillon. Dans l'exemple illustré, des fragments d'ADN de 765 pb, 880 pb et 1022 pb sont séparés sur un gel d'agarose 1,5% avec une échelle d'ADN de 2 log.

    Figure 1.
    Figure 1. Un gel d'agarose solidifié après le retrait du peigne.

    Figure 2.
    Figure 2. Un étudiant en ajoutant un colorant de chargement et ses échantillons d'ADN.

    Figure 3.
    Figure 3. Un étudiant chargement de l'échantillon d'ADN dans un puits dans le gel.

    Figure 4.
    Figure 4. Un exemple d'un système de documentation de gel.

    Figure 5.
    Figure 5. Une image d'une électrophorèse sur gel après. EtBr a été ajouté à l'électrophorèse sur gel avant à une concentration finale de 0,5 ug / ml, suivie d'une séparation à 100 V pendant 1 heure. Le gel a été exposé à la lumière UV et la photo prise avec un système de documentation de gel.

    Discussion

    Électrophorèse sur gel s'est avéré être un moyen efficient et efficace de séparation des acides nucléiques. La force d'agarose de gel élevée permet la manipulation de gels de pourcentage faible pour la séparation de fragments d'ADN de grande taille. Tamisage moléculaire est déterminé par la taille de pores générés par les faisceaux d'agarose 7 dans la matrice de gel. En général, plus la concentration d'agarose, le plus petit de la taille des pores. Traditionnelles des gels d'agarose sont les plus efficaces à la séparation de fragments d'ADN entre 100 pb et 25 ko. Pour séparer des fragments d'ADN de plus de 25 ko, on aura besoin d'utiliser électrophorèse en champ pulsé 6, qui implique l'application d'un courant alternatif à partir de deux directions différentes. De cette façon, les grandes fragments d'ADN de taille sont séparés par la vitesse à laquelle ils se réorienter avec les changements de direction actuelle. Petits fragments d'ADN de 100 pb sont plus efficacement séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide Contrairement àdes gels d'agarose, la matrice en gel de polyacrylamide est formé par une réaction chimique radicalaire libre entraîné. Ces gels sont plus minces de concentration plus élevée, sont exécutés à la verticale et ont une meilleure résolution. Dans l'ADN moderne séquençage électrophorèse capillaire est utilisé, lequel tubes capillaires sont remplis d'une matrice de gel. L'utilisation de tubes capillaires permet l'application de tensions élevées, ce qui permet la séparation des fragments d'ADN (et la détermination de la séquence d'ADN) rapidement.

    Agarose peut être modifiée pour créer de fusion bas agarose par hydroxyéthylation. Bas point de fusion d'agarose est généralement utilisée lorsque l'isolement de fragments d'ADN séparés est souhaitée. Hydroxyéthylation réduit la densité de tassement des faisceaux d'agarose, de réduire efficacement la taille de pore 8. Cela signifie qu'un fragment d'ADN de la même taille prendra plus de temps à se déplacer à travers un bas point de fusion gel d'agarose, par opposition à un gel d'agarose norme. Parce que les faisceaux de s'associer à un autrepar le biais des interactions non covalentes 9, il est possible de faire fondre un gel d'agarose après qu'il s'est fixés.

    EtBr est le réactif le plus couramment utilisé pour colorer l'ADN dans des gels d'agarose 10. Lorsqu'ils sont exposés à la lumière UV, les électrons dans le noyau aromatique de la molécule d'éthidium sont activés, ce qui conduit à la libération de l'énergie (la lumière) que le retour des électrons à l'état fondamental. EtBr fonctionne par lui-même intercalant dans la molécule d'ADN d'une manière dépendante de la concentration. Cela permet une estimation de la quantité d'ADN dans une bande d'ADN notamment en fonction de son intensité. En raison de sa charge positive, l'utilisation de EtBr réduit le taux de migration de l'ADN de 15%. EtBr est un mutagène et cancérogène suspect, donc il faut faire preuve de prudence lors de la manipulation des gels d'agarose qui en contiennent. En outre, EtBr est considéré comme un déchet dangereux et doivent être éliminés de façon appropriée. Les taches de rechange pour l'ADN dans des gels d'agarose comprennent SYBR Gold, SYBR green, cristal violet et de bleu de méthylène. Parmi ceux-ci,Méthyl bleu violet cristallisé et ne nécessitent pas l'exposition du gel à une lumière UV pour la visualisation des bandes d'ADN, ce qui réduit la probabilité d'une mutation si le recouvrement du fragment d'ADN à partir du gel est souhaitée. Toutefois, leurs sensibilités sont plus bas que celui de EtBr. SYBR or et vert SYBR sont deux très sensibles, uv colorants dépendants avec moins de toxicité que EtBr, mais ils sont nettement plus chères. En outre, tous les colorants alternatifs soit ne peut pas être ou ne fonctionnent pas bien lorsqu'il est ajouté directement au gel, par conséquent, le gel devra être teinté poste après électrophorèse. En raison du coût, la facilité d'utilisation, et la sensibilité, EtBr reste le colorant de choix pour de nombreux chercheurs. Toutefois, dans certaines situations, comme lorsque l'élimination des déchets dangereux est difficile ou lorsque les élèves sont jeunes menant une expérience, un colorant moins toxique peut être préféré.

    Colorants de chargement utilisées en électrophorèse sur gel répondent à trois objectifs principaux. D'abord, ils ajoutent la densité de l'échantillon, Ce qui lui permet de s'enfoncer dans le gel. Deuxièmement, les colorants donner de la couleur et de simplifier le processus de chargement. Enfin, les colorants se déplacer à taux standard à travers le gel, ce qui permet pour l'estimation de la distance que des fragments d'ADN ont migré.

    Les dimensions exactes de fragments d'ADN séparés peuvent être déterminée en traçant le logarithme de la masse moléculaire pour les différentes bandes d'une norme d'ADN contre la distance parcourue par chaque bande. La norme d'ADN contient un mélange de fragments d'ADN de tailles prédéterminées qui peuvent être comparées aux échantillons d'ADN inconnus. Il est important de noter que les différentes formes de l'ADN se déplacer à travers le gel à des taux différents. ADN plasmidique surenroulé, en raison de sa conformation compacte, se déplace à travers la plus rapide de gel, suivie par un fragment d'ADN linéaire de la même taille, la forme circulaire ouverte déplacement le plus lent.

    En conclusion, depuis l'adoption de gels d'agarose dans les années 1970 pour la séparation de l'ADN, il aavéré être l'une des techniques les plus utiles et polyvalent dans la recherche en sciences biologiques.

    Disclosures

    Nous n'avons rien à communiquer.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose I Amresco 0710
    Boric acid Sigma-Aldrich B7901
    Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637 Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste
    Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401-212 Corrosive
    Glycerol Fisher Scientific G33-1
    Xylene cyanol FF Sigma-Aldrich X4126
    Tris base Sigma-Aldrich T1503
    Investigator/FX gel documentation system Fotodyne Incorporated
    Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system Thermo Fisher Scientific, Inc. B1-PTM
    EPS 301 power supply GE Healthcare 18-1130-01

    References

    1. Sambrook, J. & Russell, D.W. Molecular Cloning, 3rd edition (2001).
    2. Kirkpatrick, F.H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications 9-22 (1991).
    3. Helling, R.B., Goodman, H.M., & Boyer, H.W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
    4. Smith, S.B., Aldridge, P.K., & Callis, J.B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
    5. Aaji, C. & Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
    6. Lai, E. Birren, B.W. Clark, S.M., Simon, M.I., & Hood L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
    7. Devor, E.J. IDT tutorial: gel electrophoresis http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf
    8. Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
    9. Dea, I.C.M., McKinnon, A.A., & Rees, D.A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
    10. Sharp, P.A., Sugden, B., & Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).

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