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 JoVE Clinical and Translational Medicine

पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

, , , , , ,

The Feinstein Institute for Medical Research, North Shore – LIJ Health System

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Cite this Article: पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

Li, W., Zhu, S., Zhang, Y., Li, J., Sama, A. E., Wang, P., et al. Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies. J. Vis. Exp. (62), e3926, doi:10.3791/3926 (2012).

Abstract: पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

पूति एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया सिंड्रोम एक सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण से उत्पन्न करने के लिए संदर्भित करता है. यह नियमित रूप से पशुओं में नकली बहिर्जात जीवाणु (endotoxemia) के विष या बैक्टीरिया (जीवाणुरक्तता) के अर्क के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cecal बंधाव और 1-3 (सीएलपी) पंचर द्वारा अंधान्त्र की शल्य वेध सहित कई तकनीकों द्वारा किया गया है. CLP spillage के बैक्टीरिया और peritoneal गुहा के fecal संदूषण की अनुमति देता है, छिद्रित पथरी या diverticulitis के मानव नैदानिक ​​रोग की नकल उतार. पूति की गंभीरता के रूप में अंतिम मृत्यु दर से परिलक्षित, cecal 2 पंचर के लिए इस्तेमाल किया सुई के आकार अलग से शल्य चिकित्सा द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. पशुओं में, चिली, हृदय, चयापचय, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के समान, Biphasic hemodynamic लाती है के रूप में मानव 3 पूति के नैदानिक ​​पाठ्यक्रम के दौरान मनाया. इस प्रकार, चिली मॉडल एक प्रयोगात्मक पूति के लिए सबसे नैदानिक ​​प्रासंगिक मॉडल 1-3 के रूप में माना जाता है./ P>

विभिन्न पशु मॉडल जटिल प्रयोगात्मक पूति के रोगजनन अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट किया गया है. पूति के घातक परिणाम जल्दी साइटोकिन्स के एक अत्यधिक संचय 4-6 और देर proinflammatory (उदाहरण के लिए, HMGB1) के मध्यस्थों 7 (जैसे TNF, IL-1 और IFN-γ) के रूप में आंशिक रूप से कारण है. जल्दी proinflammatory साइटोकिन्स के साथ तुलना में, देर से अभिनय मध्यस्थों नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए एक व्यापक चिकित्सकीय खिड़की है. उदाहरण के लिए, HMGB1-CLP के बाद 24 घंटे के शुरुआत एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने की देरी प्रशासन अभी भी 8,9 मारक चूहों से बचाया, घातक पूति की देर मध्यस्थ के रूप में HMGB1 की स्थापना. HMGB1 देर से अभिनय एक मध्यस्थ के रूप में की खोज पूति पारंपरिक चीनी हर्बल चिकित्सा के उपचारों के विकास के लिए जांच का एक नया क्षेत्र शुरू कर दी है. इस पत्र में, हम CLP प्रेरित पूति के एक प्रक्रिया का वर्णन, और एचएम के लिए हर्बल दवा स्क्रीनिंग में इसके उपयोगउपचारों GB1 लक्ष्यीकरण.

Protocol: पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

1. पूति के पशु मॉडल की स्थापना

  1. चूहे (75 मिलीग्राम / किग्रा, इंट्रामस्क्युलर, आईएम) ketamine और xylazine के (10 मिलीग्राम / किग्रा, आईएम) के साथ anesthetized हैं, और ढालुआं स्थिति में रखा.
  2. टेप के साथ माउस का पैर ठीक करने के लिए एक स्थिर स्थिति सुनिश्चित करने के लिए.
  3. पेट साफ betadine या अन्य त्वचा निस्संक्रामक और शराब के 3 बारी scrubs के साथ. फिर, एक 15 मिमी के midline चीरा अंधान्त्र बेनकाब करने के लिए कर सकते हैं.
  4. Cecal टिप से लगभग 5.0 मिमी पर एक 4-0 रेशम सीवन साथ अंधान्त्र कटी घमनी को बांधना, और फिर पंचर ligated cecal स्टंप एक बार एक 22 गेज सुई के साथ मल बाहर निकालना की अनुमति.
  5. अंधान्त्र तुरंत अपनी सामान्य स्थिति में अंतर पेट के लिए वापस जगह है.
  6. पहले absorbable sutures के साथ पेट की मांसलता को बंद करने, और फिर घाव क्लिप या nonabsorbable sutures के साथ त्वचा बंद कर दो परतों में चीरा साइट को बंद करें.
  7. 0.5 मिलीलीटर सामान्य नमकीन घोल के साथ माउस को पुनर्जीवित और एक एकल हैimipenem की शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के पूरा होने के तुरंत बाद से (0.5 मिलीग्राम / माउस, subcutaneously).
  8. माउस भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ एक साफ पिंजरे वापस लौटें.
  9. विभिन्न समय अंक के बाद CLP पर, हर्बल निकालने या घटक intraperitoneally प्रशासित किया जाता है.
  10. पशु अस्तित्व के अधिक से अधिक दो सप्ताह के लिए नजर रखी है. मरणासन्न खड़े कठिनाइयों, अंतकाल श्वास, गंभीर पेशी शोष और अनियंत्रित रक्तस्राव का प्रदर्शन पशुओं के लिए अधिक मात्रा कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा euthanized किया जाना चाहिए.
  11. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि cytokine स्तर परिसंचारी इन अध्ययनों में महत्वपूर्ण मानकों हैं. विभिन्न दर्दनाशक दवाओं cytokine रिलीज और गतिविधियों को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, और इसलिए जानबूझकर किया गया है पश्चात की देखभाल में बचा है.

2. हर्बल निकालें तैयार

  1. घंटा 1-4 (पत्तियों के लिए 1 घंटे, और जड़ों के लिए 4 घंटा) के लिए गर्म पानी (85 डिग्री सेल्सियस) में जड़ी बूटी निकाल सकते हैं.
  2. पानी इतना अपकेंद्रित्रluble अंश (छ +३,३००, 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) अघुलनशील कणों को दूर करने के लिए.
  3. छानना 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला अंश.
  4. साफ पानी में घुलनशील छानना अंश तो YM 10 केन्द्रापसारक फ़िल्टर (कैटलॉग नहीं. 4305, Millipore) के Centriprep का उपयोग ultrafiltration द्वारा fractionated है.
  5. परिणामस्वरूप कम (<10 केडीए) और उच्च (> 10 केडीए) आणविक वजन भिन्न (MWF) HMGB1 बाधा बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों का उपयोग गतिविधियों के लिए जांच कर रहे हैं.
  6. HMGB1 बाधा हर्बल या निकालने के 24 घंटे के बाद CLP घटकों के intraperitoneal प्रशासन उनके चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए.

3. Peritoneal बृहतभक्षककोशिका अलगाव

  1. Thioglycollate शोरबा (4%, 2.0 मिलीग्राम) सामान्य चूहों में intraperitoneally प्रशासित किया जाता है.
  2. प्राथमिक peritoneal मैक्रोफेज 3 दिन के रूप में पहले 10 में वर्णित में harvested रहे हैं.
  3. मैक्रोफेज DMEM (Gibco ब्राज़ीलियाई ग्रांड द्वीप, NY) में मध्यम 1 के साथ पूरक में पूर्व सुसंस्कृत हैं0% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, glutamine 2 mmol / एल, और 1% पेनिसिलिन.
  4. पक्षपाती मैक्रोफेज के साथ धीरे धोया जाता है, और में सुसंस्कृत, सीरम मुक्त OPTI सदस्य बैक्टीरियल endotoxin के साथ उत्तेजना से पहले दो घंटे मैं मध्यम (lipopolysaccharide, LPS, 0111 ई. कोलाई: B4, सिग्मा Aldrich).
  5. LPS उत्तेजना के बाद 16 घंटे से कम, मध्यम संस्कृति में HMGB1 का स्तर पश्चिमी सोख्ता 11 विश्लेषण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं.
  6. सापेक्ष बैंड तीव्रता एनआईएच छवि 1.59 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मानक घटता HMGB1 शुद्ध के साथ उत्पन्न करने के लिए संदर्भ के साथ HMGB1 का स्तर निर्धारित मात्रा निर्धारित किया गया था.

4. प्रतिनिधि परिणाम

1. CLP प्रणालीगत और स्थानीय सूजन लाती है.

CLP सर्जरी के कुछ ही घंटों के भीतर, जानवरों पूति कि piloerection, सुस्ती, huddling, और भोजन और पानी की मात्रा में कमी के नैदानिक ​​लक्षण दिखा रहे हैं. लगातार प्रणालीगत के साथ एक गंभीर पेरिटोनिटिस विकासशील पशु96 घंटा संक्रमण आम तौर पर 48 के भीतर मर जाते हैं. हालांकि, भी पृष्ठभूमि से मिलान उम्र, लिंग, और आनुवंशिक जानवरों प्रयोगात्मक पूति के पाठ्यक्रम में एक पृथक करने योग्य तरीके में सर्जरी CLP जवाब कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, 48 घंटे के बाद CLP पर, जबकि कुछ जानवरों को मरणासन्न राज्य (के रूप में चित्र 1 में परिभाषित) से संपर्क हो सकता है, दूसरों को एक गैर मरणासन्न राज्य में रह सकती है.

परिसंचारी साइटोकिन्स का व्यापक सर्वेक्षण मरणासन्न और गैर मरणासन्न (चित्रा 1) राज्यों में 12 में चूहों के बीच कई साइटोकिन्स के स्तर में नाटकीय मतभेद (जैसे, आईएल -6, के.सी., एमआईपी 2, और sTNFR1) का पता चला. विशेष रूप से, इन सूजन मध्यस्थों पूति के किराए मार्कर के रूप में वर्गीकृत किया गया है क्योंकि उनके परिसंचारी स्तर में 12-14 प्रयोगात्मक या नैदानिक ​​पूति 15 घातक परिणाम के विश्वसनीय predictors हैं. इसके अलावा, चिली भी विभिन्न समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines के स्थानीय रिहाई प्रेरित. उदाहरण के लिए, पर48 घंटा के बाद CLP, साइटोकिन्स के महत्वपूर्ण मात्रा में (उदाहरण के लिए, आईएल -6) और chemokines (के.सी. और एमआईपी -2) अभी भी खून में न केवल प्रणालीबद्ध कर सकते हैं मापा जा, लेकिन यह भी peritoneal तरल पदार्थ पानी से धोना (चित्रा 2) में स्थानीय रूप से.

2. HMGB1 बाधा हर्बल निकालने या घटकों के लिए स्क्रीनिंग.

बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों का प्रयोग, हम विभिन्न हर्बल निकालने या घटकों की क्षमता बाधा अन्तर्जीवविष प्रेरित HMGB1 रिलीज में (चित्रा 3) का मूल्यांकन करने में सक्षम थे. बाधा HMGB1 रिलीज में अपनी क्षमता के प्रकाश में, हम आगे पशु मॉडल पूति में अपने प्रभाव का पता लगाया. एक समय बिंदु जब चूहों सुस्ती, दस्त, और piloerection सहित पूति के स्पष्ट लक्षण विकसित प्रयोगात्मक 8 पूति में HMGB1 संचय की देर और लंबे समय तक कैनेटीक्स को देखते हुए, HMGB1 inhibitors की पहली खुराक पूति की शुरुआत के बाद 24 घंटे दिया गया था. के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, देरी और एक प्रमुख हरी चाय ग दोहराया प्रशासनepigallocatechin-3 gallate (EGCG), omponent, पूति की शुरुआत के बाद 24 घंटे में शुरुआत है, काफी घातक पूति से 12 चूहों को बचाया. यहां तक कि जब मौखिक रूप से दिया है, अभी भी घातक पूति से बचाया चूहों EGCG, काफी 16% 44 16% से पशुओं के जीवित रहने की दरों में वृद्धि. यह महत्वपूर्ण होना तय है कि कई हर्बल घटकों के साथ संयोजन के उपचारों पूति के पशु मॉडल में एक महत्वपूर्ण बेहतर संरक्षण हासिल सकता है. एक साथ ले ली गई, इन प्रयोगात्मक डेटा स्क्रीन उपन्यास चिकित्सात्मक एजेंट CLP प्रेरित पूति का एक पशु मॉडल का उपयोग कर के लिए हमारे दृष्टिकोण की पुष्टि की.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
आकृति 1. किराए मार्करों के परिसंचारी स्तर सेप्टिक मरणासन्न राज्य आ पशुओं में नाटकीय रूप से उच्च Balb / सी चूहों CLP द्वारा पूति के अधीन है और बीमारी के लक्षण के विकास के लिए नजर रखी. एक मेंपूति की देर मंच (52 घंटे के बाद CLP), 3 सामान्य (सीएलपी) चूहों, 3 सेप्टिक मरणासन्न राज्य आ चूहों, और गैर मरणासन्न राज्य में 3 सेप्टिक चूहों से रक्त एकत्र किया गया था. सीरम प्रत्येक समूह से जमा किया गया था, और एंटीबॉडी द्वारा साइटोकाइन प्रोफ़ाइल के लिए assayed है. विभिन्न समूहों के बीच कई सरोगेट मार्करों के सापेक्ष स्तर में नाटकीय अंतर नोट करें. प्रकाशक से दी गई अनुमति के साथ 10.1371/journal.pone.0001153.g006: doi से अनुकूलित.

चित्रा 2
चित्रा 2. स्थानीय और प्रणालीगत 48 घंटे के बाद CLP / Balb सी चूहों पर साइटोकिन्स और chemokines की जांच पूति के लिए CLP द्वारा किए गए, और रक्त या peritoneal तरल पदार्थ के 48 घंटे के बाद CLP पर काटा गया. जमा सीरम या peritoneal पानी से धोना द्रव में कई साइटोकिन्स और chemokines के सापेक्ष स्तर साइटोकाइन एंटीबॉडी द्वारा मापा गया है, और मनमाना इकाइयों (एयू) के रूप में व्यक्त की है. नियंत्रण रक्त, और peritoneal तरल पदार्थ एक के रूप मेंmples laparotomy के बिना सामान्य स्वस्थ जानवरों (सीएलपी) से प्राप्त किया गया.

चित्रा 3
चित्रा 3. हर्बल घटक खुराक-dependently प्राथमिक बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों में अन्तर्जीवविष प्रेरित HMGB1 रिहाई हिचकते प्राथमिक murine peritoneal मैक्रोफेज अभाव में LPS, या हर्बल घटक की उपस्थिति (जैसे, EGCG, 15 माइक्रोन) के साथ प्रेरित किया गया. LPS उत्तेजना के बाद 16 घंटे से कम, मध्यम संस्कृति में HMGB1 का स्तर पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है. प्रकाशक से दी गई अनुमति के साथ 10.1371/journal.pone.0001153.g006: doi से अनुकूलित.

चित्रा 4
चित्रा 4. हर्बल घटक घातक पूति से चूहों बचाया चूहों / Balb सी. CLP द्वारा घातक पूति के अधीन, और हर्बल घटक (EGCG) intraperitoneally 24 पर प्रशासित था, 48, 72 घंटे पूति की शुरुआत के बाद. एकimal अस्तित्व दो सप्ताह तक के लिए नजर रखी थी. Kaplan-Meier विधि समूहों के बीच मृत्यु दर में अंतर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. *, पी <0.05 खारा बनाम. प्रकाशक से दी गई अनुमति के साथ 10.1371/journal.pone.0001153.g006: doi से अनुकूलित.

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Discussion: पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

प्रयोगशाला में, पूति के कई पशु मॉडल पूति के रोगजनन को समझने के क्रम में संभावित उपन्यास के उपचारों के विकास के लिए नियोजित किया गया है. उनके नैदानिक ​​प्रासंगिकता जानवरों के अध्ययन की पूति के लिए नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में सफल अनुवाद से पहले बहस का विषय बनी हुई है. हालांकि जल्दी साइटोकिन्स (जैसे, TNF) के खिलाफ एंटीबॉडी neutralizing bacteremia / 17,18 endotoxemia के पशु मॉडल में रक्षात्मक थे, वे वास्तव में 19 पूति के पशु मॉडल में अस्तित्व खराब हो. इसी तरह, सबसे विरोधी TNF एजेंट 20-22 पूति के नैदानिक ​​परीक्षणों में प्रभावकारिता दिखाने के लिए असफल. 23,24 पूति के अंतर्निहित रोगजनक तंत्र की जटिलता पर आंशिक रूप से इस विफलता को दर्शाता है. इसके अलावा, यह भी के चयन में नुकसान के कारण हो सकता है: 1) संभव चिकित्सात्मक लक्ष्य या दवाओं, 2) दवाओं के इष्टतम खुराक और समय, और 3) गैर यथार्थवादी नैदानिक ​​परिणाम (जैसे मृत्यु दर के रूप में) उपायों 25. HMGB1 लक्ष्य हर्बल निकालने और 26 Danggui, ग्रीन चाय, 12,16 और 27 Danshen सहित / घटकों, की हाल ही में खोज की preclinical जांच रोजगार पूति के पशु मॉडल का सफल उदाहरण प्रदान की गई है. इस क्षेत्र में आगे की जांच पड़ताल आणविक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विनियमन अंतर्निहित cascades पर अधिक प्रकाश डाला जाएगा और विभिन्न भड़काऊ रोगों के लिए चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए सुराग प्रदान करते हैं. अपनी प्रयोगशाला में पहली CLP स्थापना, प्रयास के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के रूप में जल्दी और बिल्कुल के रूप में संभव reproducibility के सुनिश्चित करने के लिए, विशेष रूप से बनाया जाना चाहिए जब चूहों की एक बड़ी संख्या (30-40) का उपयोग करने के कई प्रयोगात्मक समूहों के बीच जीवित रहने की दरों की तुलना एक प्रयोग. लंबे समय से अभिनय anesthetics (जैसे कि ketamine और xylazine के रूप में) का उपयोग हमें चूहों की एक बड़ी संख्या पर एक अपेक्षाकृत कम समय फ्रेम में CLP शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए अनुमति देता है, और इस बीच मददसंभावित खुराक विचरण हटा बार हुआ है जब अस्थिर anesthetics के का उपयोग कर. जीवित रहने की दरों और प्रणालीगत cytokine संचय के CLP प्रक्रिया के सफल प्रदर्शन के संकेत के रूप में लिया जा सकता है.

CLP मॉडल व्यापक रूप से किया गया है कम लागत, शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की सादगी और व्यापक रोग, प्रतिरक्षा, शारीरिक अभिलक्षण में स्पष्ट लाभ की वजह से कृन्तकों में इस्तेमाल किया. हालांकि, वहाँ माउस CLP मॉडल 1-3 की सीमाओं के एक नंबर रहे हैं. उदाहरण के लिए, सभी पशु मॉडल की तरह, एक प्रजाति असमानता तथ्य यह है कि पंचर बिना cecal बंधाव मानव लेकिन नहीं चूहों में घातक हो सकता है द्वारा प्रकाश डाला है. इसके अलावा, माउस और CLP करने के लिए बाद में निर्जलीकरण के छोटे आकार की वजह से, यह अक्सर मुश्किल होता है साइटोकाइन माप के लिए धारावाहिक रक्त के नमूने प्राप्त है. ये नुकसान आंशिक रूप से 2,3,27,28 पशुओं में बड़े CLP मॉडल की स्थापना के द्वारा दूर किया जा सकता है. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है के लिए बाहर है कि मृत्यु दर को इंगित करें औरकृन्तकों में पेरिटोनिटिस की प्रगति काफी हद तक मल बाहर निकालना की राशि जो पंचर अंधान्त्र, punctures की संख्या के लिए इस्तेमाल किया सुई की गेज से प्रभावित कर रहे हैं द्वारा निर्धारित कर रहे हैं, ligated cecum और 2 मल के दलदलापन की कुल मात्रा, 3. इसके अलावा, खुराक और CLP का प्रारंभिक चरण में एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन की आवृत्ति भी मृत्यु दर को प्रभावित कर सकते हैं. अंत में, पशु स्रोतों और आवास पर्यावरण भी मृत्यु दर के विचरण के लिए योगदान कर सकते हैं.

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Disclosures: पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

एईएस और HW HMGB1 inhibitors (tanshinones) पूति के लिए संभावित चिकित्सात्मक एजेंट के रूप में करने के लिए संबंधित पेटेंट आवेदनों की सह आविष्कारक हैं.

Acknowledgements: पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, जनरल मेडिकल साइंस (R01GM063075) के राष्ट्रीय संस्थान और पूरक और वैकल्पिक चिकित्सा के राष्ट्रीय केंद्र (R01AT05076) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials: पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

Name Company Catalog Number Comments
Betadine Purdue Products L.P. 25655-41-8
imipenem Merck & Co., Inc. 9882821
Ketamine HCl Hospira Inc. RL-0065
Xylazine Lloyd, Inc. 4821
Autoclip BD Biosciences 427631
4-0 silk suture Roboz Surgical Instruments Co. SUT-15-2
Surflo I.V. Catheter Terumo Medical Corp. SR*OX2419CA
RayBio mouse cytokine antibody array RayBiotech, Inc. AAM-CYT-3
Thioglycollate BD Biosciences 211716

References: पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

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