Bruk av Animal Model of Sepsis å evaluere Novel urteterapi

1. Etablering av Animal Model of Sepsis

1. Mus er bedøvet med ketamin (75 mg / kg, intramuskulært, im) og xylazin (10 mg / kg, im), og plasseres i ryggleie.
2. Fest føttene på musen med tape for å sikre en stabil posisjon.
3. Rengjør magen med 3 vekslende scrubs av Betadine eller annen hud desinfeksjonsmiddel og alkohol. Deretter lage en 15 mm midtlinjen innsnitt for å avsløre cecum.
4. Ligate cecum med en 4-0 silke sutur ved ca 5,0 mm fra cecal spissen, og deretter punktere ligated cecal stubben gang med en 22-gauge kanyle for å tillate ekstrudering av avføring.
5. Cecum umiddelbart erstattet tilbake til sin normale intra-abdominale stilling.
6. Lukk snitt nettstedet i to lag, ved først å lukke muskulaturen i magen med absorberbare suturer, og deretter lukker huden med sår klipp eller absorberbare suturer.
7. Gjenopplive mus med 0,5 ml fysiologisk saltvann og en enkelt gjørese av imipenem (0,5 mg / mus, subkutant) umiddelbart etter ferdigstillelse av det kirurgiske inngrepet.
8. Tilbake musen tilbake til et rent bur med fri tilgang til mat og vann.
9. Ved ulike tidspunkter etter CLP, er urte-ekstrakt eller komponent administrert intraperitonealt.
10. Animal overlevelse overvåkes for mer enn to uker. Døende dyr stiller vanskeligheter å stå, agonal puste, alvorlig muskelatrofi og ukontrollert blødning bør avlives av overdose karbondioksid innånding.
11. Det er viktig å merke seg at sirkulerende cytokin nivåer er viktige parametre i disse studiene. Ulike smertestillende har vist seg å påvirke cytokin frigjøring og aktiviteter, og derfor har blitt bevisst unngått i postoperativ omsorg.

2. Utarbeidelse av urte-ekstrakt

1. Pakk urter i varmt vann (85 ° C) for 1-4 timers (1 time for blader, og 4 timer for røtter).
2. Sentrifuger vannet-såluble fraksjon (3300 g, 20 min, 4 ° C) for å fjerne uoppløselige partikler.
3. Filtratet supernatanten brøkdel gjennom et 0,2 mikrometer filter.
4. Den klare vannløselig filtratet fraksjon er så fraksjonert ved ultrafiltrasjon hjelp Centriprep YM-10 sentrifugalfilter (Katalognr. 4305, Millipore).
5. Det resulterte lave (<10 kDa) og høy (> 10 kDa) molekylvekt fraksjoner (MWF) er undersøkt for HMGB1-hemmende aktiviteter ved hjelp macrophage kulturer.
6. Intraperitoneal administrasjon av HMGB1-hemmende urte-ekstrakt eller komponenter på 24 timers innlegg CLP å evaluere deres terapeutiske effekt.

3. Peritoneal macrophage Isolasjon

1. Thioglycollate kjøttkraft (4%, 2,0 ml) administreres intraperitonealt i normale mus.
2. Primær peritoneal makrofager blir høstet på 3 dager som tidligere beskrevet ^10.
3. Makrofager er pre-kulturperler i DMEM medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) supplert med en0% fosterets storfe serum (FBS), 2 mmol / L glutamin, og 1% penicillin.
4. Tilhenger makrofager blir varsomt vasket med, og kultivert i, serum-free OPTI-MEM jeg medium to timer før stimulering med bakteriell endotoksiner (lipopolysakkarid, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
5. På 16 timer etter LPS stimulering, er nivåene av HMGB1 i kulturen medium bestemmes av Western blotting-analyse ^11.
6. Den relative Bandet Intensiteten ble kvantifisert ved hjelp av NIH bildet 1,59 programvare for å fastslå HMGB1 nivåer med referanse til standard kurver generert med renset HMGB1.

4. Representative Resultater

1. CLP induserer systemisk og lokal inflammasjon.

Innen et par timer med CLP kirurgi, dyr viser kliniske tegn på sepsis som inkluderer piloerection, sløvhet, huddling, og nedgang i mat og vann inntak. Dyr utvikle en alvorlig bukhinnebetennelse med påfølgende systemiskinfeksjon vanligvis dø innen 48-96 timer. Imidlertid kan selv alder, kjønn-og genetisk background-matchede dyr svare til CLP kirurgi i en identifiserbar måte i løpet av eksperimentelle sepsis. For eksempel, på 48 hr innlegg CLP, mens noen dyr kan ha nærmet døende tilstand (som definert i figur 1), mens andre kan ligge på et ikke-døende tilstand.

Omfattende undersøkelser av sirkulerende cytokiner avdekket dramatiske forskjeller i nivåer av flere cytokiner (f.eks IL-6, KC, MIP-2, og sTNFR1) mellom mus i døende og ikke-døende stater (Figur 1) ^12. Spesielt har disse inflammatoriske mediatorer blitt klassifisert som surrogatmarkører av sepsis fordi deres sirkulerende nivåer er pålitelige prediktorer for dødelig utfall i eksperimentell ^12-14 eller klinisk sepsis ^15. I tillegg CLP også indusert lokale utslipp av ulike pro-og anti-inflammatoriske cytokiner og chemokines. For eksempel ved48 hr innlegg CLP, betydelige mengder cytokiner (f.eks IL-6) og chemokines (KC og MIP-2) kan fortsatt måles ikke bare systemisk i blodet, men også lokalt i peritoneal lavage fluid (figur 2).

2. Screening for HMGB1-hemmende urte-ekstrakt eller komponenter.

Ved hjelp macrophage kulturer, kunne vi vurdere kapasiteten til ulike urte ekstrakt eller komponenter i hemme endotoksin-indusert HMGB1 utgivelse (figur 3). I lys av sin kapasitet i hemme HMGB1 utgivelse, vi ytterligere utforsket deres effekt i dyremodeller sepsis. Gitt sene og langvarig kinetikk HMGB1 opphopning i eksperimentell sepsis ^8, ble den første dosen av HMGB1 hemmere gitt 24 time etter utbruddet av sepsis - en tid punkt når mus utviklet klare tegn på sepsis inkludert sløvhet, diaré, og piloerection. Som vist i figur 4, forsinket og gjentatt administrasjon av en stor grønn te component, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), som begynner etter 24 timer etter utbruddet av sepsis, betydelig reddet mus fra dødelig sepsis ^12. Selv når det gis oralt, EGCG likevel reddet mus fra dødelig sepsis, betydelig økt dyr overlevelse fra 16% til 44% ^16. Det ville være viktig å avgjøre om kombinatoriske behandlingsformer med flere urte komponenter kan oppnå en betydelig bedre beskyttelse i dyremodeller av sepsis. Samlet utgjør disse eksperimentelle data validert vår tilnærming til skjermen nye terapeutiske midler ved å bruke en dyr modell av CLP-indusert sepsis.

5. Representative Resultater

Figur 1. Sirkulerende nivåer av surrogatmarkører er dramatisk høyere i septisk dyr nærmer døende tilstand. BALB / C mus ble utsatt for sepsis med CLP og overvåkes for utvikling av tegn på sykdom. På etsent stadium av sepsis (52 hr innlegget CLP), ble blod samlet fra 3 normale mus (-CLP), 3 septik mus nærmer seg døende staten, og 3 septik mus i den ikke-døende tilstand. Serum ble samlet fra hver gruppe, og analysert for cytokin profil ved antistoff arrays. Merk den dramatiske forskjellen i den relative nivåer av flere surrogatmarkører mellom ulike grupper. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tillatelse fra forlaget.

Figur 2. Påvisning av lokale og systemiske cytokiner og chemokines på 48 hr post CLP. BALB / C mus ble utsatt for sepsis med CLP og blod eller peritoneal væske ble høstet i 48 timer etter CLP. Relative nivåer av flere cytokiner og chemokines i sammenslåtte serum eller peritoneal lavage væske ble målt ved cytokin antistoff matriser, og uttrykt som vilkårlige enheter (AU). Som kontroller, blod og peritonealvæske SAmples ble innhentet fra friske dyr (-CLP) uten laparotomi.

Figur 3. Herbal komponent doseavhengig hemmet endotoksin-indusert HMGB1 utgivelse i primære macrophage kulturer. Primary murine peritoneale makrofager ble stimulert med LPS i fravær eller nærvær av urte komponent (f.eks EGCG, 15 mm). På 16 timer etter LPS stimulering, var nivået på HMGB1 i kulturen medium bestemmes av Western blotting-analyse. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tillatelse fra forlaget.

Figur 4. Herbal komponent reddet mus fra dødelig sepsis. BALB / C mus ble utsatt for dødelig sepsis med CLP, og urte komponent (EGCG) var intraperitonealt administreres ved 24, +48, +72 timer etter utbruddet av sepsis. Enimal overlevelse ble overvåket i opptil to uker. Kaplan-Meier metoden ble brukt for å sammenligne forskjeller i dødelighet mellom grupper. *, P <0,05 versus saltvann. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tillatelse fra forlaget.

I laboratoriet har flere dyremodeller av sepsis blitt ansatt for å forstå patogenesen av sepsis for å utvikle potensielle nye behandlingsformer. Deres kliniske relevansen er fortsatt gjenstand for debatt før den vellykkede oversettelse av dyrestudier til kliniske applikasjoner for sepsis. Selv nøytraliserende antistoffer mot tidlig cytokiner (f.eks TNF) var beskyttende i dyremodeller av bakteriemi / endotoxemia ^17,18, de faktisk forverre overlevelse i dyremodell av sepsis ^19. Tilsvarende mislyktes de fleste anti-TNF midler til å vise effekt i kliniske studier av sepsis ^20-22. Denne feilen skyldes dels av kompleksiteten av de underliggende sykdomsfremkallende mekanismer av sepsis ^23,24. I tillegg kan det også skyldes fallgruver i valg av: 1) gjennomførbare terapeutiske mål eller narkotika, 2) optimale doser og tidspunkt for narkotika, og 3) ikke-realistiske kliniske utfallsmål (for eksempel dødelighet) ^25. Den nylige oppdagelsen av HMGB1 målretting urte-ekstrakt og / komponenter, inkludert ²⁶ Danggui, grønn te ^12,16, og Danshen ²⁷ har gitt vellykkede eksempler på prekliniske etterforskning sysselsetter dyremodeller av sepsis. Videre undersøkelser i dette området vil kaste mer lys over de molekylære kaskader underliggende regulering av det medfødte immunforsvaret, og gi ledetråder for utvikling av legemiddelselskap for ulike inflammatoriske sykdommer. Når første etablering CLP i laboratoriet ditt, bør innsats gjøres for å utføre kirurgi prosedyren så raskt og nøyaktig som mulig for å sikre reproduserbarhet, spesielt når du bruker et stort antall (30-40) av mus for å sammenligne overlevelse mellom flere eksperimentelle grupper av et eksperiment. Bruk av langtidsvirkende bedøvelse (slik som ketamin og xylazin) tillater oss å fullføre CLP kirurgiske inngrep på et stort antall mus i en relativt kort tidsramme, og i mellomtiden bidra til åfjerne potensiell dose variansen ofte skjedde ved bruk av flyktige anestetika. Overlevelse og systemisk cytokin akkumulering kan tas som tegn på vellykkede utførelse av CLP prosedyre.

CLP-modellen har vært mye brukt i gnagere grunn av åpenbare fordeler i lav pris, enkelhet for kirurgisk inngrep, og omfattende patologiske, immunologiske, fysiologiske karakteristikk. Det finnes imidlertid en rekke begrensninger i mus CLP-modellen ^1-3. For eksempel, som alle dyremodeller, er en art misforhold markert ved at cecal ligation uten punktering kan være dødelig i menneskelige, men ikke hos mus. Dessuten, på grunn av liten størrelse på mus og dehydrering etterkant CLP, er det ofte vanskelig å få tak serielle blodprøver for cytokin måling. Disse ulempene kan delvis overvinnes ved å etablere CLP modeller i større dyr ^2,3,27,28. I tillegg er det viktig å påpeke at dødelighet ogfremdriften av peritonitt i gnagere er i stor grad bestemmes av mengden avføring ekstrudering, som er påvirket av måleren av nålen som brukes til å punktere cecum, antall punkteringer, det totale volumet av ligated cecum og viskositeten på avføring ^{2, 3.} I tillegg kan dosen og hyppigheten av administrasjon av antibiotika på et tidlig stadium av CLP også påvirke dødeligheten. Endelig kan animalske kilder og bomiljø også bidra til variansen dødelighet.