El uso de modelos animales de sepsis para evaluar nuevas terapias a base de plantas

1. Establecimiento de modelo animal de sepsis

1. Los ratones se anestesiaron con cetamina (75 mg / kg, por vía intramuscular, im) y xilazina (10 mg / kg, im), y se colocó en posición supina.
2. Fijar los pies del ratón con cinta adhesiva para asegurar una posición estable.
3. Limpie el abdomen con 3 matorrales alternas de betadine o desinfectante de la piel al otro y el alcohol. Luego, haga una incisión de 15 mm para exponer el ciego.
4. Ligar el ciego con una sutura de seda 4-0 aproximadamente 5,0 mm de la punta del ciego, y luego perforar el muñón del ciego ligado una vez con una aguja de calibre 22 para permitir la extrusión de las heces.
5. El ciego es inmediatamente sustituido de nuevo a su habitual posición de intra-abdominal.
6. Cerca del sitio de la incisión en dos capas, por primera cerrando la musculatura del abdomen con suturas absorbibles, y luego cerrar la piel con clips de heridas o suturas absorbibles.
7. Resucitar el ratón con 0,5 ml de solución salina normal y hacer una solaSE de imipenem (0,5 mg / ratón, por vía subcutánea) inmediatamente después de la finalización del procedimiento quirúrgico.
8. Vuelva a colocar el ratón de nuevo a una jaula limpia, con acceso libre a comida y agua.
9. En CLP puesto varios puntos de tiempo, extracto de hierbas o un componente se administra por vía intraperitoneal.
10. Supervivencia animal es supervisado por más de dos semanas. Los animales moribundos que presentan dificultades sean válidas, la respiración agónica, atrofia muscular severa y sangrado sin control deben ser sacrificados por inhalación de sobredosis de dióxido de carbono.
11. Es importante señalar que los niveles circulantes de citoquinas son parámetros importantes en estos estudios. Varios analgésicos se ha demostrado que afectan a la liberación de citoquinas y de las actividades, y por lo tanto, se han evitado intencionalmente en el postoperatorio.

2. Preparación del extracto de hierbas

1. Extracto de hierbas en agua caliente (85 ° C) durante 1-4 horas (1 hora para las hojas, y 4 horas para las raíces).
2. Centrifugar el agua tanfracción luble (3300 g, 20 min, 4 ° C) para eliminar las partículas insolubles.
3. El filtrado de la fracción sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras.
4. La clara fracción soluble en agua filtrado se fracciona por ultrafiltración utilizando Centriprep YM-10 Filtro centrífugo (catálogo n. 4305, Millipore).
5. El resultado fracciones de bajo peso molecular (menos de 10 kDa) y alta (> 10 kDa), peso (MWF) son examinados para detectar HMGB1 inhibidores de las actividades que utilizan cultivos de macrófagos.
6. La administración intraperitoneal de HMGB1 inhibidores de extracto de hierbas o componentes a las 24 horas después de la CLP para evaluar su eficacia terapéutica.

3. Aislamiento de macrófagos peritoneales

1. Tioglicolato caldo (4%, 2,0 ml) se administra por vía intraperitoneal a ratones normales.
2. Primaria macrófagos peritoneales se cosechan a los 3 días como se describió previamente ^10.
3. Los macrófagos son pre-cultivadas en medio DMEM (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), glutamina 2 mmol / l, y 1% de penicilina.
4. Macrófagos adherentes se lavó suavemente con, y se cultivaron en, libre de suero OPTI-MEM medio que dos horas antes de la estimulación con endotoxina bacteriana (lipopolisacárido, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
5. A las 16 horas después de la estimulación con LPS, los niveles de HMGB1 en el medio de cultivo se determinó por análisis de transferencia Western ^11.
6. La intensidad de la banda se cuantificó en relación con la imagen del NIH 1.59 del software para determinar los niveles de HMGB1 en referencia a las curvas de calibración generadas con HMGB1 purificada.

4. Los resultados representativos

1. CLP induce la inflamación sistémica y local.

A las pocas horas de la cirugía de CLP, los animales muestran signos clínicos de sepsis que incluyen piloerección, letargo, acurrucándose, y la disminución de la ingesta de alimentos y agua. Animales en vías de desarrollo una peritonitis severa con sistémica consecutivala infección normalmente mueren dentro de 48 a 96 h. Sin embargo, incluso con la edad, sexo, y de fondo genético emparejados animales pueden responder a CLP cirugía en una forma distinguible en el curso de la sepsis experimental. Por ejemplo, a las 48 horas después de la CLP, mientras que algunos animales pueden se han acercado al estado moribundo (tal como se define en la Figura 1), otros pueden permanecer en un estado no moribunda.

Estudios exhaustivos de las citocinas circulantes reveló diferencias espectaculares en los niveles de varias citocinas (por ejemplo, IL-6, KC, MIP-2, y sTNFR1) entre los ratones en los estados moribundos y no moribundo-(Figura 1) ^12. Cabe destacar que estos mediadores inflamatorios han sido clasificados como marcadores de sepsis debido a que sus niveles circulantes son indicadores fiables de los resultados experimentales letal en ^12-14 o sepsis clínica ^15. Además, el CLP también indujo la liberación local de diversas citoquinas pro-y anti-inflamatorias y quimiocinas. Por ejemplo, en48 horas después de la CLP, cantidades significativas de citoquinas (por ejemplo, IL-6) y quimiocinas (KC y MIP-2) todavía se puede medir no sólo sistémicamente en la sangre, sino también localmente en el líquido de lavado peritoneal (Figura 2).

2. La detección de inhibidores de la HMGB1 extracto de hierbas o componentes.

Utilizando cultivos de macrófagos, hemos sido capaces de evaluar las capacidades de extracto de hierbas o varios componentes de la inhibición de la liberación inducida por endotoxina HMGB1 (Figura 3). A la luz de su capacidad de inhibir la liberación de HMGB1, seguir estudiando su eficacia en animales modelos de sepsis. Teniendo en cuenta la cinética de retraso y la acumulación prolongada de HMGB1 en la sepsis experimental ^8, la primera dosis de inhibidores de la HMGB1 se le dio 24 horas después de la aparición de la sepsis - un punto de tiempo cuando los ratones desarrollaron signos claros de sepsis, incluyendo el letargo, diarrea y piloerección. Como se muestra en la Figura 4, el retraso y la administración repetida de una gran verde c témarco del componente, la epigalocatequina-3-galato (EGCG), comenzando a las 24 h después del inicio de la sepsis, rescatados de manera significativa a los ratones de sepsis letal ^12. Incluso cuando se administra por vía oral, EGCG ratones todavía rescatados de sepsis letal, aumentando significativamente las tasas de supervivencia de los animales de 16% a 44% ^16. Sería importante determinar si las terapias combinadas con varios componentes a base de hierbas puede lograr una protección significativamente mejor en los modelos animales de sepsis. En conjunto, estos datos experimentales validado nuestro enfoque de la pantalla de nuevos agentes terapéuticos utilizando un modelo animal de la CLP-inducida por la sepsis.

5. Los resultados representativos

Figura 1. Los niveles circulantes de marcadores indirectos son mucho más altos en los animales sépticos que se acercan estado moribundo. Ratones Balb / C fueron sometidas a sepsis por el CLP y el seguimiento para el desarrollo de signos de enfermedad. En unaetapa tardía de la sepsis (52 horas después de la CLP), se recogió sangre de los ratones normales (3-CLP), 3 ratones sépticos que se acercan al estado moribundo, y 3 ratones sépticos en el estado no moribunda. El suero se combinaron de cada grupo, y se analizaron para el perfil de citocinas por los arrays de anticuerpos. Tenga en cuenta la dramática diferencia en los niveles relativos de varios marcadores entre diferentes grupos. Adaptado de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 con el permiso otorgado a la editorial.

Figura 2. Detección de citocinas locales y sistémicas y quimiocinas a las 48 horas después de la CLP. Ratones Balb / C fueron sometidas a sepsis por el CLP, y el líquido peritoneal de sangre o se cosecharon a las 48 horas después de la CLP. Los niveles relativos de varias citocinas y quimiocinas en el líquido de lavado combinado de suero o peritoneal se midieron por los arrays de anticuerpos de citoquinas, y se expresan como unidades arbitrarias (UA). Como controles fluido, sangre y peritoneal SAmples se obtuvieron a partir de animales sanos (normales-CLP), sin laparotomía.

Figura 3. Componente de base de plantas dependiendo de la dosis inhibe inducida por endotoxina HMGB1 liberación en cultivos de macrófagos primarios. Los macrófagos peritoneales murinos primarios fueron estimuladas con LPS en la ausencia o la presencia de componentes a base de plantas (por ejemplo, EGCG, 15 M). A las 16 horas después de la estimulación con LPS, los niveles de HMGB1 en el medio de cultivo se determinaron por análisis de Western Blot. Adaptado de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 con el permiso otorgado a la editorial.

Figura 4. Componente a base de hierbas rescatado a los ratones de la sepsis letal. Ratones Balb / C fueron sometidas a sepsis letal por el CLP, y el componente a base de hierbas (EGCG) fue administrado por vía intraperitoneal a 24, +48, +72 horas después de la aparición de la sepsis. Unla supervivencia proximal fue monitoreada durante un máximo de dos semanas. El método de Kaplan-Meier se utilizó para comparar las diferencias en las tasas de mortalidad entre los grupos. *, P <0,05 en comparación con solución salina. Adaptado de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 con el permiso otorgado a la editorial.

En el laboratorio, varios modelos animales de sepsis se han empleado para entender la patogénesis de la sepsis con el fin de desarrollar terapias potenciales novedosas. Su relevancia clínica sigue siendo un tema de debate antes de la traducción exitosa de los estudios en animales a las aplicaciones clínicas de la sepsis. Aunque los anticuerpos neutralizantes contra citoquinas tempranas (por ejemplo, TNF) tenían un efecto protector en modelos animales de bacteriemia / endotoxemia ^17,18, en realidad empeora la supervivencia en un modelo animal de sepsis ^19. Del mismo modo, la mayoría de los agentes anti-TNF no mostraron eficacia en ensayos clínicos de la sepsis ^20-22. Este fracaso refleja en parte en la complejidad de los mecanismos patogénicos subyacentes de la sepsis ^23,24. Además, también puede ser atribuible a dificultades en la selección de: 1) posibles dianas terapéuticas o drogas; 2) dosis óptima y la sincronización de las drogas, y 3) no realistas medidas de resultados clínicos (por ejemplo, las tasas de mortalidad) ^25. El reciente descubrimiento de HMGB1 de metas de extracto de hierbas y / componentes, incluyendo Danggui ^{26, 12,16} El té verde y salvia miltiorrhiza ²⁷ ha proporcionado ejemplos exitosos de modelos preclínicos de investigación que utilizan animales de sepsis. La investigación adicional en esta área se arrojará más luz sobre las cascadas moleculares que subyacen a la regulación de la respuesta inmune innata, y dar pistas para el desarrollo de terapias para diversas enfermedades inflamatorias. La primera vez que el establecimiento de CLP en su laboratorio, el esfuerzo debe hacerse para llevar a cabo el procedimiento de la cirugía de forma más rápida y exactamente como sea posible para asegurar la reproducibilidad, especialmente cuando se utiliza un gran número (30-40) de los ratones para comparar las tasas de supervivencia entre los diferentes grupos experimentales de un experimento. El uso de anestésicos de acción prolongada (tales como ketamina y xilazina) nos permite completar el procedimiento quirúrgico CLP en un gran número de ratones en un marco de tiempo relativamente corto, y mientras tanto ayudan aeliminar la varianza dosis potencial a menudo ocurre cuando se utilizan anestésicos volátiles. Las tasas de supervivencia y la acumulación sistémica de citoquinas pueden ser tomados como señales de un desempeño exitoso del procedimiento de CLP.

Modelo de CLP ha sido ampliamente utilizado en los roedores, debido a las ventajas obvias en bajo costo, sencillez de operación, además de amplias caracterizaciones patológicas, inmunológicas, fisiológicas. Sin embargo, hay un número de limitaciones del modelo de ratón CLP ^1-3. Por ejemplo, al igual que todos los modelos animales, una disparidad de las especies se destaca por el hecho de que la ligadura cecal sin punción puede ser fatal en humanos, pero en los ratones no. Además, debido al pequeño tamaño de ratón y posterior deshidratación del CLP, a menudo es difícil obtener muestras seriadas de sangre para medición de citoquinas. Estas desventajas pueden superarse parcialmente mediante el establecimiento de modelos de CLP en animales más grandes ^2,3,27,28. Además, es importante señalar que las tasas de mortalidad yel progreso de la peritonitis en roedores son en gran medida determinada por la cantidad de extrusión heces, que se ven afectados por el calibre de la aguja utilizada para perforar el ciego, el número de perforaciones, el volumen total de ciego ligado y la viscosidad de la materia fecal ^{2, 3.} Además, la dosis y frecuencia de administración de antibióticos en la etapa temprana de CLP también puede afectar a las tasas de mortalidad. Finalmente, las fuentes animales y el medio ambiente vivienda también pueden contribuir a la varianza de las tasas de mortalidad.