Het gebruik van dierlijk model van Sepsis op nieuwe kruidentherapieën Evalueer

1. Oprichting van Animal Model van sepsis

1. Muizen zijn verdoofd met ketamine (75 mg / kg, intramusculaire, im) en xylazine (10 mg / kg, IM), en in liggende houding.
2. Bevestig de voeten van de muis met band naar een stabiele positie te garanderen.
3. Maak de buik met 3 afwisselende scrubs van betadine of andere huid ontsmettingsmiddel en alcohol. Maak dan een 15 mm middellijn incisie aan de blindedarm bloot te leggen.
4. Ligeren de blindedarm met een 4-0 zijden hechtdraad op ongeveer 5,0 mm van de cecal tip, en dan punctie de geligeerde cecal stomp een keer met een 22-gauge naald voor aan de extrusie van de ontlasting mogelijk te maken.
5. De blindedarm wordt onmiddellijk vervangen terug naar zijn normale intra-abdominale positie.
6. Sluit de incisie site in twee lagen, door eerst het sluiten van de spieren van de buik met resorbeerbare hechtingen, en dan het sluiten van de huid met wond clips of niet-resorbeerbaar hechtdraad.
7. Reanimeer muis met 0,5 ml fysiologische zoutoplossing en een tese van imipenem (0,5 mg / muis, subcutaan) onmiddellijk na de voltooiing van de chirurgische ingreep.
8. Terug te keren met de muis naar een schone kooi met gratis toegang tot voedsel en water.
9. Op verschillende tijdstippen na CLP, wordt kruidenextract of component intraperitoneaal toegediend.
10. Animal overleving wordt gecontroleerd op meer dan twee weken. Stervende dieren vertonen problemen om op te staan, agonale ademhaling, ernstige spieratrofie en ongecontroleerde bloeding moet worden gedood door een overdosis kooldioxide inademing.
11. Het is belangrijk op te merken dat circulerende cytokine zijn belangrijke parameters in deze studies. Diverse pijnstillers is aangetoond dat ze cytokine-afgifte en de activiteiten van invloed zijn, en zijn daarom met opzet vermeden in postoperatieve zorg.

2. Voorbereiding van Herbal Extract

1. Extract kruiden in heet water (85 ° C) voor 1-4 uur (1 uur voor de bladeren, en 4 uur voor de wortels).
2. Centrifugeer het water-zoluble fractie (3,300 g, 20 min, 4 ° C) om onoplosbare deeltjes te verwijderen.
3. Filtraat de vloeistoffractie door een 0,2 pm filter.
4. Het heldere water oplosbare filtraat fractie wordt vervolgens gefractioneerd door middel van ultrafiltratie met behulp van Centriprep YM-10 centrifugaalfilter (Winkel niet. 4.305, Millipore).
5. Het resulteerde laag (<10 kDa) en hoge (> 10 kDa) moleculair gewicht van de fracties (MWF) zijn gescreend op HMGB1-remmende activiteiten die gebruik maken van macrofagen culturen.
6. Intraperitoneale toediening van HMGB1-remmende kruiden-extract of componenten bij 24 uur na de CLP om hun therapeutische werkzaamheid te evalueren.

3. Peritoneale macrofagen Isolatie

1. Thioglycollate bouillon (4%, 2,0 ml) wordt intraperitoneaal toegediend in normale muizen.
2. Primaire peritoneale macrofagen geoogst na 3 dagen eerder ¹⁰ beschreven.
3. Macrofagen zijn vooraf gekweekt in DMEM medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS), 2 mmol / L glutamine en 1% penicilline.
4. Adherente macrofagen zacht gewassen met gekweekte en in, serumvrij OPTI-MEM medium I twee uur bij stimulatie met bacteriële endotoxine (lipopolysaccharide, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
5. 16 uur na LPS stimulatie worden niveaus HMGB1 in het kweekmedium bepaald door Western blot analyse ^11.
6. De relatieve intensiteit band werd gekwantificeerd met behulp van de NIH image 1,59 software om HMGB1 te bepalen aan de hand van standaard curves gegenereerd met gezuiverd HMGB1.

4. Representatieve resultaten

1. CLP induceert systemische en lokale ontsteking.

Binnen een paar uur van de CLP-operatie, dieren vertonen klinische symptomen van sepsis die pilo-erectie, lethargie, bij elkaar gekropen, en de daling van de voedsel-en wateropname te nemen. Dieren ontwikkeling een ernstige peritonitis met opeenvolgende systemischeinfectie normaal gesproken sterven binnen 48 tot 96 uur. Echter ook leeftijd, geslacht en genetische achtergrond afgestemde dieren reageren operatie CLP een onderscheiden wijze tijdens experimentele sepsis. Bijvoorbeeld, op 48 uur na de CLP, terwijl sommige dieren hebben benaderd de ten dode opgeschreven staat (als gedefinieerd in figuur 1), anderen blijven op een niet-dode opgeschreven staat.

Uitgebreide overzichten van circulerende cytokines geopenbaard dramatische verschillen in een aantal cytokinen (bv. IL-6, KC, MIP-2, en sTNFR1) tussen muizen in de stervende en de niet-stervende staten (figuur 1) ^12. Met name zijn deze ontstekingsmediatoren is aangemerkt als surrogaat markers van sepsis, omdat hun circulerende niveaus zijn betrouwbare voorspellers van dodelijke afloop in de experimentele ^12-14 of klinische sepsis ^15. Daarnaast CLP ook geïnduceerde lokale afgifte van verschillende pro-en anti-inflammatoire cytokines en chemokines. Bijvoorbeeld, bij48 uur na CLP, aanzienlijke hoeveelheden cytokines (bijvoorbeeld IL-6) en chemokines (KC en MIP-2) nog niet alleen systemisch worden gemeten in het bloed, maar ook plaatselijk in de peritoneale wasvloeistof (figuur 2).

2. Screening op HMGB1-remmende kruidenextract of onderdelen.

Met behulp van macrofagen culturen, waren we in staat om de capaciteiten van de verschillende kruiden extract of onderdelen in het remmen van endotoxine-geïnduceerde HMGB1 release (Figuur 3) te evalueren. In het licht van hun capaciteit in het remmen van HMGB1 release, hebben we verder onderzocht de werkzaamheid in diermodellen sepsis. Gezien de late en langdurige kinetiek van HMGB1 accumulatie in experimentele sepsis ⁸ werd de eerste dosis van HMGB1-remmers gegeven 24 uur na het begin van sepsis - een tijdstip wanneer de muizen duidelijke tekenen van sepsis ontwikkeld, zoals lethargie, diarree en pilo-erectie. Zoals getoond in figuur 4, vertraagd en herhaalde toediening van een grote groene thee component, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), te beginnen na 24 uur na het begin van sepsis, aanzienlijk gered muizen van dodelijke sepsis ^12. Zelfs wanneer het oraal wordt gegeven, EGCG nog gered muizen van dodelijke sepsis, aanzienlijk uit te breiden dier overleving van 16% naar 44% ^16. Het is belangrijk om te bepalen of combinatievormen therapieën met verschillende kruiden-componenten kunnen een significant betere bescherming te bereiken in diermodellen van sepsis. Samen vormen deze experimentele gegevens gevalideerd onze benadering van het scherm nieuwe therapeutische middelen met behulp van een diermodel van CLP-geïnduceerde sepsis.

5. Representatieve resultaten

Figuur 1. Bloedspiegels van surrogaat-markers zijn dramatisch hoger in septische dieren te benaderen ten dode opgeschreven staat. Balb / C-muizen werden onderworpen aan sepsis door de CLP en gecontroleerd op de ontwikkeling van het tekenen van ziekte. Bij eenlaat stadium van sepsis (52 uur na de CLP), werd bloed afgenomen van 3 normale muizen (-CLP), 3 septic muizen het naderen van de stervende staat, en 3 septische muizen in de niet-dode opgeschreven staat. Serum werd samengevoegd uit elke groep, en getest op de cytokine profiel door antilichaam-arrays. Let op het dramatische verschil in de relatieve niveaus van de verschillende surrogaatmarkers tussen verschillende groepen. Aangepast van doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 met toestemming van de uitgever.

Figuur 2. Detectie van lokale en systemische cytokines en chemokines op 48 uur na de CLP. Balb / C-muizen werden onderworpen aan sepsis door de CLP en bloed of peritoneale vloeistof werden geoogst bij 48 uur na CLP. Relatieve niveaus van verschillende cytokines en chemokines in samengevoegde serum of peritoneale lavage vloeistof werden gemeten door cytokine antilichaam arrays, en uitgedrukt in arbitraire eenheden (AE). Als controles, bloed en peritoneale vloeistof samples werden verkregen van normale gezonde dieren (-CLP) zonder laparotomie.

Figuur 3. Herbal component dosisafhankelijk remde endotoxine-geïnduceerde HMGB1 release in primaire macrofagen culturen. Primaire murine peritoneale macrofagen werden gestimuleerd met LPS in de afwezigheid of de aanwezigheid van kruiden-component (bijv. EGCG, 15 uM). 16 uur na LPS stimulatie werden niveaus HMGB1 in het kweekmedium bepaald door Western blot analyse. Aangepast van doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 met toestemming van de uitgever.

Figuur 4. Herbal component gered muizen van dodelijke sepsis. Balb / C-muizen werden blootgesteld aan dodelijke sepsis door de CLP-en kruiden-component (EGCG) was intraperitoneaal toegediend op +24, +48, 72 uur na het ontstaan ​​van sepsis. EeniMAL overleving werd gecontroleerd voor maximaal twee weken. De Kaplan-Meier-methode werd gebruikt om de verschillen in sterfte tussen groepen te vergelijken. * P <0,05 vergeleken zoutoplossing. Aangepast van doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 met toestemming van de uitgever.

In het laboratorium zijn verschillende diermodellen van sepsis is gebruikt om de pathogenese van sepsis begrijpen om mogelijke nieuwe therapieën te ontwikkelen. De klinische relevantie blijft een onderwerp van discussie voor de succesvolle vertaling van dierlijke studies naar klinische toepassingen voor sepsis. Hoewel neutraliserende antilichamen tegen vroege cytokinen (bv. TNF) waren beschermende in diermodellen van bacteriëmie / endotoxemie ^17,18, maar die eigenlijk erger overleven in dierlijke model van sepsis ^19. Ook de meeste anti-TNF-middelen niet om de effectiviteit te tonen in klinische studies van sepsis ^20-22. Deze mislukking weerspiegelt ten dele van de complexiteit van de onderliggende pathogene mechanismen van sepsis ^23,24. Daarnaast kan het ook toe te schrijven aan valkuilen zijn bij de selectie van: 1) haalbare therapeutische doelen of drugs; 2) een optimale dosering en tijdstip van drugs, en 3) niet-realistische klinische uitkomstmaten (zoals sterfte) ^25. De recente ontdekking van HMGB1-gerichte kruidenextract en / componenten, inclusief Danggui ^26, Groene thee ^12,16 en Danshen ²⁷ heeft succesvolle voorbeelden van preklinische onderzoek gebruik dierlijke modellen van sepsis. Nader onderzoek op dit gebied zal meer licht werpen op de moleculaire cascades die ten grondslag liggen regulatie van de aangeboren immuunrespons, en geven aanwijzingen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor verschillende inflammatoire ziekten. Bij de eerste CLP oprichting in uw laboratorium, moet het werk worden gesteld om de chirurgische ingreep uit te voeren zo snel en precies mogelijk dat de reproduceerbaarheid te garanderen, met name bij het gebruik van een groot aantal (30-40) van muizen om de overlevingskansen te vergelijken tussen verschillende experimentele groepen een experiment. Het gebruik van langwerkende anesthetica (zoals ketamine en xylazine) laat ons toe om CLP chirurgische procedure uit te voeren op een groot aantal muizen in een relatief korte tijd, en ondertussen helpenVerwijder mogelijke dosis variantie vaak opgetreden bij het gebruik van vluchtige anaesthetica. Overlevingscijfers en systemische cytokine accumulatie kan worden genomen als een teken van succesvolle uitvoering van CLP procedure.

CLP-model is op grote schaal gebruikt in de knaagdieren als gevolg van duidelijke voordelen in lage kosten, de eenvoud van de chirurgische ingreep, en uitgebreide pathologische, immunologische, fysiologische karakteriseringen. Er zijn echter een aantal beperkingen van de muis CLP model ^1-3. Bijvoorbeeld, als alle diermodellen wordt een soort dispariteit benadrukt door het feit dat caecale ligatie zonder gaatje fataal zijn bij de mens, maar niet in muizen. Bovendien, omdat kleine afmetingen van muis en uitdroging na CLP is het vaak moeilijk om seriële bloedmonsters verkrijgen cytokine meting. Deze nadelen kunnen deels worden ondervangen door het bewijs CLP modellen in grotere dieren ^2,3,27,28. Daarnaast is het van belang erop te wijzen dat de sterftecijfers ende stand van peritonitis bij knaagdieren worden grotendeels bepaald door de hoeveelheid ontlasting extrusie, die ontstaan ​​door de dikte van de naald gebruikt te prikken de blindedarm, het aantal gaatjes, het totale geligeerd blindedarm en de viscositeit van de kruk ^{2 3.} Daarnaast kan de dosering en frequentie van toediening van antibiotica in een vroeg stadium van de CLP ook van invloed op de sterftecijfers. Ten slotte kunnen dierlijke bronnen en woonomgeving ook bijdragen aan de variantie van de sterftecijfers.