L'utilisation de modèle animal de sepsis pour évaluer de nouvelles thérapies à base de plantes

1. Mise en place d'un modèle animal de la septicémie

1. Les souris sont anesthésiées avec de la kétamine (75 mg / kg, par voie intramusculaire, im) et de xylazine (10 mg / kg, im), et placé en position couchée.
2. Fixer les pieds de la souris avec du ruban adhésif afin d'assurer une position stable.
3. Nettoyez l'abdomen avec 3 gommages alternance de bétadine ou autre désinfectant de la peau et de l'alcool. Ensuite, faire une incision médiane de 15 mm pour exposer le caecum.
4. Ligaturer le caecum avec un fil de suture de soie 4-0 à environ 5,0 mm de la pointe du caecum, puis la perforation de la souche ligaturé caecale une fois avec une aiguille de calibre 22 pour permettre l'extrusion de matières fécales.
5. Le caecum est immédiatement replacé à sa position normale la position intra-abdominale.
6. Fermez le site de l'incision en deux couches, en commençant par la fermeture de la musculature de l'abdomen avec des sutures résorbables, puis la fermeture de la peau avec des clips ou des plaies de sutures non résorbables.
7. Réanimer la souris avec 0,5 ml de solution saline normale et un seul fairesoi de l'imipénème (0,5 mg / souris, sous-cutanée) immédiatement après l'achèvement de la procédure chirurgicale.
8. Retour de la souris à une cage propre avec un accès libre à la nourriture et l'eau.
9. Au moment après CLP divers points, extrait de fines herbes ou d'un composant est administré par voie intrapéritonéale.
10. La survie des animaux est surveillée pendant plus de deux semaines. Les animaux moribonds présentant des difficultés de se tenir, la respiration agonique, une atrophie musculaire et un saignement incontrôlé devraient être euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone surdosage.
11. Il est important de noter que les taux circulants de cytokines sont des paramètres importants dans ces études. Divers analgésiques ont été démontré qu'elle affecte la libération de cytokines et des activités, et ont donc été délibérément évité de soins post-opératoires.

2. Préparation de l'extrait de fines herbes

1. Extrait des herbes dans l'eau chaude (85 ° C) pendant 1-4 h (1 h pour les feuilles, et 4 h pour les racines).
2. Centrifuger l'eau-de sorteluble fraction (3300 g, 20 minutes, 4 ° C) pour éliminer les particules insolubles.
3. Filtrat la fraction de surnageant à travers un filtre de 0,2 um.
4. Le clair soluble dans l'eau fraction de filtrat est ensuite fractionné par ultrafiltration en utilisant Centriprep YM-10 filtre centrifuge (Catalogue no. 4305, Millipore).
5. Le résultat faible (<10 kDa) et élevé (> 10 kDa) fractions de poids moléculaire (MWF) sont sélectionnés pour HMGB1-inhibant les activités utilisant des cultures de macrophages.
6. L'administration intrapéritonéale de HMGB1 inhibiteurs extrait à base de plantes ou de composants à 24 heures après CLP afin d'évaluer leur efficacité thérapeutique.

3. Isolement des macrophages péritonéale

1. Bouillon au thioglycolate (4%, 2,0 ml) est administré par voie intrapéritonéale à des souris normales.
2. Primaires des macrophages péritonéaux sont récoltées à 3 jours, comme décrit précédemment ^10.
3. Les macrophages sont des pré-cultivée dans du milieu DMEM (Gibco BRL, Grand Island, NY) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mmol / L-glutamine, et 1% de pénicilline.
4. Macrophages adhérents sont lavés en douceur avec, et cultivées dans, sans sérum OPTI-MEM I moyen de deux heures avant la stimulation par l'endotoxine bactérienne (lipopolysaccharide, LPS, la bactérie E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
5. À 16 heures après la stimulation LPS, les niveaux de HMGB1 dans le milieu de culture sont déterminés par analyse Western blot ^11.
6. Le intensité de la bande a été quantifiée par rapport à l'aide du NIH image 1.59 du logiciel pour déterminer les niveaux de HMGB1 en référence à des courbes d'étalonnage générées avec purifié HMGB1.

4. Les résultats représentatifs

1. CLP induit une inflammation systémique et locale.

En quelques heures de la chirurgie CLP, les animaux présentent des signes cliniques de septicémie qui incluent horripilation, la léthargie, se blottir, et la diminution de l'apport en nourriture et en eau. Animaux en voie de développement d'une péritonite sévère avec systémique consécutivel'infection normalement mourir dans les 48 à 96 h. Cependant, même âge, du sexe et de génétique de fond appariés animaux peuvent répondre à la chirurgie CLP d'une manière distincte dans le cadre de la septicémie expérimentale. Par exemple, à 48 heures après CLP, tandis que certains animaux peuvent avoir approché l'état moribond (tel que défini dans la figure 1), d'autres peuvent rester à un état ​​non-moribonde.

Des études complètes sur cytokines circulantes ont révélé des différences dramatiques dans les niveaux de cytokines plusieurs (par exemple IL-6, KC, MIP-2, et sTNFR1) entre les souris dans les Etats moribonds et non moribondes (Figure 1) ^12. Notamment, ces médiateurs inflammatoires ont été classés comme des marqueurs de substitution de septicémie parce que leurs taux circulants sont des indicateurs fiables de une issue fatale dans experimental ^12-14 ou septicémie clinique ^15. En outre, CLP a également induit la libération locale de diverses cytokines pro-et anti-inflammatoire et des chimiokines. Par exemple, à48 h après CLP, des quantités importantes de cytokines (par exemple, IL-6) et des chimiokines (KC et MIP-2) peut encore être mesurée non seulement par voie systémique dans le sang, mais aussi localement dans le liquide de lavage péritonéal (figure 2).

2. Le dépistage de HMGB1 inhibiteurs à base de plantes ou de composants extrait.

En utilisant des cultures de macrophages, nous étions en mesure d'évaluer les capacités des extrait de fines herbes diverses composantes ou dans l'inhibition induite par l'endotoxine communiqué HMGB1 (Figure 3). À la lumière de leur capacité dans le communiqué de HMGB1 inhiber, nous avons encore exploré leur efficacité dans des modèles animaux septicémie. Compte tenu de la cinétique de la fin et prolongée de l'accumulation de la protéine HMGB1 dans le sepsis expérimental ^8, la première dose de HMGB1 inhibiteurs a été donnée 24 heures après le début de la septicémie - un point de temps lorsque les souris ont développé des signes clairs de septicémie y compris la léthargie, la diarrhée, et l'horripilation. Comme le montre la figure 4, retardée et l'administration répétée d'une grande c thé vertomponent, l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG), à partir de 24 h après l'apparition de la septicémie, de manière significative sauvé les souris d'une septicémie mortelle ^12. Même lorsqu'il est administré par voie orale, l'EGCG souris encore sauvés de septicémie mortelle, en augmentant sensiblement le taux de survie des animaux de 16% à 44% ^16. Il serait important de déterminer si les thérapies combinatoires avec plusieurs composants à base de plantes pourrait atteindre une protection significative de mieux dans des modèles animaux d'infection. Pris ensemble, ces données expérimentales validé notre approche à l'écran de nouveaux agents thérapeutiques en utilisant un modèle animal de CLP-induite septicémie.

5. Les résultats représentatifs

Figure 1. Les taux circulants de marqueurs de substitution sont considérablement plus élevés chez les animaux septiques approchant état ​​moribond. Souris Balb / C ont été soumis à une septicémie par le CLP et surveillés pour l'apparition de signes de maladie. Lors d'unestade tardif de l'infection (52 heures après CLP), le sang a été recueilli à partir de 3 souris normales (CLP-), 3 souris septiques qui approchent de l'état moribond, et 3 souris septiques à l'état non-moribonde. Le sérum a été mis en commun de chaque groupe, et analysés pour le profil des cytokines par les puces à anticorps. Notez la différence dramatique dans les niveaux relatifs de plusieurs marqueurs de substitution entre les différents groupes. Adapté de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 avec la permission accordée par l'éditeur.

Figure 2. Détection des cytokines locales et systémiques et des chimiokines à 48 heures après CLP. Souris Balb / C ont été soumis à une septicémie par le CLP, et sang ou de liquide péritonéal ont été récoltés à 48 h après CLP. Les niveaux relatifs de plusieurs cytokines et des chimiokines dans le liquide de lavage en commun le sérum ou le péritoine ont été mesurés par des réseaux d'anticorps cytokine, et exprimées en unités arbitraires (UA). Comme fluide contrôles, de sang et sa péritonéalemples ont été obtenus à partir d'animaux sains normaux (CLP-) sans laparotomie.

Figure 3. Composante à base de plantes dose-dépendante induite par l'endotoxine inhibée HMGB1 communiqué dans les cultures primaires de macrophages. Primaires macrophages péritonéaux murins ont été stimulées par le LPS, en l'absence ou la présence de la composante à base de plantes (par exemple, l'EGCG, 15 uM). À 16 heures après stimulation par le LPS, les niveaux de HMGB1 dans le milieu de culture ont été déterminés par analyse Western blot. Adapté de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 avec la permission accordée par l'éditeur.

Figure 4. Composante à base de plantes a sauvé les souris contre une septicémie mortelle. Souris Balb / C ont été soumis à une septicémie mortelle par le CLP, et le composant à base de plantes (EGCG) était administré par voie intraperitoneale à +24, +48, +72 heures poster le début de la septicémie. Unla survie iMAL a été suivie pendant jusqu'à deux semaines. La méthode de Kaplan-Meier a été utilisée pour comparer les différences dans les taux de mortalité entre les groupes. *, P <0,05 par rapport à une solution saline. Adapté de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 avec la permission accordée par l'éditeur.

Dans le laboratoire, plusieurs modèles animaux d'infection ont été employées pour comprendre la pathogenèse de l'infection afin de développer de nouvelles thérapies potentielles. Leur pertinence clinique reste un sujet de débat avant l'application réussie des études sur les animaux dans des applications cliniques pour le sepsis. Bien que des anticorps neutralisants contre des cytokines précoce (par exemple, le TNF) jouaient un rôle protecteur dans des modèles animaux de bactériémie / endotoxémie ^17,18, ils en fait aggraver la survie dans un modèle animal d'infection ^19. De même, la plupart des agents anti-TNF a échoué à montrer son efficacité dans les essais cliniques de septicémie ^20-22. Cet échec s'explique en partie par la complexité des mécanismes pathogéniques sous-jacents de la septicémie ^23,24. En outre, il peut aussi être attribuable aux pièges dans la sélection de: 1) réalisables cibles thérapeutiques ou des médicaments; 2) les doses optimales et le calendrier de la drogue, et 3) non-réalistes des mesures de résultats cliniques (tels que les taux de mortalité) ^25. La découverte récente de HMGB1-ciblage extrait de fines herbes et / composants, y compris Danggui ^26, thé vert ^12,16, et ²⁷ Danshen a fourni des exemples réussis de modèles précliniques animales enquête employant de la septicémie. Une enquête plus poussée dans ce domaine permettra de mieux comprendre la lumière sur les cascades moléculaires qui sous-tendent la réglementation de la réponse immunitaire innée, et fournir des indices pour le développement de thérapies pour les diverses maladies inflammatoires. Lors de la première place du CLP dans votre laboratoire, des efforts devraient être faits pour effectuer la procédure de chirurgie le plus rapidement et précisément que possible pour assurer la reproductibilité, en particulier lorsque vous utilisez un grand nombre (30-40) de souris de comparer les taux de survie entre plusieurs groupes expérimentaux de une expérience. L'utilisation de longue durée d'action des anesthésiques (comme la kétamine et de xylazine) nous permet de compléter CLP intervention chirurgicale sur un grand nombre de souris dans un laps de temps relativement court, et en attendant contribuer àretirer la variance dose potentielle se produit souvent lors de l'utilisation des anesthésiques volatils. Les taux de survie et de l'accumulation de cytokines systémique peut être pris comme des signes de bonne exécution de la procédure CLP.

Modèle CLP a été largement utilisé chez les rongeurs en raison de des avantages évidents en faible coût, la simplicité de la procédure chirurgicale, et de vastes pathologiques, immunologiques, caractérisations physiologiques. Cependant, il ya un certain nombre de limitations de la souris modèle CLP ^1-3. Par exemple, comme tous les modèles animaux, une disparité des espèces est mis en évidence par le fait que la ligature du caecum sans ponction peut être fatale chez la souris de l'homme, mais pas dans. En outre, en raison de la petite taille de la souris et de la déshydratation à la suite de CLP, il est souvent difficile d'obtenir des échantillons de sang en série pour la mesure des cytokines. Ces inconvénients peuvent être partiellement surmonté par la création de modèles CLP dans les grands animaux ^2,3,27,28. En outre, il est important de souligner que les taux de mortalité etles progrès de la péritonite chez les rongeurs sont en grande partie déterminée par la quantité d'extrusion selles, qui sont affectés par le calibre de l'aiguille utilisée pour percer le caecum, le nombre de crevaisons, le volume total du caecum ligaturé et la viscosité du tabouret ^{2, 3.} En outre, la dose et la fréquence de l'administration d'antibiotiques à un stade précoce de la CLP peut également affecter les taux de mortalité. Enfin, les sources animales et l'environnement du logement peut également contribuer à la variance des taux de mortalité.