Uso di un modello animale di sepsi per valutare nuove terapie a base di erbe

1. Istituzione di un modello animale di sepsi

1. I topi sono anestetizzati con ketamina (75 mg / kg, intramuscolare, IM) e xilazina (10 mg / kg, im), e posto in posizione supina.
2. Fissare i piedini del mouse con il nastro per garantire una posizione stabile.
3. Pulire l'addome con 3 scrub alternati di betadine o altro disinfettante cutaneo e alcool. Quindi, una incisione mediana 15 mm per esporre il cieco.
4. Legare il cieco con una sutura di seta 4-0 a circa 5,0 millimetri dalla punta cecale, e poi perforare il moncone ligato cecale una volta con un 22-gauge per consentire estrusione di feci.
5. Il cieco viene immediatamente sostituito alla sua normale posizione intra-addominale.
6. Chiudere il sito di incisione in due strati, chiudendo prima la muscolatura dell'addome con suture assorbibili, e poi chiudendo la pelle con clips ferite o suture assorbibili.
7. Resuscitare il mouse con 0,5 ml di soluzione salina normale e una singola farese di imipenem (0,5 mg / topo, sottocutanea) immediatamente dopo il completamento della procedura chirurgica.
8. Riportare il mouse avanti ad una gabbia pulita con libero accesso a cibo e acqua.
9. Al momento dopo CLP vari punti, estratto di erbe o componente viene somministrato per via intraperitoneale.
10. Sopravvivenza degli animali è monitorato per più di due settimane. Gli animali moribondi che presentano difficoltà di stare in piedi, respiro agonico, grave atrofia muscolare e sanguinamento incontrollato dovrebbero essere l'eutanasia per inalazione di anidride carbonica overdose.
11. È importante notare che i livelli circolanti di citochine sono parametri importanti in questi studi. Diversi analgesici hanno dimostrato di influire rilascio di citochine e le attività, e quindi sono stati volutamente evitati in cura post-operatoria.

2. Preparazione di Estratto di erbe

1. Estrarre le erbe in acqua calda (85 ° C) per 1-4 ore (1 ora per le foglie, e 4 ore per le radici).
2. Centrifugare d'acqua in modofrazione luble (3300 g, 20 min, 4 ° C) per rimuovere le particelle insolubili.
3. Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 um.
4. Il chiaro frazione solubile in acqua filtrato viene poi frazionata mediante ultrafiltrazione usando Centriprep YM-10 filtro centrifugo (Catalog no. 4305, Millipore).
5. Il risultato basso (<10 kDa) e alta (> 10 kDa), frazioni di peso molecolare (MWF) sono sottoposti a screening per HMGB1 che inibiscono le attività che utilizzano le culture macrofagi.
6. La somministrazione intraperitoneale di estratti di erbe HMGB1-inibitori o dei componenti a 24 ore dopo CLP per valutare la loro efficacia terapeutica.

3. Macrofagi isolamento peritoneale

1. Thioglycollate brodo (4%, 2.0 ml) viene somministrato per via intraperitoneale in topi normali.
2. Macrofagi peritoneali primari vengono raccolte in 3 giorni come descritto in precedenza ^10.
3. I macrofagi sono pre-coltivate in mezzo DMEM (Gibco BRL, Grand Island, NY) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mmol / L glutammina e 1% di penicillina.
4. Macrofagi aderenti sono delicatamente lavate con, e coltivate in, privo di siero OPTI-MEM I due ore prima della stimolazione con endotossina batterica (lipopolisaccaride, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
5. A 16 ore dopo la stimolazione con LPS, livelli di HMGB1 nel terreno di coltura sono determinati mediante Western blotting ^11.
6. L'intensità relativa banda è stata quantificata utilizzando l'immagine NIH 1,59 software per determinare i livelli HMGB1 con riferimento alle curve standard generata con purificato HMGB1.

4. Risultati rappresentativi

1. CLP induce infiammazione sistemica e locale.

Entro poche ore di intervento chirurgico CLP, gli animali mostrano segni clinici di sepsi che comprendono piloerezione, letargia, stringendosi, e la diminuzione dell'assunzione di cibo e acqua. Animali in via di sviluppo uno peritonite grave con sistemica consecutivol'infezione di solito muoiono entro 48-96 ore. Tuttavia, anche età, sesso, e sfondo genetico-matched animali possono rispondere a CLP chirurgia in modo distinguibile nel corso di sepsi sperimentale. Per esempio, a 48 ore dopo CLP, mentre alcuni animali possono aver avvicinato lo stato moribondo (come definito nella Figura 1), altri possono rimanere in uno stato di non-moribonda.

Indagini complete di citochine circolanti rivelato differenze drammatiche nei livelli di diverse citochine (per esempio, IL-6, KC, MIP-2, e sTNFR1) tra topi negli stati moribonde e non moribondo (Figura 1) ^12. In particolare, questi mediatori infiammatori sono stati classificati come marcatori surrogati di sepsi perché i loro livelli circolanti sono indicatori attendibili di esito letale nel ^12-14 sperimentale o clinico sulla sepsi ^15. Inoltre, CLP anche indotto rilascio locale di varie citochine pro-e anti-infiammatorie e chemochine. Ad esempio, a48 ore dopo CLP, notevoli quantità di citochine (ad esempio, IL-6) e chemochine (KC e MIP-2) possono ancora essere misurato non solo sistemico nel sangue, ma anche localmente nel liquido di lavaggio peritoneale (Figura 2).

2. Screening per l'estratto di erbe HMGB1-inibitori o componenti.

Utilizzando colture di macrofagi, siamo stati in grado di valutare le capacità dei vari estratto di erbe o di componenti di inibire endotossina-indotto rilascio HMGB1 (Figura 3). Alla luce della loro capacità di inibire la liberazione HMGB1, abbiamo ulteriormente esplorato la loro efficacia in modelli animali sepsi. Date le cinetiche di ritardo e prolungato accumulo di HMGB1 nella sepsi sperimentale ^8, la prima dose di HMGB1 inibitori è stata data 24 ore dopo l'insorgenza di sepsi - un punto di tempo in cui topi hanno sviluppato chiari segni di sepsi compresi letargia, diarrea e piloerezione. Come mostrato in figura 4, ritardata e somministrazione ripetuta di un importante tè verde component, epigallocatechina-3-gallato (EGCG), con inizio alle 24 ore dopo l'insorgenza di sepsi, salvato in modo significativo i topi da sepsi letale ^12. Anche quando somministrato per via orale, EGCG topi ancora salvati dalla sepsi letale, aumentando in modo significativo i tassi di sopravvivenza degli animali dal 16% al 44% ^16. Sarebbe importante per determinare se le terapie combinatorie con diversi ingredienti erboristici potrebbe ottenere una significativa protezione migliore in modelli animali di sepsi. Presi insieme, questi dati sperimentali convalidato il nostro approccio alla schermata nuovi agenti terapeutici utilizzando un modello animale di CLP-indotta da sepsi.

5. Risultati rappresentativi

Figura 1. I livelli circolanti di marcatori surrogati sono drammaticamente più elevato negli animali settici che si avvicinano stato moribondo. Balb / C topi sono stati sottoposti a sepsi da CLP e monitorati per lo sviluppo di segni di malattia. Afase avanzata di sepsi (52 hr dopo CLP), il sangue è stato raccolto da 3-topi normali (CLP), 3 topi settici che si avvicinano allo stato moribondo, e 3 topi settiche nel settore non-statale moribonda. Siero è stato riunito da ciascun gruppo, e analizzati per il profilo di citochine da parte array di anticorpi. Si noti la differenza drammatica i relativi livelli di alcuni marcatori surrogati tra i diversi gruppi. Adattato da doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 con il permesso rilasciato dal publisher.

Figura 2. Rilevamento di citochine locali e sistemiche e chemochine a 48 ore post-CLP. Balb / C topi sono stati sottoposti a sepsi da CLP, e sangue o liquido peritoneale sono state raccolte a 48 ore dopo CLP. Relativi livelli di diverse citochine e chemochine in pool di siero o nel liquido di lavaggio peritoneale sono stati misurati mediante array di anticorpi citochine, ed espresso in unità arbitrarie (UA). Come fluido sa controlli, sangue e peritonealemples sono stati ottenuti da animali sani (normali-CLP) senza laparotomia.

Figura 3. Componente di Herbal dose-dipendente inibito endotossina-indotto HMGB1 rilascio in colture primarie di macrofagi. Primarie macrofagi peritoneali murini sono state stimolate con LPS in assenza, o presenza di componenti a base di erbe (per esempio, EGCG, 15 pm). A 16 ore dopo la stimolazione con LPS, livelli di HMGB1 nel terreno di coltura sono stati determinati mediante Western blotting. Adattato da doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 con il permesso rilasciato dal publisher.

Figura 4. Componente di Herbal salvato i topi da sepsi letale. Balb / C topi sono stati sottoposti a sepsi letale da CLP, e la componente a base di erbe (EGCG) è stato somministrato per via intraperitoneale a +24, +48, +72 ore dopo l'insorgenza di sepsi. Unsopravvivenza IMAL è stata monitorata per un massimo di due settimane. Il metodo di Kaplan-Meier è stato utilizzato per confrontare le differenze nei tassi di mortalità tra i gruppi. *, P <0,05 rispetto salina. Adattato da doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 con il permesso rilasciato dal publisher.

In laboratorio, modelli animali di sepsi sono stati impiegati per comprendere la patogenesi di sepsi, al fine di sviluppare nuove terapie potenziali. La loro rilevanza clinica rimane un argomento di dibattito prima della traduzione con successo studi su animali in applicazioni cliniche per la sepsi. Sebbene anticorpi neutralizzanti contro citochine precoci (ad esempio, TNF) sono stati protettivo in modelli animali di batteriemia / endotossemia ^17,18, in realtà peggiorano sopravvivenza nel modello animale di sepsi ^19. Allo stesso modo, la maggior parte degli anti-TNF non è riuscito a mostrare l'efficacia in studi clinici di sepsi ^20-22. Questo errore riflette in parte sulla complessità dei meccanismi patogenetici sottostanti sepsi ^23,24. Inoltre, può anche essere attribuibile al insidie ​​nella selezione di: 1) possibili bersagli terapeutici o stupefacenti; 2) le dosi ottimali e tempi di farmaci, e 3) non-realistiche misure di outcome clinici (come i tassi di mortalità) ^25. La recente scoperta di HMGB1-targeting estratto di erbe e / componenti, tra cui Danggui ^26, tè verde ^12,16, e ²⁷ danshen ha fornito esempi di successo di modelli animali preclinici di indagine che impiegano di sepsi. Ulteriori ricerche in questo settore darà un'idea più chiara sulle cascate molecolari alla base regolazione della risposta immunitaria innata, e fornire indizi per lo sviluppo di terapie per varie malattie infiammatorie. La prima volta che stabilisce CLP nel vostro laboratorio, lo sforzo dovrebbe essere fatto per eseguire la procedura chirurgica più velocemente e precisamente possibile per garantire la riproducibilità, in particolare quando si utilizza un numero elevato (30-40) di topi per confrontare i tassi di sopravvivenza tra i diversi gruppi sperimentali di un esperimento. L'uso di anestetici lunga azione (come chetamina e xilazina) ci permette di completare la procedura chirurgica CLP su un gran numero di topi in un lasso di tempo relativamente breve, e nel frattempo contribuire arimuovere scostamento potenziale dosaggio spesso durante l'utilizzo di anestetici volatili. I tassi di sopravvivenza e accumulo di citochine sistemica può essere preso come segno di buona riuscita della procedura CLP.

CLP modello è stato ampiamente utilizzato in roditori a causa di ovvi vantaggi in basso costo, semplicità di procedura chirurgica, e ampie patologici, immunologici, caratterizzazioni fisiologiche. Tuttavia, vi sono una serie di limitazioni del modello ^1-3 CLP topo. Ad esempio, come tutti i modelli animali, una disparità specie è evidenziata dal fatto che la legatura cecale senza puntura può essere fatale in topi umani, ma non in. Inoltre, date le piccole dimensioni di topo e successiva disidratazione per CLP, è spesso difficile ottenere campioni di sangue per la misurazione seriali citochina. Questi svantaggi possono essere in parte superati attraverso la definizione di modelli CLP in animali più grandi ^2,3,27,28. Inoltre, è importante sottolineare che i tassi di mortalità el'avanzamento di peritonite in roditori sono in gran parte determinato dalla quantità di estrusione sgabello, che sono influenzate dal calibro dell'ago utilizzato per forare la cieco, il numero di punture, il volume totale di cieco ligato e la viscosità delle feci ^{2, 3.} Inoltre, la dose e la frequenza di somministrazione di antibiotici nelle fasi iniziali di CLP può colpire anche i tassi di mortalità. Infine, di origine animale e l'ambiente custodia può anche contribuire alla varianza dei tassi di mortalità.