Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

1, 1, 2, 3, 3, 4, 1, 3

1Wisconsin Water Science Center, United States Geological Survey, 2University of Wisconsin – Madison, 3Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 4Alaska Science Center, United States Geological Survey

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 184.72.91.94, User IP: 184.72.91.94, User IP Hex: 3091749726

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

Millen, H. T., Gonnering, J. C., Berg, R. K., Spencer, S. K., Jokela, W. E., Pearce, J. M., et al. Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3930, doi:10.3791/3930 (2012).

Abstract: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

Важным первым шагом в оценке уровня возбудителя при подозрении на загрязненной воды концентрация. Концентрация методы, как правило, специфичные для определенного возбудителя группы, например, охране окружающей среды США Метод 1623 для Giardia и Cryptosporidium 1, что означает несколько методов требуется, если выборка программа ориентирована на более чем одним возбудителем группы. Другим недостатком существующих методов является оборудование может быть сложным и дорогим, например, VIRADEL метод 1MDS фильтра для концентрирования вирусов 2. В этой статье мы расскажем, как построить фильтры стекловаты для концентрирования водных патогенов. После того, как фильтр элюирования, концентрат поддается второй этап концентрации, таких как центрифугирования, после чего возбудитель обнаружения и подсчета культурной или молекулярных методов. Фильтры имеют ряд преимуществ. Строительство легко и фильтры могут быть построены дляНью-Йорк размер для удовлетворения специфических требований отбора. Фильтр части стоят недорого, что позволяет собрать большое количество образцов, не сильно влияет бюджета проекта. Большие объемы выборки (100s до 1000 с L) может быть сосредоточено в зависимости от скорости засорения от образца мутности. Фильтры портативный и с минимальным оборудованием, таким как насоса и расходомера, они могут быть реализованы в области отбора проб готовой питьевой воды, поверхностных вод, подземных вод и сельскохозяйственных стоков. Наконец, стекловата фильтрации является эффективным для концентрации различных типов возбудителей это только один из методов не требуется. Здесь мы сообщаем о фильтре эффективность в концентрации водных человека энтеровирусы, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum и вируса птичьего гриппа.

Protocol: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

1. Подготовка стекловаты

  1. До и после выполнения каждой серии фильтров, стерилизация рабочей зоны с 10% гипохлоритом натрия.
  2. Наденьте перчатки и халат. Стерилизовать ведро в автоклаве при 121 ° C и 15 фунтов на квадратный дюйм, по крайней мере 20 минут. Поместите стекловаты в стерильной ведро.
  3. Пропитайте стекловату с обратным осмосом воды и дайте впитаться в течение 15 минут.
  4. Слейте воду обратного осмоса из ведра.
  5. Пропитайте стекловату с 1 М HCl и пусть замочить на 15 минут.
  6. Слейте 1 M HCl из ведра.
  7. Промойте стекловату с обратной воды обратного осмоса.
  8. Тщательно перемешайте.
  9. Проверьте рН использованием индикаторной бумаги и повторить обратный осмос воды промыть до нейтральной рН достигается.
  10. Вылейте промыть водой.
  11. Пропитайте стекловату с 1 М NaOH и пусть замочить на 15 минут.
  12. Слейте 1 М NaOH из ведра.
  13. REPEAT обратного осмоса промыть до нейтральной рН достигается.
  14. Вылейте промыть водой.
  15. Вместо того, чтобы ведро, стиральная машина стекловата может быть построен, которая похожа по дизайну на шайбу стеклянной пипетки (рис. 1).
  16. Накройте стекловаты полностью стерильной фосфатного буфера (PBS), доводят до рН 6,8.
  17. Использование подготовленных стекловолокна сразу или хранить при 4 ° C. Он может храниться до двух недель. Перед использованием убедитесь, что рН является нейтральной, как он будет расти с течением времени. Если рН не является нейтральным, повторно промыть стерильной фосфатного буфера (рН 6.8).

2. Сборка фильтров стекловаты

  1. Просверлите 11/16 дюймовые отверстия в колпачки из ПВХ и нажмите темы, так что мужчина арматура нейлоновый адаптер может быть пьяным в шапках. Этот шаг необходим только для первого собрания. После этого крышки могут быть использованы в течение многих лет. Применение тефлоновыхлента нейлон темы фитингов и винтами для крышки.
  2. Пакет труб из ПВХ с небольшими кусочками стекловолокна. Используйте металлический поршень, как клапанный двигатель автомобиля, чтобы упаковать плотно. Упаковка не требует большой силы. Пакет достаточно плотно, так что стекловата остается на месте и каналы не являются. Однако, не так плотно упаковать вода не может проходить через фильтр. Когда упакованы соответствующим образом, расход от 4 до 5 литров в минуту должно быть достижимым, когда фильтр крепится к водопроводных кранов с давлением 40-60 атм. По размеру ПВХ трубы, указанные в настоящем протоколе, около 85 граммов вымыть и упакованы стекловаты используется в трубу. Тара пустая труба ПВХ на верхней загрузкой баланса и пакет с мытой шерсти до стеклянной трубки увеличивает массу 85 грамм.
  3. Вставьте полипропиленовой сетки в ПВХ колпачки с мужчинами адаптер нейлон присоединенными фитингами.
  4. Применить тефлоновая лента с резьбовым части трубы из ПВХ.
  5. Винтовые крышки на ПВХ, ПВХ рIPE и этикетки один фильтр конце приток, а другой конец оттоку. Это важно, позже для элюирования шаг. Какой конец обозначен приток не имеет значения.
  6. Нажмите 60 мл стерильного фосфатного буфера (рН = 6.8) в фильтр с помощью катетера наконечником шприца. Превышение выйдет противоположном конце.
  7. Wrap заканчивается плотно парафильмом, чтобы избежать утечки. Фильтры могут храниться до 30 дней при температуре 4 ° C.

3. Отбор проб

  1. Стерилизовать трубки для отбора проб по рециркуляции или погружения элементов в течение 30 минут в 0,525% NaClO (например, 10% раствор стандартного бытового отбеливателя). Следуйте этим путем слива раствора гипохлорита и нейтрализации с 0,05% тиосульфата натрия, путем добавления 25 мл 2% акций безводного раствора тиосульфата натрия в одном литре воды обратного осмоса.
  2. Для пробы воды с рН более 7,5, регулировать рН между 6.5 и 7.0 с HCl. HCl концентрация может колебаться от 0,25М 1 М Четыре литра 0,5 М HCl как правило, достаточно для двух 800 л образцов, в зависимости от окружающей рН воды и буферная емкость. Вводите HCl при отборе проб с использованием перистальтического насоса или Вентури (рис. 2). Регулировка скорости насоса или Вентури открытия для достижения целевого показателя рН. Измерить рН на выходе образца строки, используя метр поля рН.
  3. Использование предварительной очистки, если стекловата фильтр сабо из воды с высокой мутностью. (Спецификация для предварительной очистки и жилья в онлайн-список материалов). Потому что возбудители могут быть прикреплены к частиц, захваченных предварительной очистки необходимо элюируются вместе с фильтром стекловолокна (см. ниже).
  4. Регулировка скорости потока в диапазоне от 2 до 4 л / мин. Типичные объемы образца от 200 до 1500 литров.
  5. Отключить фильтр стекловаты и хранить в полиэтиленовом пакете в стерильном 4 ° C в течение 48 часов.

4. Элюирование

  1. Прикрепите фильтр стекловаты в кольцостоять в конце образца приток направлен вниз в полипропиленовые бутылки. Элюции противоположное направление потока пробы.
  2. Нажмите 80 мл стерильной 3% экстракт говядины в 0,05 М глицин, рН 9,5 в фильтр.
  3. Подождите 15 минут.
  4. Нажмите еще 80 мл стерильной 3% экстракт говядины в 0,05 М глицин, рН 9,5 в фильтр.
  5. Нажмите воздуха тщательный фильтр, пока пена выходит из фильтра на входе.
  6. Отрегулируйте элюата рН между 7.0 и 7.5 с 1 M HCl.
  7. Магазин элюата при 4 ° С в течение 24 часов при температуре -20 ° С в течение более длительных периодов времени.
  8. Элюции предварительной очистки, если не используется. Отвинтите верхней части корпуса картриджа и слить все остатки воды в корпус, удерживая предварительной очистки на месте с помощью стерильных перчатках.
  9. Снимите фильтр грубой очистки из корпуса картриджа и скольжения его в 15 "х 6" молнии сумки.
  10. Залить 200 мл стерильной 3% экстракт говядины в 0,05 М гlycine с рН 9,5 в пакет и запечатать надежно молнии.
  11. Обратить мешках предварительной очистки несколько раз, чтобы вся поверхность приходит в соприкосновение с экстракт говядины.
  12. Подождите 15 минут, время от времени обращения и массаж мешках предварительной очистки.
  13. Откройте молнии. Возьмите мешок вокруг предварительной очистки сильно выжать столько экстракт говядины, как можно и вытащить фильтр грубой очистки с стерильных перчатках.
  14. Налейте элюата экстракт говядины в полипропиленовые бутылки.
  15. Отрегулируйте элюата рН между 7,0 и 7,5 с 1М HCl.
  16. Магазин элюата при 4 ° С в течение 24 часов при температуре -20 ° С в течение более длительных периодов времени. Элюата предварительной очистки могут быть проанализированы отдельно для патогенных микроорганизмов или в сочетании с фильтром элюата стекловолокна.

5. Представитель Результаты

Патогенный микроорганизм Уровень мутности воды (NTU) Количество Сеяные / L б, в, г Восстановление% ± 1 SD Число независимых испытаний
Энтеровирус-полиомиелита Сабин III 0,5 500 81% ± 11 7
EnteroВирус полиомиелита Сабин-III 0,5 5000 67% ± 12 8
Энтеровирус-полиомиелита Сабин III 215 500 59% ± 32 7
Энтеровирус-полиомиелита Сабин III 215 5000 38% ± 22 6
Энтеровирус-полиомиелита Сабин III 447 500 56% ± 18 8
Энтеровирус-полиомиелита Сабин III 447 5000 63% ± 37 8
Cryptosporidium parvum 0,5 5 38% ± 14 7
Cryptosporidium parvum 0,5 50 53% ± 19 8
Плакатьptosporidium parvum 215 5 40% ± 16 7
Cryptosporidium parvum 215 50 30% ± 6 6
Cryptosporidium parvum 447 5 33% ± 13 8
Cryptosporidium parvum 447 50 28% ± 11 8
Сальмонеллы enterica 0,5 5 29% ± 24 7
Сальмонеллы enterica 0,5 500 56% ± 16 8
Сальмонеллы enterica 215 5 32% ± 24 7
Сальмонеллы enterica 215 500 34% ± 11 6
Сальмонеллы enterica 447 5 34% ± 18 8
Сальмонеллы enterica 447 500 31% ± 24 8
  1. Нефелометрическая единица мутности
  2. Энтеровирусы перечисленных КПЦР как геномных копий / L
  3. C. parvum перечисленных иммунофлюоресценции как ооцисты
  4. С. enterica перечисленные культуры колониеобразующих единиц

Таблица 1. Стекловаты с различной концентрацией воды и помутнения возбудителя плотности.

Патогенный микроорганизм Место пробы воды Количество Сеяные / L % Reco очень
Птичий грипп H5N2 Sundi озера, Анкоридж района 2500 42,9%
Птичий грипп H5N2 Минто квартиры, Фэрбенкс North Star района 2500 36,7%
Птичий грипп H5N2 Portage долине, Анкоридж района 2500 7,8%
Птичий грипп H5N2 Поттер Марш, Анкоридж района 2500 41,5%
Птичий грипп H5N2 Willow Lake, Yukon-Koyukuk района 2500 15,5%
  1. Измеряется КПЦР как геномных копий / L

Таблица 2. Стекловаты концентрация вируса птичьего гриппа с использованием воды из пяти участков на Аляске.

les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Схема омывателя стекла шерстью. Это может быть использовано вместо ковша, экономя время от промывки. Эта концепция похожа на шайбу пипетка стекло.

Рисунок 2
Рисунок 2. Стекловаты фильтрации с кислотой впрыском перистальтического насоса. Обратите внимание на "Т", где разъем насоса труб представляет кислоты в образце линии между водопроводной воды и фильтра стекловаты. рН необходимо, только если вода пробы имеет рН> 7,5.

Фильтры из стекловаты эффективны в концентрации патогенов из воды с широким спектром мутности уровня и плотности возбудителя (табл. 1). Чтобы проверить это, 20 литров дехлорированию водопроводную воду смешивают с сухой ил суглинка (0, 1.27, или 2,75 г / л) для достижения желаемого уровня мутности, а затем высевают с патогенами при различных плотностях. Водыпропускали через фильтр стекловолокна, концентрированный патогенов в элюата были перечислены, и это значение числителя в расчете возмещения процентов. Количество патогенных посеяны в воду, то есть, в знаменателе расчета восстановления процентов, определяется по первому посева патогенов в отрицательную элюата затем перечисления патогенов. Отрицательное элюата был подготовлен переход unseeded 20 литров образца через фильтр и элюирования. Количественная посеяны патогенов в негативном элюата избежать различий в перечень возбудителей, которые могут привести из матрицы различий создается фильтр стекловолокна. Важность этого шага, когда количественное патогенов КПЦР обсуждается в Ламбертини соавт. 3. 20 л отрицательного контрольного образца был сосредоточен через стекловату фильтрации, чтобы определить нет родных настоящее патогенов, которые могли бы посрамить расчет процентов восстановления. 10 мкм номинальный размер пор фильтра грубой очистки Wкак использовать, когда мутность уровень был ≥ 215 NTU.

Полиовирус был количественно в режиме реального времени КПЦР использованием вторичного концентрации и нуклеиновых кислот процедур извлечения, грунтовки и зонд описано в Ламбертини соавт. 3. Cryptosporidium parvum было количественно в последние концентрированный объем выборки (FCSV) создан вторичный процедура концентрации полиовируса . Ооцисты были визуализированы с помощью иммунофлуоресценции (MeriFluor Cryptosporidium и Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc, Cincinnati, OH). Salmonella enterica была количественно FCSV на покрытие на XLD агар (Remel, Lenexa, KS) и подсчет колониеобразующих- единиц.

Фильтры из стекловаты эффективны в концентрации вируса птичьего гриппа (табл. 2). Низкой патогенности вируса птичьего гриппа (H5N2) были посеяны в воду в нескольких местах на Аляске и процент восстановления рассчитывается как описано Абове. Вторичный концентрации и нуклеиновых кислот процедуры были выполнены, как и для полиовируса; вирус количественно КПЦР с использованием праймеров и зонда описано в Spackman и др. 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

Фильтры из стекловаты были использованы несколько исследовательских групп 3,5,6 сосредоточиться человека кишечными вирусами из различных водных источников, таких как питьевая вода закончила 7, 8,9 подземные, поверхностные воды 10, морской воды 11, сточные воды 12 и сельскохозяйственные стоки 13. Здесь мы сообщаем о фильтрах, также эффективны в концентрации вируса птичьего гриппа, а также бактерий и простейших возбудителей сальмонеллы enterica (серовар Typhimurium) и Cryptosporidium parvum, соответственно. Deboosere соавт. Также недавно сообщила, концентрация стекловаты вируса птичьего гриппа 14.

Фильтры имеют преимущество в том, что они недороги, легко переносимые, пригодный для использования в широком диапазоне воды матрицы и эффективный для сосредоточения многих видов водных патогенов. Они могут быть построены до любого размера, в зависимости от потребности в научных исследованиях. После дезинфекциииона, корпуса фильтров многократного.

Фильтры из стекловаты, однако, есть ограничения. Как и любой метод концентрации вируса, которая опирается на electropositively заряженной среды для адсорбции вирусов (например, 1MDS фильтра CUNO Inc, Meriden, CT), фильтр эффективность зависит от окружающей рН воды. В нашей лаборатории мы выбрали рН 7,5, как отсечения, выше которой рН воды корректируется вниз, непрерывно насосной 0,25 М HCl в фильтр линейный вход во время отбора проб. Высшее воды рН можно попробовать без рН, но за счет эффективности фильтра 3. Другим ограничением является срок годности. Мы показали, фильтров хранить при температуре 4 ° C в течение шести недель, что возбудитель эффективность концентрация не снижаться (неопубликованные данные). Тем не менее, более длительное время хранения не были проверены так, консервативно, для обеспечения качества данных, мы не используем фильтры старше 30 дней. Как правило, фильтры изготавливаются по мере необходимости. Другим потенциальным препятствием в некоторых КантриS является получение стекловаты из французских источников, указанных в предыдущих работах. Недавно мы показали стандартный unfaced изоляция из стекловолокна является столь же эффективным, и это легко доступны в магазинах оборудования или благоустройства жилья (см. перечень материалов в Интернете).

Для всех экспериментов, важно, чтобы запустить два набора элементов управления, оборудование для обеспечения пустых стеклянных фильтров шерсть не загрязненных в процессе строительства и восстановления контроля для обеспечения фильтры работают, как задумано. Эти элементы необходимы для любой воде возбудитель метод концентрации.

Используя фильтр стекловата может быть также просто, как присоединение ее к крану и включения крана или так сложно, как отбор проб осадка груженого реки в отдаленном месте, требуя насосы, рН и предварительной очистки для предотвращения засорения. Для нашей исследовательской группы, крупнейшие выгоды от использования фильтров стекловолокна является возможность собирать и анализировать тысячи проб водыс для человека и домашнего скота патогенов, что приводит данные о возбудителя численности и распространения в окружающей среде, которая не была бы по мере возможности с более дорогостоящими, сложными методами 13,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

Мы благодарим Уильям Т. Эккерта для повествующая видео. Разработка протокола стекловолокна была частью водного Висконсин и здоровье судебных для кишечных риски (WAHTER исследований), финансируемого США EPA ЗВЕЗДА Грант R831630. Аляска образцы, собранные А. Ривз, А. Реми, Б. Meixell при финансовой поддержке Геологической службы США. Любое использование торговых, продуктов и фирменных наименований для описательный характер и не означает одобрения со стороны правительства США.

Materials: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

Name Company Catalog Number Comments
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-500
Sodium hydroxide Fisher Scientific BP359-212
Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic Fisher Scientific BP358-212 BP363-500 BP362-500
Sodium hypochlorite i.e., household bleach Clorox
Sodium thiosulfate, anhydrous Fisher Scientific S 475-212
Beef extract, desiccated BD Biosciences 211520
Glycine Fisher Scientific G46-500
Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation Johns Manville Bourre 725 QN
Polypropylene mesh Industrial Netting xN4510
2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple Grainger 6MW35
2" Sch 40 PVC cap Grainger 5WDW3
Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") US Plastic Corp. 62178
Sample bottles for eluate- 1 liter Fisher Scientific 03-313-4F
60 mL syringe Fisher Scientific NC9661991
pH strips Whatman, GE Healthcare 2614 991
Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 m McMaster-Carr 4411K75
Prefilter housing Cole-Parmer S-29820-10

References: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

  1. US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002, http://www.epa.gov/microbes/1623de05.pdf Accessed January 18, 2012 (2005).
  2. Cashdollar, J.L. & Dahling D.R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
  3. Lambertini E., et al. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996, (2008).
  4. Spackman E., et al. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
  5. Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre, West Midlands, United Kingdom, (2000).
  6. Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., & Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306, (1993).
  7. Vivier, J.C., Ehlers, M.M., & Grabow, W.O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705, (2004).
  8. Powell, K.L., et al. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O., ed., Balkema, Rotterdam, 813-816 (2000).
  9. Hunt, R.J., Borchardt, M.A., Richards, K.D., & Spencer, S.K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963, (2010).
  10. van Heerden, J., Ehlers, M.M., Heim, A., & Grabow, W.O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242, (2005).
  11. Vilaginés, P., et al. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449, (1997).
  12. Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., & Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271, (1997).
  13. Borchardt, M.A., Jokela, W.E., & Spencer, S.K. Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Poster #1436, American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, May 21-25, (2011).
  14. Deboosere, N., et al. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808, (2011).
  15. Lambertini, E., et al. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).

Ask the Author: Стекловаты фильтры для концентрирования водной основе вирусов и сельскохозяйственной зоонозных патогенов

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter