Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

1. Preparazione di sostanze volatili Riconosciuto dalla pianta ospite per EAG Screening

1. Dopo l'identificazione e l'autenticazione appropriato di tutti i volatili mediante GC-MS, eseguire l'analisi EAG soffio di ogni volatili disponibili. Lo screening iniziale può essere un numero basso di replica risposte antennali (N = 3-5) per ciascun sesso, al fine di ottenere una indicazione di chemoreceptivity relativa in un breve lasso di tempo (Tabella 1).
2. Preparare una soluzione di ogni volatili ad una mg / mL concentrazione 5 in pentano. Sigillare ermeticamente e conservare in frigorifero fino al momento del campione per l'uso immediato (ad esempio, acetofenone, densità = 1,03 g / mL, volume = (0,005 g/1.03 g / mL) x 1,000 = 4,85 microlitri di acetofenone in un pallone 1,0 ml e diluire a 1,0 mL con pentano).
3. Poco prima dell'analisi EAG, rimuovere fiale contenenti il ​​5 mg / ml concentrazione di sostanze volatili da testare e permettono di riscaldare a temperatura ambiente. Nel frattempo, l'etichetta del numero corretto di pipette Pasteurcorrispondono a ciascuna volatili da testare, e avvolgere un piccolo pezzo di parafilm (ca. 15 x 15 mm) sopra la punta della pipetta. Per i primi 10 pipette di screening di stimolo (N = 4 per ogni maschio e femmina) vengono caricati in caso di cattiva preparazione o altro ostacolo imprevisto.
4. Utilizzando un paio di pinzette, piegare leggermente il disco saggio biologico in mezzo per facilitare il posizionamento nella pipetta, poi parzialmente inserire il disco piegato nel grande fine della pipetta in modo che ca. 2-3 millimetri del disco sono esposti. Allineare le pipette etichettati e preparata in un contenitore rack.
5. Utilizzando una pipetta o siringa, caricare 10 L (50 pg) di soluzione volatile su ciascun disco e consentire 2 minuti prima di passare completamente inserire dischi nella pipetta. Una volta caricato, immediatamente sigillare l'estremità della pipetta con parafilm (ca. 15 x 30 mm). La quantità di stimolo volatile per essere caricati e gonfio è molto probabile che variano a seconda delle specie di insetti.
6. Seguendo lo stesso protocollo notato sopra per preparare i controllicomprendono in ogni analisi. Per il carico negativo di controllo 10 microlitri di appena pentano su ogni disco, attendere 2 minuti, caricare nella pipetta etichetta e sigillo. Per il controllo positivo, caricare 10 L (50 mg) sul disco, attendere 2 minuti, il carico nella pipetta etichetta, e sigillare con parafilm.
7. La vitalità della preparazione insetto antennale molto probabile che variano a seconda delle specie, ma abbiamo scoperto che Amyelois transitella antenne tipicamente rimanere attivi e coerente per> 30 minuti dopo l'escissione utilizzando il protocollo descritto. Questa quantità di tempo generalmente consentire fino a 4-10 volatili campioni da valutare. Tabella 2 fornisce un esempio di tempi e sequenze.

2. Preparazione delle antenne degli insetti per l'EAG Bioassay

1. L'obiettivo di questo esperimento è EAG analisi, quindi, l'ipotesi che ogni investigatore avrà accesso a insetti allevati in modo appropriato.
2. Per questo esperimento studieremo 3-4 giorni olod, accoppiati falene maschio e femmina. Falene individuali vengono trasferiti in un piccolo, con coperchio, contenitore di plastica il giorno di analisi. Immediatamente prima della prova biologica, la falena da testare viene trasferito a capofitto in un apparato di supporto (ad esempio, a base di vari consigli pipettatori di plastica) e sicuro da dietro. La manipolazione del insetto può essere visto sotto un basso consumo stereo-microscopio per facilitare escissione.
3. Antenne sono preso in giro con filo di punta strumento. Il titolare forcella, con un piccolo film di gel dell'elettrodo, viene posto in prossimità per il trasferimento rapido di antenne. La prima antenna viene asportato mediante forbici micro e sulla forcella, assicurando la base dell'antenna è posto sul non-rosso porzione della forcella (l'elettrodo di massa indifferente). Un set timer per 10 minuti viene avviato e la seconda antenna viene asportato e posizionato vicino alla prima antenna con le due basi sullo stesso lato della forcella.
4. In alternativa, le antenne possono essere lasciati sicurezza all'interno del holdinTubo g, asportato, quindi delicatamente rimosso dal tra il tubo e l'insetto con un filo a punta utensile con una piccola quantità di gel sul fondo.
5. Antenne vengono controllati per garantire la base e la punta sono immersi in gel dell'elettrodo e bolle sono presenti nel gel. Le estremità / suggerimenti può essere tagliata per garantire la piena esposizione al gel per elettrodi. Si dovrebbe essere utilizzato per garantire che la parte restante di ciascuna antenna non è coperto con gel, garantendo così la massima area superficiale antennale è esposta al soffio.
6. La forcella adeguatamente trattata viene poi inserita nella sonda pre-amplificatore e mantenuto sotto un flusso costante di aria umidificata a 200 mL / min per il tempo rimanente del periodo di attesa di 10 minuti. Il tempo di accise e EAG tempi di inizio sono noti (Tabella 2) e 30 secondi prima del soffio primo stimolo, la pipetta contenente il controllo positivo viene sigillata e posta in cui il supporto viene regolata per dirigere aria / sfoglia flusso 2-3 mm dal il prepped antenne.
7. Dopo ogni esperiiment, le falene di prova sono sacrificati in un ambiente di ghiaccio secco e ben disposti.
8. Falene femminili sono sezionati per verificare lo stato di accoppiamento. Maschi conviventi si presume che siano accoppiati.

3. EAG protocollo per i singoli componenti

1. Risposte antennali sono registrati tramite il software incluso AutoSpike con lo strumento EAG Syntech. La configurazione nella scheda Proprietà AutoSpike per il canale con la sonda EAG è impostato su una frequenza di campionamento di 106,7, NO alla rettifica, e un filtro di 0-42 Hz. Per la scheda Filter, il filtro EAG è acceso e il basso-cutoff è impostata a 0,1 Hz.
2. Sbuffi di stimolo sono 1-2 secondi di durata. Un timer impostato per 1 minuto viene avviato dopo ogni puff.
3. La pipetta prossimo test volatile è sigillata e posta nel supporto. La sequenza di volatili prove, randomizzati fra corre per garantire che non composti di prova costante seguire un altro test volatile, viene quindi seguita (ad esempio, Tabella 2) accuratamente allowing 1 minuto tra sbuffi.
4. Per facilitare la facilità di leggere le risposte EAG, porzioni di governanti sono posti sullo schermo del computer e il livello di base all'apice del segnale di deflessione verso il basso viene misurata in mm e registrato su un foglio di dati (ad esempio, per l'impostazione 5 mV, 33 mm = 2,5 mV). Il software ha la capacità di riproduzione delle registrazioni salvate per analisi future. Conversione di millimetro a uno mV o mV di ampiezza viene eseguita in un secondo momento l'analisi dei dati.
5. Dopo la sfoglia finale controllo positivo (ad esempio, record # 12) viene somministrato, le antenne sono rimossi, la forcella viene pulita con un etanolo saturo pulire e lasciati asciugare prima dell'uso successivo.
6. Per aumentare il throughput dei saggi, l'asportazione della prossima serie di antenne può essere avviato da un personale di laboratorio secondo circa 10 minuti prima della fine della sperimentazione in corso - dopo il quarto soffio, la seconda prova volatile l'esperimento in corso, come da tabella 2. Ciò consentirà for l'inizio del successivo esperimento direttamente dopo la fine dell'esperimento attuali.
7. Maggiore il numero di repliche (su antenne differente) possono essere eseguite su composti di interesse per fornire ulteriore validazione statistica.

4. Un esempio di analisi EAG di miscele o di altre matrici (Tabella 3)

1. Successivamente, i rapporti e dei volumi delle due miscele terziarie (3 componenti miscele) sono calcolati per fornire un esempio di combinazione di sostanze volatili scatenanti risposte EAG elevati (Tabella 4). I calcoli sono per alcuni rapporti di base, un rapporto 1:1:1 molare di α-humulene: 2-undecanone: 2-feniletanolo e quindi confrontando ad un rapporto seconda miscela di 1:2:4.
2. Utilizzando protocolli simili descritto in precedenza, le miscele vengono preparate e etichettati pipette Pasteur vengono caricati insieme con i necessari controlli positivi e negativi.
3. I campioni di volatili sono gonfiati attraverso antenne maschile e femminile e le risposte vengono misurate e loggatoun foglio di dati (Tabella 3).

5. Risultati rappresentativi

Per orangeworm ombelico femminile le impostazioni vengono utilizzati i seguenti: 2 sbuffi secondo, 10 volte seconda registrazione, 10 seconda finestra, e 5 di scala mV. Una flessione negativa è la risposta tipica, ma il valore assoluto viene registrato (ad esempio, -3400 mV deflessione viene registrato come 3400 mV). Una risposta relativamente debole della preparazione per il controllo positivo viene scartato. Figura 1 fornisce una rappresentazione grafica di una scarsa risposta al controllo positivo orangeworm ombelico.

Ad esempio di un risultato scarso controllo, la risposta media femmina antenne a acetofenone è tipicamente ca. 2600 mV (figura 2), se la preparazione solo ha dato una risposta di ca. 1300 mV si sarebbe essere scartato e un'altra coppia di antenne prepped. Allo stesso modo, la risposta media maschile (Z, Z) -11,13-hexadecadienal era Typically 3000 mV, quindi, qualsiasi risposta meno di 1.500 mV è stato scartato in genere.

Il controllo positivo all'inizio e alla fine di ciascun esperimento fornisce inoltre informazioni relative alla condizione delle antenne. Una regola pratica seguiamo per lo screening rapido è se la risposta antennale al soffio del post-controllo (record # 12, tabella 2) o è inferiore al 75% del 1 ^° soffio del pre-controllo (record # 1 , Tabella 2) o inferiore al 2 ^° soffio del pre-controllo (record # 2, Tabella 2) allora l'esperimento non viene utilizzato nell'analisi dei dati a causa di possibile degradazione del prep (Figura 3). Un esempio della prima regola del pollice sarebbe record # 1 = 2730 mV e record # 12 = 1680 mV, e la seconda regola del pollice se il record # 2 = 2350 mV e record # 12 = 1680 mV, In ciascuno di questi casi , i risultati dell'esperimento preparazione e sarebbero scartati.

Aesempio rappresentativo di correggere i valori di risposta EAG misurati al controllo positivo sarebbe il seguente.

Utilizzando i valori sopra indicati per uno = N 3 esperimento, la risposta controllo negativo è sottratto da tutti i valori all'interno di ciascun esperimento assumendo il controllo negativo è la risposta di base antennale al soffio meccanica e di solvente residuo.

I controlli positivi per ogni esperimento sarebbe quindi essere mediati e corretti a 1.000 mV, notando il rapporto per la correzione a 1.000 mV. Un foglio di dati (ad esempio, Excel) possono essere facilmente strumentalizzate per convertire le risposte ai dati utilizzabili.

Moltiplicando per il rapporto di correzione all'interno di ciascun esperimento, i valori di composto A e B composto vengono poi regolati.

Le medie (mezzi) per ciascun composto sono quindi determinate insieme ad altri dati statistici pertinenti e le risposte EAG per i composti testati possono essere valutatiper la candidatura per ulteriori indagini.

Figura 1. EAG Rappresentante per i maschi la risposta antennale (1.180 mV) al pre-controllo (1 sfoglia ^st controllo positivo) che verrebbero scartati a causa di una scarsa risposta antennale dopo aver assicurato le antenne hanno un buon contatto con il gel. Barre blu in Windows fondo rappresentano il soffio due secondi di volatile. Clicca qui per ingrandire la figura .

Trong> Figura 2. EAG Rappresentante per la risposta femminile antennale (3.400 mV) al 1 ^° sfoglia pre-controllo che dovrebbero essere considerati tali. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. EAG Rappresentante per la risposta femminile antennale (1.680 mV) per il controllo a posteriori (ultimo controllo positivo per ciascun esperimento) che potrebbero essere considerati poveri, e suggestivo delle antenne degradazione (<75% del 1 ^° pre-controllo o < 2 ^° puff valore di pre-controllo). Per questo esempio, il 1 ^° pre-controllo è stato puff 2730 mV e 2 ^° pre-controllo è stato puff 2350 mV. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 4. Rappresentante EAG per la risposta femminile antennale (3.800 mV) al soffio di una miscela candidato volatile e le misure successive la deformazione massima iniziale (3800 mV), la pendenza iniziale per tutta la durata soffio (0,3 mV = s/1.2 0.25 s / mV), e la pendenza per la durata rimanente sfoglia (1,6 mV s/1.9 = 0.84 s / mV). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. Piccola imbarcazione modificato contenente una matrice di campione e volatili associati per essere soffiato in A. transitella antenne.

Tabella 1. In sITU emissioni volatili di mandorle impareggiabile (2007) e le risposte EAG determinati da una configurazione diversa e meno sensibile nel programma Autospike.

Tabella 2. Esempio di un modulo per la registrazione delle risposte antennali maschili e femminili ai singoli componenti volatili.

Tabella 3. Esempio di un modulo per la registrazione delle risposte antennali maschili e femminili alle miscele volatili e / o bouquet.

Tabella 4. Esempi di preparazione di 10 mL di 5 mg / mL di soluzione per due diversi rapporti di miscele.

Tabella 5. Esempio di modulo per la registrazione due conseguenzesbuffi consecutivi di singoli componenti volatili attraverso antenne maschile e femminile.

Uso delle registrazioni electroantennogram come un saggio biologico per determinare le risposte chemorecezione di un insetto bersaglio è abbastanza comune e numerosi studi che utilizzano EAG come rivelatore per effluenti da un cromatogramma gas (GC-EAD) possono essere trovati nella letteratura. ^9,10 Il metodo illustrato fornirà uno screening rapido di quantità equivalenti di componenti volatili con le repliche di alta fiducia per l'assegnazione della relativa risposta. Il programma AutoSpike nel software Syntech è un buon programma di screening per sostanze volatili in quanto è in grado di fornire la massima deflessione del segnale dalle antenne (Figure 1-3), che qui presentiamo come valore "screening". Inoltre, altre informazioni di base per la semi-avanzato uso (vedi figura 4) può essere ottenuta con AutoSpike a seconda delle impostazioni di configurazione e ciò che il ricercatore vuole ricavare dalla risposta antennale. Il GcEAD o EagPro programmi Syntech sono appropriate per esperimenti più avanzati o per gli scienziati che hanno familiarità con le risposte elettrofisiologiche in quanto le tracce risultanti fornire maggiori dettagli del tempo-corso di risposta depolarizzazione antenne.

Prima del processo di screening dei composti rilevati da una pianta ospite, la corretta identificazione dei volatili è importante e dovrebbe seguire rigidi protocolli. Se possibile, due colonne GC di diversa polarità (cioè, DB-Wax e DB-1) deve essere utilizzato per l'identificazione componente iniziale tramite corrispondenza degli indici di ritenzione (RIS, vedi tabella 1). Il metodo migliore è di verificare l'identità di ciascun volatili con un autenticazione standard su due colonne. ¹¹ Se l'identità di alcuni dei composti non è possibile, delucidazione della loro bioattività può ancora essere raggiunto da un uso di GC-EAD. ¹² Tuttavia , la replica del biotest può essere limitata a seconda del metodo di raccolta volatile, la quantità dell'analita non sarà readily disponibile senza uno standard interno, l'identità del composto non sarà immediatamente noto, e successiva sperimentazione in miscele non sarebbe possibile.

Se correttamente sigillato e refrigerate, soluzioni di sostanze volatili in pentano in genere può essere conservato per circa 1 settimana. Se le pipette sigillate contenenti il ​​disco caricato sono collocati in una borsa chiusa e refrigerato possono essere conservati per circa 24 ore. Tuttavia, abbiamo trovato meglio per caricare i dischi del mattino delle analisi EAG e smaltire di pipette residuo alla fine della giornata. I dosaggi per gli sbuffi standardizzati deve essere determinato sperimentalmente per ogni specie di insetti se la letteratura relativa non è prontamente disponibile.

Formulazione di miscele è tipicamente un processo arduo. Qui sono alcuni approcci relativamente semplici, anche se non completo. I ricercatori sono incoraggiati a fare ulteriori approfondimenti per quanto riguarda varie tecniche. Dopo la valutazione dei singoli componenti responses da volatili di piante ospitanti è stata eseguita, gli studi di miscele possono essere intraprese. Un esempio utilizza le sostanze volatili che provochino le risposte relativi più elevati dallo screening. Altri esempi sono:. Combinazioni di relativi importi emessi, i rapporti di risposte relative contro relativi importi, ordinamento per classe di composti volatili, o le differenze nelle fasi fenologiche o stati diversi delle matrici (danneggiata vs danneggiato) ¹³

Le miscele sono dimostrati semplici combinazioni di questi diversi approcci. Il 01:01:01 è un misto terziario sulla base delle risposte relativamente alte in fase di screening iniziale, ma rappresenta anche diverse classi di composti. Humulene è un sesquiterpene, 2-undecanone è un prodotto di scarto di acido grasso, e 2-feniletanolo è un benzonoidi. Questi composti rappresentano le principali classi di composti volatili in genere visti in emissioni degli impianti. Il rapporto di 1:02:04 nella seconda miscela incorpora le relative proporzioni di volatili rilevati dul'anello analisi GC-MS. ⁴ Tuttavia, l'uso di SPME e GC-MS fornire solo relativi rapporti e l'uso di analisi GC-FID in combinazione con curve di calibrazione dei classi di composti è raccomandato per un punto di partenza più accurato per rapporti sulla base delle sostanze volatili rilevati.

L'elettrodo tecnica forcella EAG è uno dei metodi più semplici utilizzati nella sperimentazione elettrofisiologico ^14. Il lettore è invitato a compiere ulteriori ricerche letteratura per applicazioni avanzate di là di questo metodo. Inoltre, lo screening di matrici ex situ può essere eseguita utilizzando il metodo illustrato, ma utilizzando piccole (60 mL) navi modificati (Figura 5) contenenti parti vegetali (ad esempio, mandorle di terra). Quando si utilizzano contenitori più grandi (ad esempio, 120 mL vaso con coperchio, con speciali adattatori per l'uso con il puffer EAG) si raccomanda di aumentare la portata di garantire l'evacuazione corretta del contenitore. Un esperimento spallad essere eseguita quando un controllo positivo viene inserito nel contenitore per assicurare la corretta stimolazione avviene alla portata necessaria. L'uso di un soffio due secondi per i singoli componenti non è assolutamente necessario e sbuffi dell'ordine di 0,5 a 1,0 secondi sono più tipico. Tuttavia, non permettere più facili comparazioni future con sbuffi di container bouquets volatili da questi richiedono in genere un soffio più a portate superiori. I nostri laboratori utilizzano il soffio due secondi al fine di confrontare singolo componente e / o risposte si fondono direttamente sbuffi utilizzando matrici in piccoli vasi (vedi Figura 5). I due soffio secondo questi piccoli vasi assicura la completa evacuazione del contenitore quando la portata sia impostata.

Inoltre, l'acquisizione di una seconda inalazione può essere eseguita, tuttavia la seconda inalazione non è assolutamente necessaria per lo screening poiché la quantità del componente volatilizzato non è più mantenuto ad un livello rigoroso (<strong> Tabella 5). Tuttavia, queste informazioni possono essere utili per eventuali successivi esperimenti dose-risposta. ¹⁵ A risposta molto inferiore può indicare una minore risposta a concentrazioni più basse mentre una risposta consistente può indicare la dose è vicino alla soglia di una risposta elevata. Va osservato ci sono altre spiegazioni fisiologici per il cambiamento di risposte ¹⁴ alla seconda inalazione, ma l'informazione non contribuire guida per esperimenti futuri. Se ad alta velocità non è assolutamente critico, l'uso di una seconda inalazione di ciascun componente può essere informativo.

Se falene vergini femminili sono il campione mirato, NOW larve negli ultimi instar o pupe possono essere sessuato e segregati ¹⁶ per consentire emergere femminile che si verifichi in contenitori separati.

Regolazione della scala può essere necessario per accogliere la risposta antennale se supera la scala corrente. Le scale sul software EAG schermo can aiutare a determinare il numero di millimetri per la risposta mV. Altri insetti possono variare nella loro sensibilità.

Il metodo illustrato fornisce un facile da imparare, rapido, affidabile e high-throughput protocollo di screening per ridurre il numero di volatili a titolo oneroso bioattività dalla complessa composizione di elementi volatili pianta ospite. Purché il antenne del campione sono adatti, il metodo EAG forcella permette la valutazione rapida di numerosi componenti volatili o miscele di componenti, e confronto delle risposte a quella di uno standard. In definitiva, un saggio biologico che valuta l'attività del componente o miscela di componenti in un ambiente campo è il metodo più valido. Tuttavia, studi sul campo spesso sono molto tempo e manodopera, costoso, e richiedono più mesi per ottenere risultati adeguati.