Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

1. La preparación de compuestos volátiles detectados a partir de la planta huésped de EAG detección

1. Después de la identificación y autentificación de todas las sustancias volátiles a través de GC-MS, el análisis EAG bocanada de cada uno disponible volátil. La selección inicial puede ser un número duplicado bajo de respuestas antenales (N = 3-5) para cada sexo con el fin de lograr una indicación de chemoreceptivity relativa en un corto período de tiempo (Tabla 1).
2. Preparar una solución de cada volátil a un 5 mg / ml de concentración en pentano. Selle herméticamente y refrigerar la muestra hasta que esté listo para su uso inmediato (por ejemplo, acetofenona, densidad = 1,03 g / ml, volumen = (0,005 g/1.03 g / ml) x 1000 = 4,85 l de acetofenona en un matraz aforado de 1,0 ml y se diluye hasta 1,0 ml con pentano).
3. Justo antes de su análisis EAG, eliminar los viales que contienen el 5 mg / ml de concentración de los volátiles a ensayar y se deja calentar a temperatura ambiente. Mientras tanto, marcar el número apropiado de pipetas Pasteur decorrelacionan con cada volátil a ensayar, y envolver un pequeño trozo de parafina (ca. 15 x 15 mm) sobre la punta de la pipeta. Para las pipetas de detección iniciales de estímulo 10 (N = 4 para cada hombre y mujer) se cargan en el caso de una preparación mal o un obstáculo imprevisto otro.
4. Utilizando un par de pinzas, suavemente doblar el disco bioensayo en un medio para facilitar la colocación en la pipeta, a continuación, parcialmente colocar el disco doblado en el extremo grande de la pipeta para que ca. 2-3 mm del disco están expuestos. Alinear las pipetas marcadas y preparado en un soporte de estante.
5. Utilizando una pipeta o una jeringa, cargar 10 l (50 mg) de solución volátil en cada disco y permitir 2 minutos antes de pasar completamente la inserción de los discos en la pipeta. Una vez cargado, inmediatamente sellar el extremo de la pipeta con parafilm (ca. 15 x 30 mm). La cantidad de estímulos volátiles para ser cargados y sopló más probable es que varía con las especies de insectos.
6. Siguiendo el mismo protocolo que se ha indicado anteriormente, preparar los controles deincluir en cada análisis. Para la carga negativa de control de 10 l de pentano solo en cada disco, espere 2 minutos, cargar en la pipeta de la etiqueta y el sello. Para el control positivo, carga de 10 l (50 mg) en el disco, espere 2 minutos, la carga en la pipeta etiquetado y sellado con parafilm.
7. La viabilidad de la preparación de las antenas de insectos más probable es que varían según las especies, pero hemos encontrado que Amyelois transitella antenas suelen permanecer activa y constante por más de 30 minutos después de la escisión con el protocolo descrito. Esta cantidad de tiempo que generalmente se permiten hasta 4-10 muestras volátiles para ser evaluados. Tabla 2 proporciona un ejemplo de los tiempos y las secuencias.

2. Preparación de las antenas de los insectos para el bioensayo EAG

1. El objetivo de este experimento es el análisis de EAG, por lo que la suposición de que cada investigador tendrá acceso a los insectos criados adecuadamente.
2. Para este experimento vamos a estudiar 3-4 días old, se aparearon las polillas masculinas y femeninas. Polillas individuales se transfieren a un pequeño recipiente con tapa de plástico del día de análisis. Inmediatamente antes de la bioensayo, la polilla a ensayar se transfiere de cabeza en un aparato de sujeción (es decir, a partir de diversas puntas pipeteador de plástico) y asegurado por detrás. La manipulación de los insectos puede ser visto bajo un bajo consumo de energía estéreo-microscopio para facilitar la escisión.
3. Las antenas son objeto de burlas a cabo utilizando una herramienta de alambre en la punta. El titular de tenedor, con una pequeña película de gel de electrodo, se coloca en estrecha proximidad para la transferencia rápida de las antenas. La primera antena se extirpa el uso de tijeras micro y se coloca en el tenedor, asegurando la base de la antena se coloca en la porción no-rojo del tenedor (el electrodo de tierra indiferente). Un conjunto temporizador durante 10 minutos y se inicia la segunda antena se extirpa y se coloca al lado de la primera antena con ambas bases en el mismo lado del tenedor.
4. Alternativamente, las antenas pueden quedar asegurada dentro de la holdintubo g, extirpados, entonces suavemente retirado de entre el tubo y el insecto utilizando una herramienta con punta de alambre con una pequeña cantidad de gel en el extremo.
5. Antenas se comprueban para asegurar la base y la punta se sumergen en gel de electrodo y no hay burbujas están presentes en el gel. Los extremos y consejos pueden ser ajustados para garantizar la exposición total al gel para electrodos. Se debe tener cuidado para asegurar que el resto de cada antena no está cubierto con gel, garantizando así la máxima área de superficie antenal está expuesto a la calada.
6. El tenedor preparado se inserta en la sonda de pre-amplificador y se mantiene bajo un constante flujo de aire húmedo a 200 ml / min durante el tiempo restante del período de espera de 10 minutos. El tiempo especial y EAG veces iniciación se observó (Tabla 2) y 30 segundos antes de la primera bocanada de estímulo, la pipeta que contiene el control positivo está abierta y se coloca en el soporte que se ajusta para dirigir el aire / bocanada flujo 2-3 mm desde el preparado antenas.
7. Después de cada experperimento, las polillas de prueba son sacrificados en un ambiente de hielo seco y bien dispuestos.
8. Las polillas hembras se diseccionan para comprobar el estado de apareamiento. Los hombres que cohabitan se supone que se han apareado.

3. EAG Protocolo de componentes individuales

1. Respuestas antenales se registran a través del software incluido con AutoSpike el instrumento EAG Syntech. La configuración en la pestaña Propiedades AutoSpike para el canal con la sonda de EAG se ha fijado en una tasa de muestreo de 106,7, NO a la rectificación, y un filtro de 0 a 42 Hz. Por la ficha Filtro, el filtro de EAG está en ON y el punto de corte bajo se ajusta a 0,1 Hz.
2. Bocanadas de estímulo son de 1-2 segundos de duración. Un contador de tiempo establecido para un minuto se inicia después de cada bocanada.
3. La pipeta prueba volátil próximo está abierta y se coloca en el soporte. La secuencia de los volátiles de ensayo, aleatorizado entre ejecuta para asegurar que no compuestos de ensayo consistente seguir otra prueba volátil, es seguido a continuación (por ejemplo, Tabla 2) cuidadosamente allowing 1 minuto entre cada disparo.
4. Para facilitar la lectura de las respuestas EAG, las porciones de los gobernantes se colocan sobre la pantalla del ordenador y el nivel basal hasta el ápice de la señal de deflexión hacia abajo se mide en milímetros y se registra en una hoja de datos (es decir, para el ajuste mV 5, 33 mm = 2,5 mV). El software tiene la capacidad de reproducción de las grabaciones guardadas para su posterior análisis. La conversión de mm a cualquiera mV o amplitud mV se realiza en el análisis de datos más adelante.
5. Después de la bocanada final de control positivo (por ejemplo, el registro # 12) se administra, las antenas se retiran, el tenedor se limpia con una toallita de etanol saturado y se deja secar antes de su uso posterior.
6. Para aumentar el rendimiento de los ensayos, la escisión de la siguiente serie de antenas puede ser iniciado por un personal de laboratorio de segunda a unos 10 minutos antes del final del experimento actual - después de la cuarta de hojaldre, la segunda prueba volátil de la experiencia actual, según la tabla 2. Esto permitirá FOr el comienzo del experimento siguiente directamente después de los extremos experimento actual.
7. Mayor número de repeticiones (a antenas diferentes) puede realizarse en compuestos de interés para proporcionar una mayor validación estadística.

4. Un ejemplo de análisis de los EAG mezclas u otras matrices (Tabla 3)

1. A continuación, las proporciones y los volúmenes de dos mezclas terciarias (3-componente mezclas) se calcula para proporcionar un ejemplo de la combinación de compuestos volátiles que suscitan respuestas de alta EAG (Tabla 4). Los cálculos son para algunas relaciones básicas, una proporción 1:1:1 molar de α-humuleno: 2-undecanona: 2-feniletanol y luego comparar a una relación de mezcla de la segunda 1:02:04.
2. Utilizando protocolos similares se describió anteriormente, las mezclas se preparan y etiquetados pipetas Pasteur se cargan junto con los controles necesarios positivos y negativos.
3. Las muestras volátiles se inflan a través de antenas de los machos y hembras, y las respuestas se miden y haber iniciado sesióna una hoja de datos (Tabla 3).

5. Los resultados representativos

Para la naranja ombligo femenino las siguientes opciones se utilizan: 2 inhalaciones segundo, 10 veces segundo disco, 10 segundos de la ventana, y el 5 de escala de mV. Una desviación negativa es la respuesta típica, sin embargo, el valor absoluto se registra (por ejemplo, -3.400 deflexión mV se registra como 3.400 mV). Una respuesta relativamente débil de la preparación para el control positivo se descarta. Figura 1 proporciona una representación gráfica de una mala respuesta al control positivo por la naranja ombligo.

Por ejemplo de un resultado pobre control, la media de respuesta de las hembras antenal a acetofenona es típicamente ca. 2.600 mV (Figura 2), si la preparación sólo dio una respuesta de ca. 1.300 mV que se descarta y se prepara otro par de antenas. Del mismo modo, la respuesta media de los hombres de (Z, Z) -11,13-hexadecadienal era tipicay 3.000 mV, por lo que cualquier respuesta es inferior a 1.500 mV se descartó típicamente.

El control positivo al comienzo y al final de cada experimento también proporciona información relativa a la condición de las antenas. Una regla de oro se sigue para la detección rápida es si la respuesta antenal a la nube de la post-control (expediente n º 12, Tabla 2) es menor que el 75% del hojaldre 1 ^º de la pre-control (registro # 1 , Tabla 2) o menor que el hojaldre 2 ^ª de la pre-control (registro # 2, Tabla 2) a continuación, el experimento no se utiliza en el análisis de datos debido a la posible degradación de la preparación (Figura 3). Un ejemplo de la primera regla de oro sería el registro # 1 = 2.730 mV y el registro n º 12 = 1680 mV, y la segunda regla de oro si el registro n º 2 = 2.350 mV y el registro n º 12 = 1680 mV, en cada uno de estos casos , los resultados del PREP y el experimento se descarta.

Aejemplo representativo de la corrección de los valores de respuesta EAG medidos para el control positivo sería como sigue.

Utilizando los valores anteriores para un N = 3 experimento, la respuesta de control negativo se resta de cada valor dentro de cada experimento bajo el supuesto de que el control negativo es la respuesta basal antenal a la bocanada mecánica y el disolvente residual.

Los controles positivos para cada experimento a continuación se promediarán y corregido en 1000 mV, teniendo en cuenta la relación para la corrección de 1000 mV. Una hoja de datos (por ejemplo, Excel) puede ser fácilmente manipulado para convertir las respuestas a los datos utilizables.

Multiplicando por la relación de corrección dentro de cada experimento, los valores para el compuesto A y el compuesto B se ajusta entonces.

Los promedios (medias) para cada compuesto se determina a continuación junto con otros datos estadísticos pertinentes y las respuestas EAG para los compuestos ensayados, a continuación, se puede evaluara la candidatura para una mayor investigación.

Figura 1. EAG Representante para la respuesta masculina antenal (1180 mV) a la pre-control (1 ^º de hojaldre control positivo) que se descarta debido a la respuesta antenal pobres después de asegurarse de las antenas tienen un buen contacto con el gel. Las barras azules en las ventanas de la parte inferior representan la hojaldre dos segundos de la volatilidad. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

ª bocanada de pre-control que se considere apropiada. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3. EAG Representante para la respuesta de las hembras antenal (1680 mV) para el control a posteriori (último control positivo para cada experimento) que se considera pobre, y sugerente de las antenas de la degradación (<75% del ¹ de pre-control o < 2 ^º valor bocanada de pre-control). Para este ejemplo, el 1 ^º de pre-control de hojaldre era 2.730 mV y 2 ^º de pre-control de hojaldre era 2350 mV. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4. Representante EAG para la respuesta de las hembras antenal (3800 mV) a la nube de una mezcla volátil y candidato a las mediciones sucesivas de la desviación máxima inicial (3800 mV), la pendiente inicial, durante la duración de hojaldre (0,3 mV = s/1.2 0,25 s / mV), y la pendiente de la duración restante de hojaldre (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 5. Pequeño vaso modificado que contiene una matriz de muestra y los volátiles asociados a ser inflado a través de A. transitella antenas.

Tabla 1. En sUIT volátiles de emisiones de almendras sin par (2007) y las respuestas EAG determinados por una configuración diferente y menos sensibles en el programa Autospike.

Tabla 2. Ejemplo de un formulario para el registro de las respuestas antenales hombres y mujeres a los distintos componentes volátiles.

Tabla 3. Ejemplo de un formulario para el registro de las respuestas de las antenas de ambos sexos a las mezclas volátiles y / o ramos de flores.

Tabla 4. Ejemplos de preparación de 10 ml de una dosis de 5 mg / ml de solución para dos diferentes proporciones de las mezclas.

Tabla 5. Ejemplo de formulario para registrar dos consecuenciascutivo inhalaciones individuales de los componentes volátiles a través de antenas de los machos y hembras.

El uso de grabaciones electroantenograma como un bioensayo para determinar las respuestas Quimiorecepción de un insecto objetivo es bastante común y numerosos estudios que utilizan GAE como un detector para el efluente de un cromatograma de gases (GC-EAD) se pueden encontrar en la literatura. ^9,10 El método demostró proporcionará una detección rápida de cantidades equivalentes de los componentes volátiles con repeticiones altas para la asignación de confianza de la capacidad de respuesta relativa. El programa AutoSpike en el software Syntech es un buen programa para los volátiles de cribado, ya que es capaz de proporcionar la señal de deflexión máxima amplitud de las antenas (Figuras 1-3), que se presenta aquí como el "screening" valor. Además, otro tipo de información básica para la semi-avanzado de uso (ver Figura 4) se puede obtener con AutoSpike dependiendo de los ajustes de configuración y lo que el investigador quiere obtener de la respuesta antenal. El GcEAD o programas de aplicación son EagPro Syntechropriate para los experimentos más avanzados o para científicos familiarizados con las respuestas electrofisiológicas ya que las trazas resultantes proporcionan un mayor detalle del curso de tiempo de respuesta de la despolarización de la antena.

Antes del proceso de selección de los compuestos detectados a partir de una planta huésped, la correcta identificación de los compuestos volátiles es importante y debe seguir protocolos estrictos. Si es posible, dos columnas de GC de diferentes polaridad (es decir, DB-Wax y DB-1) debe ser utilizado para la identificación de componentes inicial a través de juego de los índices de retención (IR, ver Tabla 1). El mejor método es para verificar la identidad de cada volátil con un autenticar estándar en dos columnas. ¹¹ Si la identidad de algunos de los compuestos no es posible, la elucidación de su bioactividad todavía puede lograrse mediante un uso de GC-EAD. ¹² Sin embargo , la replicación del bioensayo puede ser limitado en función del método de recogida volátil, la cantidad del analito no será razónDily disponible sin un patrón interno, la identidad del compuesto no será inmediatamente conocido, y las pruebas posteriores en las mezclas no sería posible.

Si bien sellado y refrigerado, las soluciones de los volátiles en pentano típicamente puede ser almacenado durante aproximadamente 1 semana. Si las pipetas sellados que contienen el disco cargado se coloca en una bolsa con cierre y refrigerado se pueden almacenar durante aproximadamente 24 horas. Sin embargo, encontramos que lo mejor es cargar los discos de la mañana de los análisis de EAG y deshacerse de las pipetas de los restos al final del día. Las dosis para las ráfagas de viento estandarizados debe determinarse experimentalmente para cada especie de insecto si la literatura se refiere no es fácilmente disponible.

Formulación de mezclas es típicamente un proceso arduo. Aquí se presentan algunos métodos relativamente simples, aunque no completa. Los investigadores se les anima a hacer la lectura más en relación con diversas técnicas. Después de la evaluación de los componentes individuales RESPONSES de los volátiles de plantas huéspedes se ha realizado, los estudios de las mezclas puede llevarse a cabo. Un ejemplo es el uso de los compuestos volátiles que suscitan las respuestas más altas en relación a la proyección. Otros ejemplos son los siguientes:. Combinaciones de cantidades relativas emitidos, las tasas de respuesta relativos en comparación con las cantidades relativas, clasificación por clase de compuestos volátiles, o diferencias en los estados fenológicos o estados diferentes de las matrices (daños contra daños) ¹³

Las mezclas se manifestaron son simples combinaciones de estos diferentes enfoques. El 01:01:01 es una mezcla terciaria sobre la base de las respuestas relativas altas en el examen inicial, sino que también representa diferentes clases de compuestos. Humuleno es un sesquiterpeno, 2-undecanona es un producto de ácido graso descomposición, y 2-feniletanol es una bencenoide. Estos compuestos representan las principales clases de compuestos volátiles se observa típicamente en las emisiones de las plantas. La relación de 01:02:04 en la segunda mezcla incorpora las proporciones relativas de los volátiles detectados dusonar el análisis por GC-MS. ⁴ Sin embargo, el uso de SPME y GC-MS proporcionar solamente proporciones relativas y el uso de GC-FID análisis en conjunción con curvas de calibración de las clases de compuestos se recomienda para un punto más exacto de partida para las proporciones basado en compuestos volátiles detectados.

El electrodo de tenedor técnica de GEA es uno de los métodos más simples empleadas en la experimentación electrofisiológica. ¹⁴ Se anima al lector para llevar a cabo investigación de la literatura más para aplicaciones avanzadas más allá de este método. Además, la proyección de las matrices de ex situ puede realizarse utilizando el método demostrado, pero la utilización de las pequeñas (60 ml) los buques modificados (Figura 5) que contienen partes de la planta (por ejemplo, almendras molidas). Cuando se utiliza contenedores más grandes (por ejemplo, 120 ml recipiente con tapa con adaptadores especiales para su uso con el globo GAE) se recomienda para aumentar la velocidad de flujo para asegurar una correcta evacuación del recipiente. Un experimento de hombrod se lleva a cabo donde un control positivo se coloca en el recipiente para asegurar la adecuada estimulación se logra en el caudal necesario. El uso de una bocanada dos segundos para los componentes individuales no es absolutamente necesario y bocanadas del orden de 0,5 a 1,0 segundos son más típicas. Sin embargo, sí permite para facilitar las comparaciones en el futuro con bocanadas de ramos de flores en contenedores volátiles, ya que éstos suelen requerir una bocanada más tiempo en las tasas de flujo más altas. Nuestros laboratorios utilizan el soplo de dos segundos a fin de comparar un solo componente y / o mezcla de las respuestas directamente a bocanadas con matrices en vasos pequeños (ver Figura 5). La bocanada dos segundos en estos pequeños vasos asegura una evacuación completa del recipiente cuando el caudal sea el adecuado.

Además, la adquisición de una segunda bocanada puede llevarse a cabo, sin embargo la segunda bocanada no es absolutamente necesario para el cribado ya que la cantidad del componente volatilizado ya no se mantiene a una norma estricta (<strong> Cuadro 5). Sin embargo, esta información puede ser valiosa para los posteriores experimentos de dosis-respuesta. ¹⁵ Una respuesta mucho más bajo puede indicar una disminución de la respuesta a concentraciones más bajas, mientras que una respuesta coherente puede indicar la dosis es de cerca del umbral para una respuesta de alta. Cabe señalar que hay otras explicaciones fisiológicas para el cambio en las respuestas ¹⁴ a la segunda bocanada, pero la información no ayudar en la orientación para futuros experimentos. Si alto rendimiento no es absolutamente crítico, el uso de una segunda bocanada de cada componente puede ser informativo.

Si las polillas hembras vírgenes son la muestra dirigida, AHORA larvas en el último estadio o pupas pueden ser sexados y separados ¹⁶ para permitir la emergencia de las mujeres que se producen en contenedores separados.

El ajuste de la escala puede ser necesario para acomodar la respuesta antenal si excede la escala actual. Las escalas en las Directrices de software CA pantallan ayudar a determinar cuántos milímetros por respuesta mV. Otros insectos que pueden variar en su sensibilidad.

El método demostró proporciona una forma fácil de aprender, rápida, fiable y de alto rendimiento del protocolo de detección para reducir el número de sustancias volátiles a la consideración de la bioactividad de la compleja composición de los volátiles de las plantas hospederas. Siempre que la antena de la muestra son adecuados, el método GAE tenedor permite la evaluación rápida de numerosos componentes volátiles o mezclas de los componentes, y la comparación de las respuestas a la de un estándar. En última instancia, un bioensayo que evalúa la actividad del componente o mezcla de componentes en una configuración de campo es el método más válido. Sin embargo, los estudios de campo a menudo son muy tiempo y trabajo, costoso, y requiere varios meses para obtener resultados adecuados.