Electroantennographic биопроб в качестве скринингового инструмента для летучих растения-хозяина

1. Подготовка Летучие обнаружен с растением-хозяином для скрининга ЕАГ

1. После соответствующей идентификации и аутентификации всех летучих веществ с помощью GC-MS, выполнить ЕАГ слоеного анализ каждого из доступных нестабильной. Первоначальная проверка может быть небольшое количество повторных усиков ответов (N = 3-5) для каждого пола, чтобы добиться указания относительного chemoreceptivity в короткий промежуток времени (табл. 1).
2. Приготовьте раствор каждого летучего на 5 мг / мл, концентрация пентана. Плотно запечатать и поставить в холодильник образца до готовности к немедленному использованию (например, ацетофенон, плотность = 1,03 г / мл, объем = (0,005 g/1.03 г / мл) х 1000 = 4,85 мкл ацетофенона в колбу 1,0 мл объемный и развести на 1,0 мл с пентана).
3. Незадолго до ЕАГ анализ, удалить флаконах, содержащих по 5 мг / мл, концентрация летучих быть проверены и позволяют нагреться до комнатной температуры. Между тем, маркировать нужное количество пипетки Пастера вкоррелируют друг с летучими быть проверены, и завернуть кусочек парафильмом (около 15 × 15 мм) на кончике пипетки. Для первоначальной проверки 10 пипетки стимул (N = 4 для каждого мужчины и женщины) будут загружены в случае плохой подготовительной или других непредвиденных препятствий.
4. С помощью пинцета аккуратно сложить биопроб диска в два раза для облегчения размещения в пипетку, а затем частично поместите сложенную диск в большой конец пипетки, так что ок. 2-3 мм диска подвергаются. Совместите маркировку и нацелен пипетки в стойку держателя.
5. С помощью пипетки или шприца, нагрузка 10 мкл (50 мкг) летучих решение на каждом диске и позволяет 2 минуты, чтобы пройти, прежде чем полностью вставки диска в пипетку. После загрузки сразу запечатать конец пипетки с парафильмом (около 15 × 30 мм). Количество летучих стимул должен быть загружен и пыхтел, скорее всего, меняться в зависимости от вида насекомых.
6. Следуя той же протокол отмечалось выше подготовить элементы управлениявключать в каждый анализ. Для отрицательного контроля нагрузки 10 мкл только пентан на каждый диск, подождать 2 минуты, загрузить в пипетка помечены, и печатью. Для положительного контроля, нагрузка 10 мкл (50 мкг) на диск, подождать 2 минуты, нагрузка на меченые пипетки, а печать с парафильмом.
7. Жизнеспособность насекомых усиков приготовительный, скорее всего, меняться в зависимости от вида, но мы обнаружили, что Amyelois transitella антенны обычно остаются активными и последовательными в течение> 30 минут после удаления использованием описанного протокола. Это время обычно позволяют до 4-10 летучих образцов для оценки. В таблице 2 приведен пример раза и последовательности.

2. Подготовка насекомых Антенны для ЕАГ биопроб

1. В центре внимания этого эксперимента ЕАГ анализ, таким образом, предположение о том, что каждый исследователь будет иметь доступ к надлежащим воспитал насекомых.
2. Для этого эксперимента мы будем изучать 3-4 дня олг, вязка мужского и женского моли. Индивидуальные моли переданы в небольшой крышкой, пластиковый контейнер в день анализа. Непосредственно перед биопроб, моли быть проверены передается головой в проведении аппарата (например, из различных пластиковыми наконечниками пипетки) и обеспеченные сзади. Манипуляции с насекомыми можно рассматривать под маломощным стерео микроскоп для облегчения удаления.
3. Антенны дразнят с использованием проволоки наконечником инструмента. Вилка держатель, с небольшой фильм электродов гелем, находится в непосредственной близости для быстрой передачи антенны. Первая антенна вырезали ножницами с использованием микро и размещены на вилку, обеспечение основании антенны находится на не-красной части вилки (индифферентный электрод заземления). Таймер набор на 10 минут запущен и второй антенны вырезали и помещали рядом с первой антенны с обеих баз на той же стороне вилки.
4. Кроме того, антенна может быть оставлен в обеспеченных holdinг трубы, вырезают, затем осторожно удалить из между трубой и насекомых с помощью провода наконечником инструмента прикосновение геля на конце.
5. Антенны проверяются для обеспечения базы и кончик погружаются в гель и электрод не пузырьки находятся в геле. Концы / советы могут быть сокращены, чтобы гарантировать полное воздействие электрода гелем. Следует соблюдать осторожность, чтобы оставшаяся часть каждой антенны не покрыты гелем, таким образом гарантируя максимальную усиков поверхность подвергается затянуться.
6. Нацелен вилкой затем вставляется зонд предварительного усилителя и находится под постоянным потоком увлажненного воздуха в 200 мл / мин в течение оставшегося времени в 10 минут ожидания. Акцизный времени и ЕАГ начала времен отмечалось (табл. 2) и 30 секунд до первой затяжки стимул, пипетки, содержащий положительную управления распечатаны и размещены в держателе, который регулируется, чтобы направить воздух / слоеного поток 2-3 мм от Антенны нацелен.
7. После каждого экспериментаiment, тест моли эвтаназии в сухом месте лед и правильно утилизировать.
8. Женский моли расчлененный проверить брачного статуса. Сожителем, мужчины, как предполагается, что вязка.

3. ЕАГ протокола для отдельных компонентов

1. Усиков ответы записываются через AutoSpike программного обеспечения, входящего в прибор ЕАГ Syntech. Конфигурация на вкладке Свойства AutoSpike для канала с зондом ЕАГ установлен на частоту дискретизации 106,7, NO исправить, и фильтр 0-42 Гц. Для вкладку Фильтр, фильтр ЕАГ включена и низкого среза установлен 0,1 Гц.
2. Стимул клубы 1-2 секунд. Таймер установлен для 1 минуты начинается после каждой затяжке.
3. Следующий тест летучих пипетки распечатаны и размещены в держатель. Последовательность испытаний летучих веществ, рандомизированных между работает чтобы убедиться в отсутствии исследуемых соединений последовательно следуют один тест летучих, затем следует (например, таблица 2) тщательно allowiнг 1 минуты между затяжками.
4. Для упрощения чтения ЕАГ ответы, часть правителей размещаются на экране компьютера и базового уровня до вершины вниз сигнал отклонения измеряется в мм и вошел в лист данных (например, для настройки 5 мВ, 33 мм = 2,5 мВ). Программное обеспечение имеет возможность воспроизведения сохраненных записей для последующего анализа. Преобразование мм или мВ или мкВ амплитудой осуществляется в последующего анализа данных.
5. После окончательного положительного слоеного управления (например, запись № 12) находится в ведении, антенны будут удалены, вилки очищается этанола насыщенных вытереть и дать высохнуть до последующего использования.
6. Для увеличения пропускной способности тестов, удаление следующий набор антенн может быть запущен второй лаборатории, примерно за 10 минут до конца текущего эксперимента - после четвертого слоеное, второй тест летучих текущего эксперимента, согласно таблицы 2. Это позволит лг начала следующего эксперимента сразу после завершения текущего эксперимента.
7. Большее число повторений (на разных антенн) могут быть выполнены на соединениях интерес предоставить дополнительную статистическую проверку.

4. Пример ЕАГ Анализ смеси или другие матрицы (табл. 3)

1. Далее, соотношения и объемы двух третичных смеси (3-смесей) рассчитываются привести пример объединения летучих вызывая высокий ответы ЕАГ (табл. 4). Расчеты за основные коэффициенты, 1:01:01 молярное соотношение α-humulene: 2-undecanone: 2-фенилэтанола и по сравнению с вторым соотношение смесь 1:02:04.
2. Используя аналогичные протоколы, описанные выше, смеси готовы и маркированы Пастера Пипетки загружаются вместе с необходимыми положительный и отрицательный контроль.
3. Летучих образцов пыхтел по мужской и женской антенн и ответы измеряются и регистрируются нана лист данных (табл. 3).

5. Представитель Результаты

Для женщин orangeworm пупка Следующие параметры используются: 2 секунды затяжек, 10 секунд записи, 10-секундный окна, и 5 мВ масштабе. Отрицательное отклонение является типичным ответом, но абсолютное значение фиксируется (например, -3400 мкВ отклонение регистрируется как 3400 мкВ). Относительно слабая реакция на подготовительной к положительному контролю отбрасывается. На рисунке 1 представлена ​​графическим представлением плохой ответ на положительный контроль пупка orangeworm.

Например, в результате плохой контроль, средняя женщина усиков ответ на ацетофенон, как правило, ок. 2600 мкВ (рис. 2), если подготовительные только дал ответ ок. 1300 мкВ он будет отброшен, а другая пара антенн нацелен. Кроме того, средний мужской ответ на (Z, Z) -11,13-hexadecadienal был typicallу 3000 мкВ, таким образом, любой ответ менее 1500 мкВ был обычно отбрасываются.

Положительный контроль в начале и конце каждого эксперимента также предоставляет информацию о состоянии антенны. Правило следовать для быстрого скрининга, если усиков ответ на слоеном пост-контроль (отчет № 12, таблица 2) либо менее 75% от ^1-го слоеного предварительного контроля (запись № 1 , таблица 2) или меньше, чем ^2-й слоеного предварительного контроля (запись № 2, таблица 2), то эксперимент не используется в анализе данных из-за возможного ухудшения приготовительный (рис. 3). Примером первого правило будет запись # 1 = 2730 мкВ и запись # 12 = 1680 мкВ, а второе правило: если запись # 2 = 2350 мкВ и запись # 12 = 1680 мкВ, в каждом из этих случаев , подготовительные и эксперимента результаты будут отброшены.

типичный пример исправления ЕАГ значений ответ, как измеряется с положительным контролем будет выглядеть следующим образом.

Используя значения выше для N = 3 эксперимент, отрицательный ответ контроль вычитается из всех значений в каждом эксперименте при условии отрицательного контроля является базовой антенны ответ на механическое слоеного и остаточного растворителя.

Положительного контроля для каждого эксперимента будут затем усредняются и исправлены до 1000 мкВ, отметив, что коэффициент для коррекции до 1000 мкВ. Лист данных (например, Excel) можно легко манипулировать для преобразования ответов на полезные данные.

Умножая на поправочный коэффициент в каждом эксперименте значения для соединения и соединения B корректируется.

Средние (средств) для каждого соединения, затем определяется наряду с другими соответствующими статистическими данными и ЕАГ ответы соединений испытания могут быть оцененыкандидатуры для дальнейшего расследования.

Рисунок 1. Представитель ЕАГ для мужчин усиков ответ (1180 мкВ) для предварительного управления ^(1-й положительный слоеного контроля), которые будут отброшены из-за плохого усиков ответ после обеспечения антенны имеют хороший контакт с гелем. Синий бар в нижней окна представляют собой два вторых слоеного летучих. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Чонг> Рисунок 2. представитель ЕАГ для женских усиков ответ (3400 мкВ) на ^1-й слоеного предварительного управления, которое будет сочтено необходимым. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3. Представитель ЕАГ для женских усиков ответ (1680 мкВ) на пост-контроль (последний положительный контроль для каждого эксперимента), которые будут рассматриваться бедных, и указывающие на ухудшение антенны (<75% от ^1-го предварительного управления или < ^2-й слоеного значение предварительного контроля). В данном примере ^1-го предварительного управления слоеного был 2730 мкВ и ^2-го предварительного управления слоеного был 2350 мкВ. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

dflinebreak ">
Рисунок 4. Представитель ЕАГ для женских усиков ответ (3800 мкВ) в слоеном кандидата летучие смеси и последующего измерения максимального начального отклонения (3800 мкВ), начальный наклон в слоеном продолжительность (0,3 мВ = s/1.2 0,25 сек / мВ), а наклон течение всего оставшегося времени слоеного (1.6 мВ s/1.9 = 0,84 с / мВ). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 5. Малый изменение сосуд матрицы образца и связанные с летучими быть пыхтел через А. transitella антенны.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
Таблица 1. В месте летучих выбросов несравненный миндаль (2007) и ЕАГ ответов определяется другой, менее чувствительны конфигурации в Autospike программы.

Таблица 2. Пример формы для записи мужских и женских усиков ответы на отдельные летучие компоненты.

Таблица 3. Пример формы для записи мужских и женских усиков ответы на летучие смеси и / или букеты.

Таблица 4. Примеры подготовки 10 мл 5 мг / мл раствора для двух различных соотношениях смеси.

Таблица 5. Пример формы для записи двух последовательных затяжек одного летучих компонентов между мужским и женским антенны.

Использование electroantennogram записи как биопробы, чтобы определить хеморецепции ответы целевой насекомых является довольно распространенным и многочисленных исследований с использованием ЕАГ в качестве детектора для стоков из газовой хроматограмме (GC-EAD) можно найти в литературе. ^9,10 метод показал обеспечит быстрое обследование эквивалентных количеств летучих компонентов с высокой репликаций для уверенного назначения относительно реагирования. AutoSpike программы в программу Syntech это хорошая программа для отбора летучих, поскольку она способна обеспечить максимальную амплитуду сигнала отклонения от антенны (рис. 1-3), который мы представляем здесь, как "отбор" значение. Кроме того, другой основной информацией для полу-опытных пользователей (см. Рисунок 4) можно получить с AutoSpike в зависимости от конфигурации и то, что исследователь хочет получить от усиков ответ. GcEAD или EagPro Syntech программы приложенияropriate для более сложных экспериментов или для ученых знакомы с электрофизиологические ответы, так как результирующая следы обеспечивают более подробно по времени ход усиков реакция деполяризации.

До скрининга соединений обнаружен растения-хозяина, правильное определение летучих веществ является важной и должна следовать строгим протоколов. Если возможно, две колонны GC различной полярности (например, DB-Wax и DB-1) должна быть использована для первоначальной идентификации компонентов через сопоставление индексов удерживания (RIS см. Таблицу 1). Лучший метод для проверки личности каждого летучих с аутентификации стандартного на двух колонках. ¹¹ Если личность некоторых из соединений не представляется возможным, выяснение их биологическую активность все еще ​​может быть достигнуто за счет использования GC-EAD ^12. Однако , репликация биопробы может быть ограничено в зависимости от летучих метод сбора, количество аналита не будет REAdily доступны без внутреннего стандарта, личность соединение не будет сразу известно, и последующее тестирование в смеси не было бы возможным.

Если запечатан должным образом, и охлажденным, решения летучих веществ в пентан как правило, может храниться в течение 1 недели. Если запечатанные пипец содержащие загруженного диска находятся в молнии сумки и охлажденным они могут храниться в течение 24 часов. Однако мы обнаружили, что лучше, чтобы загрузить диски утром ЕАГ анализов и правильно распоряжаться оставшейся пипец в конце дня. Дозы для стандартизированных клубы должны быть определены экспериментально для каждого вида насекомых, если соответствующие литературе не имеется.

Формулировка смесей, как правило, трудный процесс. Здесь показаны некоторые сравнительно простые подходы, хотя и не исчерпывающим. Исследователи рекомендуется делать дальше чтения по различным методам. После оценки отдельных компонентов отвх годов из летучих растения-хозяина была выполнена, исследования смесей могут быть предприняты. Одним из примеров является использование летучих вызывая более высокие относительные ответы от скрининга. Другие примеры:. Комбинации, относительное количество излучаемого, коэффициенты относительной ответов по сравнению относительных количествах, сортировка по классу соединений, или летучие различия в фенологических стадий или различные состояния матрицы (повреждения по сравнению с неповрежденным) ¹³

Смесей показали простые комбинации этих различных подходов. 1:01:01 является третичным смесь на основе относительно высоких ответы на первоначальный отбор, но и представляет собой различные классы соединений. Humulene является сесквитерпеновые, 2-undecanone является жирных продуктов распад кислоты и 2-фенилэтанола является бензеноидных. Эти соединения представляют собой основные классы летучих как правило, рассматривается в растительных веществ. 1:02:04 отношения во второй смесь включает в себя относительно соотношения летучих обнаружены дюпозвонить в GC-MS анализ ^4. Тем не менее, использование SPME и GC-MS обеспечивают только относительно соотношения и использования GC-FID анализа в сочетании с калибровочные кривые из классов соединений, рекомендуется для более точной отправной точки для отношения на основе летучих веществ обнаружено.

ЕАГ вилкой электрода техники является одним из наиболее простых методов, используемых в электрофизиологических экспериментов. ¹⁴ Читателю предлагается выполнять дальнейшие исследования литературы для современных приложений за этим методом. Кроме того, проверка ex-situ матрицы могут быть выполнены с использованием метода показала, но использование небольшого (60 мл) изменение сосудов (рис. 5), содержащих части растений (например, молотый миндаль). При использовании больших емкостей (например, 120 мл с крышкой судно со специальными адаптерами для использования с ЕАГ паровоз), рекомендуется увеличить скорость потока, чтобы обеспечить надлежащее эвакуации контейнеров. Эксперимент Shoulг, где проводится положительного контроля помещается в контейнер для обеспечения надлежащего стимулирования достигается необходимый расход. Использование двух секунд слоеного для отдельных компонентов не является абсолютно необходимым и клубы порядка 0,5 до 1,0 секунд, более типичны. Тем не менее, она позволяет легче будущих сравнений с клубами контейнерных летучих букеты, так как эти обычно требуют больше слоеного на более высоких скоростях потока. Наши лаборатории используют два вторых слоеного для сравнения одного компонента и / или смеси ответы непосредственно затяжек с помощью матриц в мелких сосудах (см. Рисунок 5). Два вторых слоеного на этих мелких сосудов обеспечивает полную эвакуацию контейнера при соответствующей скорости потока установлен.

Кроме того, приобретение второго слоеного может быть выполнена, однако второй слоеного не является абсолютно необходимым для скрининга, так как количество компонент испаряется больше не поддерживается на строгий стандарт (<сильный> табл. 5). Тем не менее, эта информация может быть ценной для любого последующего доза-реакция экспериментов ^15. Значительно ниже ответ может указывать на уменьшение ответ на более низкие концентрации в то время как последовательный ответ может указывать на дозу вблизи порога высокий отклик. Следует отметить, имеются другие физиологические объяснения изменений в ответах ^{от 14} до второй затяжки, но информация не помочь в руководстве для будущих экспериментов. Если высокую пропускную способность не является абсолютно критическим, использование второго дуновения каждый компонент может быть информативной.

Если девственная женщина Бабочки целевой образца, сейчас личинок последнего возраста или куколки может быть сексуальны и отделены ^{от 16} до позволить женщина появление происходит в отдельных контейнерах.

Регулировка масштаба могут быть необходимы для размещения антенн ответ, если он превышает текущий масштаб. Весы на программное обеспечение ЕАГ экрана околоя помочь в определении того, сколько мм в ответ мкВ. Другие насекомые могут различаться по своей чувствительности.

Метод показал обеспечивает простую в освоении, быстрый, надежный и высокопроизводительного скрининга протокола о сокращении количества летучих веществ на биологическую активность внимание со стороны сложного состава летучих веществ растения-хозяина. При условии, что антенны образца подходит, метод вилки ЕАГ позволяет быстро оценить многочисленные летучие компоненты или смеси компонентов, а также сравнение ответов, что и стандартные. В конечном счете, биопроб, который оценивает деятельность компонент или сочетание компонентов в полевых условиях является наиболее действенный метод. Тем не менее, полевых исследований, часто очень много времени и трудоемкий, дорогостоящий и требует нескольких месяцев, чтобы получить правильный результат.