Electroantennographic bioassay som et screeningverktøy for vertsplanten flyktige

1. Utarbeidelse av flyktige Detected fra vertsplanten for EAG Screening

1. Etter hensiktsmessig identifisering og autentisering av alle flyktige via GC-MS, utføre EAG puff analyse av hver tilgjengelig flyktig. Innledende screening kan være en lav replikere rekke antennal svar (N = 3-5) for hvert kjønn for å oppnå en indikasjon på relativ chemoreceptivity i løpet av kort tid (tabell 1).
2. Forbered en løsning av hvert flyktig på en 5 mg / ml konsentrasjon i pentan. Tett forsegle og avkjøl prøven til den er klar for umiddelbar bruk (f.eks acetophenone, tetthet = 1,03 g / ml, volum = (0.005 g/1.03 g / ml) × 1000 = 4,85 mL av acetophenone inn en 1,0 mL målekolbe og fortynn til 1,0 ml med pentan).
3. Like før EAG analyse, fjerne hetteglass som inneholder 5 mg / ml konsentrasjon av flyktige å bli testet og la varmes opp til romtemperatur. I mellomtiden merke riktig antall Pasteurs pipetter tilkorrelerer med hver flyktig som skal testes, og vikle et lite stykke Parafilm (ca. 15 × 15 mm) over tuppen av pipetten. For de innledende screening 10 tiltakspakker pipetter (N = 4 for hver mannlige og kvinnelige) er lagt i tilfelle av en dårlig prep eller annen uforutsett hindring.
4. Ved hjelp av en pinsett, forsiktig brett bioassay platen i to for å lette plassering i pipetten, så delvis plassere foldede platen i den store enden av pipetten slik at ca. 2-3 mm av platen er utsatt. Juster merkede og preparerte pipetter i et stativ holder.
5. Bruke en pipettor eller sprøyte, laste 10 mL (50 mikrogram) av flyktige løsning på hver plate og la 2 minutter å gå før helt inn plater i pipetten. Når lastet, umiddelbart forsegle slutten av pipetten med Parafilm (ca. 15 × 30 mm). Mengden av flyktige stimulans å lastes inn og blåste vil mest sannsynlig variere med insekter arter.
6. Etter den samme protokollen nevnt ovenfor forberede kontrollerinkludere i hver analyse. For den negative kontrollen last 10 mL av bare pentan på hver plate, vent 2 minutter, laste inn i merket pipetten, og sel. For den positive kontrollen, legger 10 mL (50 mikrogram) på platen, vent 2 minutter, last inn den merkede pipetten, og sel med Parafilm.
7. Levedyktigheten av insekt antennal prep vil mest sannsynlig variere med art, men vi har funnet ut at Amyelois transitella antennene vanligvis holde seg aktiv og konsekvent for> 30 minutter etter excision med den beskrevne protokollen. Denne tiden vil generelt tillate opptil 4-10 flyktige prøver å bli evaluert. Tabell 2 gir et eksempel på tider og sekvenser.

2. Utarbeidelse av Insekt antenner for EAG bioassay

1. Fokus for dette eksperimentet er EAG analyse, derfor antagelsen om at hver etterforsker vil ha tilgang til riktig ekstensiv oppfôring insekter.
2. For dette eksperimentet skal vi studere 3-4 dager old, parret mannlige og kvinnelige møll. Individuelle møll blir overført til en liten, lokk, plast beholder den dagen analysen. Umiddelbart før bioassay, er møll som skal testes overføres hodet først inn i et holdingselskap apparat (dvs. laget av ulike plast pipettor tips) og sikret bakfra. Manipulering av insektet kan sees under en lav-effekt stereo-mikroskop for å lette excision.
3. Antennene er ertet ut ved hjelp av en wire-tipped verktøy. Gaffelen holder, med en liten film av elektrode gel, er plassert i umiddelbar nærhet for rask overføring av antenner. Den første antennen er excised bruker mikro saks og plassert på gaffelen, slik at bunnen av antennen er plassert på ikke-røde delen av gaffelen (den likegyldige jordelektroden). En timer sett i 10 minutter er startet og den andre antennen er fjernet og plassert ved siden av den første antennen med begge baser på samme side av gaffelen.
4. Alternativt kan antennene stå sikret innenfor holding tube, excised, deretter forsiktig fjernet fra mellom røret og insekt ved hjelp av en wire-tipped verktøy med en skvett av gel på slutten.
5. Antennene er sjekket for å sikre basen og tips er nedsenket i elektrodegel og ingen luftbobler i gelen. Endene / tips kan trimmes til å garantere full eksponering mot elektrodegel. Care bør brukes for å sikre at resten av hver antenne ikke er dekket med gel, noe som garanterer maksimal antennal areal er utsatt for puff.
6. Den preparert gaffel blir deretter satt inn i sonden pre-forsterker og holdt under en konstant strøm av luftfuktighet ved 200 ml / min for den gjenværende tiden av den 10 minutter ventetid. Den avgiftsdirektoratet tid og EAG initiering tider er registrert (tabell 2) og 30 sekunder før første stimulus puff, er ​​pipetten inneholder positive kontroll uforseglet og plassert i holderen som er tilpasset til å dirigere luft / puff flyt 2-3 mm fra den prepped antenner.
7. Etter hvert kompetanseiment, er testen møll avlives i en tørris miljø og forsvarlig behandling.
8. Kvinnelige møll er dissekert for å sjekke parring status. Samboende menn antas å ha parret.

3. EAG Protokoll for individuelle komponenter

1. Antennal svar blir registrert via AutoSpike programvaren som følger med Syntech EAG instrumentet. Konfigurasjonen i AutoSpike kategorien Egenskaper for kanalen med EAG sonde er satt til en samplingsfrekvens på 106,7, NEI til rette, og et filter av 0-42 Hz. For kategorien Filter, er det EAG filter på og lav cutoff er satt til 0,1 Hz.
2. Stimulans puffs er 1-2 sekunder. En timer satt for 1 minutt startes etter hvert puff.
3. Den neste testen volatile pipette er uforseglet og plasseres i holderen. Sekvensen av test flyktige, randomisert mellom løper for å sikre at det ikke teste stoffer konsekvent følge en annen test volatile, blir så fulgt (f.eks tabell 2) nøye allowing 1 minutt mellom puffs.
4. For å lette enklere å lese EAG svar, er deler av herskere plassert på dataskjermen og grunnlinjen nivå til toppen av den nedadgående nedbøyning signal måles i mm og logget på en data ark (dvs. for 5 mV innstilling, 33 mm = 2,5 mV). Programvaren har evnen til avspilling av lagrede opptak for fremtidig analyse. Konvertering av mm til enten mV eller μV amplitude er utført i senere dataanalyse.
5. Etter den siste positive kontrollen spray (f.eks Record # 12) administreres, antennene er fjernet, er gaffel rengjøres med en etanol-mettet tørke og tørke før etterfølgende bruk.
6. For å øke gjennomstrømningen av analyser, kan excision i neste sett av antenner skal startes av en andre laboratoriepersonell ca 10 minutter før slutten av dagens eksperiment - etter fjerde puff, den andre testen volatile av dagens eksperiment, som per tabell 2. Dette vil tillate FOr starten av neste eksperimentet direkte etter dagens eksperimentere endene.
7. Høyere antall gjennomkjøringer (på ulike antenner) kan utføres på forbindelser av interesse å gi ytterligere statistisk validering.

4. Et eksempel på EAG Analyse av Blends eller Andre matriser (tabell 3)

1. Deretter blir de forholdstall og volumer for to tertiære blander (3-komponent blandinger) beregnet å gi et eksempel kombinere flyktige fremlokkende høye EAG responser (Tabell 4). Beregningene er for noen grunnleggende forholdstall, en 1:01:01 molar Forholdet α-humulene: 2-undecanone: 2-phenylethanol og deretter sammenligne til en andre blanding forholdet 01:02:04.
2. Med lignende protokoller som er beskrevet tidligere, er blandinger forberedt og merket Pasteurs pipetter er lastet sammen med de nødvendige positive og negative kontroller.
3. De flyktige Prøvene er oppblåste tvers mannlig og kvinnelig antenner og svarene blir målt og logget påtil en data ark (Tabell 3).

5. Representative Resultater

For kvinnelige navlen orangeworm følgende innstillinger brukes: 2 sekund puffs, 10 sekund opptakstid, 10 andre vinduet, og 5 mV skala. Et negativt utslag er en typisk reaksjon, men den absolutte verdien er fart (f.eks -3400 μV avlede er registrert som 3400 μV). En relativt svak respons på prep til den positive kontrollen blir forkastet. Figur 1 gir en grafisk fremstilling av et dårlig respons på den positive kontrollen ved navlen orangeworm.

For eksempel på en dårlig kontroll resultat, er den gjennomsnittlige kvinnelige antennal svar acetophenone typisk ca. 2600 μV (figur 2), hvis prep bare ga en respons på ca. 1300 μV det ville bli forkastet og et annet par antenner prepped. Tilsvarende gjennomsnittlig mannlig svar på (Z, Z) ble -11,13-hexadecadienal typically 3000 μV, derfor ingen respons mindre enn 1500 μV ble vanligvis forkastet.

Den positive kontrollen ved starten og slutten av hvert forsøk gir også informasjon om tilstanden til antenner. En tommelfingerregel vi følger for rask screening er hvis antennal svar på puff av post-kontroll (Record # 12, tabell 2) er enten mindre enn 75% av ^1. drag av den pre-kontroll (Record # 1 , Tabell 2) eller mindre enn ^2. puff av pre-kontroll (Record # 2, Tabell 2) da eksperimentet ikke brukes i dataanalysen på grunn av mulig nedbrytning av prep (figur 3). Et eksempel på det første tommelfingerregel vil være rekord # 1 = 2730 μV og Record # 12 = 1680 μV, og den andre tommelfingerregel hvis Record # 2 = 2350 μV og Record # 12 = 1680 μV, I hvert av disse tilfellene ville prep og eksperiment resultater kastes.

Arepresentativt eksempel å korrigere EAG grenseverdier målt til den positive kontrollen vil være som følger.

Bruke verdier over for en N = 3 eksperiment, er den negative kontrollen responsen trekkes fra hver verdi innenfor hvert forsøk under den forutsetning av den negative kontrollen er grunnlinjen antennal respons til den mekaniske puff og gjenværende væske.

De positive kontroller for hvert forsøk ville da bli gjennomsnitt og korrigert til 1000 μV, bemerker forholdet for korreksjon til 1000 μV. En data ark (f.eks Excel) kan lett bli manipulert til å konvertere svar på brukbare data.

Multiplisere med korreksjon forholdet innen hvert eksperiment, verdiene for sammensatte A og sammensatte B justeres deretter.

Gjennomsnittene (betyr) for hver forbindelse blir da avhengig sammen med andre relevante statistiske data og EAG svarene for de forbindelsene som ble testet kan deretter bli evaluertfor kandidatur for videre etterforskning.

Figur 1. Representant EAG for mannlig antennal respons (1180 μV) til pre-kontroll ^(1. positiv kontroll puff) som vil bli forkastet på grunn av dårlig antennal respons etter sikre antennene har god kontakt med gel. Blå søylene i bunn vinduer representerer de to andre puff av flyktig. Klikk her for å se større figur .

Trong> Figur 2. Representant EAG for den kvinnelige antennal respons (3400 μV) til ^1. spray pre-kontroll som ville bli vurdert som hensiktsmessig. Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Representant EAG for den kvinnelige antennal respons (1680 μV) til den post-kontroll (siste positive kontroll for hvert forsøk) som vil bli vurdert dårlig, og suggestiv av antenner nedbrytning (<75% av ^1. pre-kontroll eller < ^2. puff verdi av pre-kontroll). For dette eksempelet ^1. pre-kontroll puff var 2730 μV og ^2. pre-kontroll puff var 2350 μV. Klikk her for å se større figur .

dflinebreak ">
Figur 4. Representant EAG for den kvinnelige antennal respons (3800 μV) til drag av en kandidat flyktig blanding og de ​​påfølgende målingene av maksimal innledende nedbøyning (3800 μV), den første skråningen under puff varighet (0,3 s/1.2 mV = 0,25 s / mV), og i skråningen for resten puff varighet (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). Klikk her for å se større figur .

Figur 5. Liten endring fartøyet inneholder et utvalg matrise og tilhørende flyktige å bli andpusten tvers A. transitella antenner.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
Tabell 1. In situ volatile utslipp av Nonpareil mandler (2007) og EAG svar bestemmes av en annen og mindre følsom konfigurasjon i Autospike programmet.

Tabell 2. Eksempel på et skjema for registrering mannlige og kvinnelige antennal reaksjoner på enkelte flyktige komponenter.

Tabell 3. Eksempel på et skjema for registrering mannlige og kvinnelige antennal svar til flyktige blander og / eller buketter.

Tabell 4. Eksempler på forberedelsen av 10 mL av en 5 mg / ml to ulike prosenter av blander.

Tabell 5. Eksempel på skjema for registrering av to påfølgende puffs av single flyktige komponenter tvers mannlige og kvinnelige antenner.

Bruk av electroantennogram innspillinger som et bioassay å bestemme chemoreception reaksjoner fra et mål insekt er ganske vanlig og tallrik studier utnytte EAG som en detektor for avløpsvann fra en gass kromatogram (GC-EAD) finnes i litteraturen. ^9,10 Metoden viste vil gi en rask screening av tilsvarende mengder flyktige komponenter med høy replications for trygg tildeling av den relative respons. Den AutoSpike program i Syntech programvare er et godt program for screening flyktige siden det er i stand til å gi maksimal nedbøyning amplitude signal fra antenner (Tall 1-3), som vi presenterer her som "screening" verdi. I tillegg kan annen grunnleggende informasjon for semi-avansert bruk (se figur 4) fås med AutoSpike avhengig konfigurasjonsinnstillingene og hva forskeren ønsker å komme fra antennal respons. Den GcEAD eller EagPro Syntech programmer er appropriate for mer avanserte eksperimenter eller for forskere kjent med elektrofysiologiske responser siden resulterende spor gir større detalj av tid-løpet av antennal depolarization respons.

Før screening prosessen av forbindelsene påvist fra en rekke anlegg, er det riktig identifikasjon av de flyktige viktig og bør følge strenge protokoller. Hvis mulig, bør to GC kolonner med ulik polaritet (dvs, DB-Wax og DB-1) skal brukes for første komponenten identifisering via matching av inngripende indekser (RIS, se tabell 1). Den beste metoden er å verifisere identiteten til hver volatil med en autentisere standard på to kolonner. ^11. Dersom identiteten til noen av forbindelsene ikke er mulig, kan belyse bioaktivitet deres fortsatt oppnås ved en bruk av GC-EAD. ^Tolv imidlertid , replikering av bioassay kan være begrenset, avhengig av flyktige innsamlingsmetode, vil mengden av analytten ikke være readily tilgjengelig uten intern standard, vil det sammensatte identitet ikke umiddelbart kjent, og påfølgende testing i blandingene ikke ville være mulig.

Hvis forseglet riktig og nedkjølt, kan løsninger av flyktige i pentan vanligvis oppbevares i ca 1 uke. Hvis de forseglede pipets inneholder den lastede platen er plassert i en zip-lås pose og nedkjølt de kan lagres i ca 24 timer. Imidlertid fant vi det best å laste platene morgenen av EAG analyser og avhende leftover pipets på slutten av dagen. Doser for standardiserte puffs bør bestemmes eksperimentelt for hver insektarter dersom beslektet litteratur ikke er lett tilgjengelig.

Formulering av blandingene er typisk en krevende prosess. Vist her er noen relativt enkle tilnærminger, men ikke omfattende. Forskere oppfordres til å gjøre ytterligere lesing om ulike teknikker. Etter vurdering av de enkelte komponentene responses fra vertsplanten flyktige er utført, kan studier av blandinger foretas. Et eksempel er å bruke de flyktige fremlokkende de høyere relative svarene fra screening. Andre eksempler er:. Kombinasjoner ved relative mengder som slippes ut, prosenter av relative svar versus relative mengder, sortering etter klasse av forbindelser, eller flyktige forskjeller i Fenofaser eller ulike tilstander av matrisene (skadet vs uskadet) ¹³

De blander demonstrert er enkle kombinasjoner av disse ulike tilnærmingene. Den 01:01:01 er en høyere blanding basert på den relative høye responser i den innledende screening, men også representerer ulike klasser av forbindelser. Humulene er en sesquiterpene, er 2-undecanone en fettsyre nedbrytningsprodukt, og to-phenylethanol er en benzenoid. Disse forbindelsene representerer de store klasser av flyktige typisk sett i plante-utslipp. Den 01:02:04 forholdet i andre blandingen inkorporerer de relative prosenter av flyktige oppdaget duringe GC-MS analyse. ⁴ Men bruken av SPME og GC-MS gir bare relative forholdstall og bruk av GC-FID analyse i forbindelse med kalibrerings kurver de forskjellige klasser av forbindelser anbefales for en mer nøyaktig utgangspunkt for forholdstall basert på flyktige oppdaget.

Gaffelen elektroden EAG teknikk er en av de mer enkle metoder som benyttes i elektrofysiologisk eksperimentering. ^Fjorten Leseren blir oppfordret til å utføre ytterligere litteratur forskning for avanserte applikasjoner utover denne metoden. I tillegg kan screening av ex situ matriser utføres ved hjelp av metoden demonstrert, men utnytte små (60 ml) modifiserte skip (figur 5) som inneholder deler av planten (for eksempel malte mandler). Ved bruk av større beholdere (f.eks 120 ml med lokk fartøy med spesielle adaptere for bruk med EAG puffer) anbefales det å øke vannmengden for å sikre forsvarlig evakuering av beholderen. Et eksperiment should bli utført hvor en positiv kontroll er plassert i beholderen for å sikre riktig stimulering oppnås ved nødvendig vannmengde. Bruken av en to andre puff for de enkelte komponentene ikke er absolutt nødvendig og sprayer på rekkefølgen av 0,5 til 1,0 sekunder er mer typisk. Men gjør det gir enklere fremtidige sammenligninger med puffs av containerized flyktige buketter siden disse vanligvis krever en lengre puff ved høyere hastigheter. Våre laboratorier utnytte de to andre puff for å sammenligne én komponent og / eller blanding svar direkte til puffs med matriser i små fartøy (se figur 5). De to andre puff på disse små fartøyene sikrer fullstendig evakuering av beholderen når den riktige flyten kursen er satt.

Videre kan anskaffelse av et sekund puff utføres, men andre puff er ikke absolutt nødvendig for screening siden mengden av komponenten volatilized ikke lenger holdes på et strengt standard (<strong> tabell 5). Imidlertid kan denne informasjonen være verdifull for eventuelle påfølgende dose-respons-eksperimenter. ^15. En mye lavere respons kan indikere en svekket respons på lavere konsentrasjoner mens en konsekvent reaksjon kan indikere dosen er nær grensen for en høy respons. Det bør bemerkes det finnes andre fysiologiske forklaringer på endringen i respons ¹⁴ til andre puff, men informasjonen ikke bistå i veiledning for fremtidige eksperimenter. Hvis høy gjennomstrømming er ikke helt avgjørende, kan bruk av en andre drag av hver komponent være informativ.

Hvis jomfruelige kvinnelige møll er målrettet prøven, NÅ larver i siste instar eller puppe kan kjønnede og segregerte ¹⁶ å tillate kvinnelige fremveksten å skje i egne containere.

Justering av skalaen kan være nødvendig for å imøtekomme antennal svaret hvis det overskrider gjeldende skala. Vekten på EAG programvare skjermen can bistå i å bestemme hvor mange mm per μV respons. Andre insekter kan variere i følsomhet deres.

Metoden viste gir en lett å lære, rask, pålitelig og high-throughput screening protokoll for å redusere antall flyktige for bioaktivitet vederlag fra komplekset sammensetningen av vertsplanten flyktige. Forutsatt at antennene av prøven er egnet, gjør at gaffelen EAG metode for rask vurdering av en rekke flyktige komponenter eller blandinger av komponenter, og sammenligning av svarene som for en standard. Til syvende og sist er en bioassay som vurderer aktiviteten av komponenten eller blanding av komponenter i et felt innstilling den mest gyldige metode. Men feltstudier ofte er svært tid og arbeid tidkrevende, dyrt og krever flere måneder å få riktige resultater.