Electroantennographic Biotest som et screeningsværktøj for værtsplante Flygtige

1. Udarbejdelse af flygtige Opdagede fra værtsplanten for Eag Screening

1. Efter en passende identifikation og autentifikation af alle flygtige stoffer via GC-MS, udføre EAG pust analyse af hver tilgængelig flygtigt. Indledende screening kan være et lavt replikat antal antennal responser (N = 3-5) af begge køn for at opnå en indikation af relativ chemoreceptivity i en kort tid (tabel 1).
2. Fremstille en opløsning af hver flygtig ved en 5 mg / ml koncentration i pentan. Tæt forsegle og opbevares i køleskab prøven indtil den er klar til øjeblikkelig brug (f.eks acetophenon, densitet = 1,03 g / ml, volume = (0,005 g/1.03 g / ml) × 1.000 = 4,85 pi acetophenon til en 1,0 ml målekolbe og fortyndes til 1,0 ml med pentan).
3. Lige før Eag analyse fjernes hætteglas indeholdende 5 mg / ml koncentration af flygtige, der skal undersøges, og der opvarmes til stuetemperatur. I mellemtiden mærke det rette antal af Pasteur-pipetter tilsvarer til hvert svingende der skal testes, og vikle et lille stykke parafilm (ca. 15 x 15 mm) over spidsen af ​​pipetten. For den indledende screening 10 stimulus pipetter (N = 4 for hver han og hun) fyldes i tilfælde af en dårlig præparativ eller anden uventet forhindring.
4. Ved hjælp af en pincet, forsigtigt fold bioassay skive halv for at lette placering i pipetten, derefter delvist placere den foldede skive i den store ende af pipetten, således at ca. 2-3 mm af skiven udsættes for. Juster de mærkede og prepped pipetter i et rack holder.
5. Ved hjælp af en pipette eller en sprøjte, indlæse 10 pi (50 ug) af flygtige opløsningen på hver skive og tillade 2 minutter passerer før fuldstændig indsættelse diske i pipetten. Når først indlæst umiddelbart forsegle enden af ​​pipetten med parafilm (ca. 15 x 30 mm). Mængden af ​​flygtige stimulus skal læsses og blasert vil sandsynligvis variere med insekter arter.
6. Efter den samme protokol nævnt ovenfor forberede kontrolleromfatter i hver analyse. For den negative kontrol belastning 10 pi bare pentan på hver skive, vent 2 minutter, skal du lægge ind i mærket pipetten, og sæl. For den positive kontrol, indlæses 10 pi (50 ug) på disken, vente 2 minutter belastning i det mærkede pipette og forsegling med parafilm.
7. Holdbarheden af insektet antennal Prep vil sandsynligvis variere med arter, men vi har fundet, at Amyelois transitella antenner typisk forblive aktive og konsekvente i> 30 minutter efter excision med den beskrevne protokol. Denne mængde vil generelt give mulighed for op til 4-10 flygtige prøver, der skal evalueres. Tabel 2 giver et eksempel gange og sekvenser.

2. Udarbejdelse af Insect antenner til Eag Bioassay

1. Fokus for dette eksperiment er Eag analyse, og dermed den antagelse, at hver investigator skal have adgang til passende opdrættes insekter.
2. Til dette eksperiment vil vi studere 3-4 dage old, parrede mandlige og kvindelige møl. Individuelle møl overføres til en lille, låg, plastbeholder dagen for analysen. Umiddelbart forud for bioassay er møllet, der skal testes overføres hovedet først ind i en holder apparat (dvs. fremstillet af forskellige plastmaterialer pipette spidser) og sikret bagfra. Manipulation af insektet kan ses under et lavt strømforbrug stereomikroskop for at lette fjernelse.
3. Antenner er drillet ud ved hjælp af en wire-spids værktøj. Gaflen holderen med en tynd film af elektroden gel anbringes i tæt nærhed til hurtig overførsel af antenner. Den første antenne udskæres under anvendelse mikro saks og anbragt på gaflen, sikrer basis af antennen er placeret på den ikke-røde del af gaflen (den indifferente jordelektrode). En timer sæt i 10 minutter startes, og den anden antenne er udskåret og placeret ved siden af ​​den første antenne med begge baser på den samme side af gaflen.
4. Alternativt kan antennerne efterlades fastgjort inden i holding røret, skæres derefter forsigtigt fjernet fra mellem røret og insekt hjælp af en wire spids værktøj med en klat gel på enden.
5. Antenner kontrolleres for at sikre basen og spidsen er nedsænket i elektrodegel og ingen bobler i gelen. Enderne / tips kan trimmes til at sikre fuld eksponering til elektroden gelen. Man bør anvendes for at sikre, at den resterende del af hver antenne ikke er dækket med gel, således at sikre maksimal antennal overfladeareal udsat for sug.
6. Den prepped gaffel indsættes derefter i sonden forforstærker og holdes under en konstant strøm af befugtet luft ved 200 ml / min i den resterende tid af 10 minutter venteperiode. Punktafgiftsområdet tid og Eag initiation gange observeres (tabel 2) og 30 sekunder forud for den første stimulus sug, bliver pipetten indeholdende den positive kontrol uforseglede og anbringes i holderen, som er tilpasset til at dirigere luft / sug strømning 2-3 mm fra den prepped antenner.
7. Efter hver experiment, er test møl aflivet i et tøris miljø og korrekt anbragt.
8. Kvindelige møl dissekeres at kontrollere parring status. Cohabitating mænd formodes at have parret.

3. Eag Protokol for de enkelte komponenter

1. Antennal svar registreres via AutoSpike software, der følger med Syntech EAG instrument. Konfigurationen i AutoSpike fanen Egenskaber for kanalen med EAG sonden er sat til en sampling hastighed på 106,7, NO at rette op, og et filter på 0-42 Hz. For Filter fanen, er det EAG filter på, og den lave-cutoff er sat til 0,1 Hz.
2. Stimulus pust er 1-2 sekunders varighed. En timer sat til 1 minut startes efter hvert sug.
3. Den næste test flygtige pipetten tætnet og placeret i holderen. Sekvensen af test flygtige bestanddele, randomiseres mellem løber at sikre, at ingen testforbindelser konsekvent følger en anden test flygtigt, efterfølges (f.eks tabel 2) omhyggeligt allowing 1 minut mellem dragene.
4. Er nem at læse Eag svar, er dele af herskere placeret på computerskærmen, og baseline niveau til toppen af ​​den nedadgående udbøjning signalet måles i mm og logget på en data-ark (dvs. til 5 mV indstillingen, 33 mm = 2,5 mV). Softwaren er i stand til afspilning af de gemte optagelser til senere analyse. Omdannelse af mm til enten mV eller μV amplitude udføres senere dataanalyse.
5. Efter den afsluttende positive kontrol sug (f.eks post # 12) administreres, antennerne fjernes, er gaffel renses med en ethanol-mættet tørre og fik lov at tørre før efterfølgende brug.
6. For at øge gennemstrømningen af assays, kan udskæringen af det næste sæt af antenner skal indledes af en anden laboratoriepersonale cirka 10 minutter før udløbet af den nuværende eksperiment - efter den fjerde pust, den anden test flygtige af den nuværende eksperiment, som pr tabel 2. Dette vil tillade for starten af ​​det næste eksperiment direkte efter de aktuelle eksperiment ender.
7. Højere antal gentagelser (på forskellige antenner) kan udføres på forbindelser af interesse at give yderligere statistisk validering.

4. Et eksempel på Eag Analyse af blandinger eller andre matricer (tabel 3)

1. Dernæst er de nøgletal og mængder for to tertiære blandinger (3-komponent blandinger) beregnet til at give et eksempel på at kombinere flygtige stoffer fremkalder høje EAG reaktioner (tabel 4). Beregningerne er for nogle grundlæggende forhold, en 01:01:01 molforholdet mellem α-humulene: 2-undecanon: 2-phenylethanol og derefter sammenligne et andet blandingsforhold på 01:02:04.
2. Under anvendelse af lignende protokoller beskrevet ovenfor, er de blandinger fremstilles og mærkes Pasteur-pipetter fyldes sammen med de nødvendige positive og negative kontroller.
3. De flygtige Prøverne opblæste tværs af mandlige og kvindelige antenner og reaktionerne måles og registreresen datablad (tabel 3).

5. Repræsentative resultater

For kvindelige navle orangeworm følgende indstillinger bruges: 2 sekunders pust og 10 sekunders optagelse gange, 10 andet vindue, og 5 mV skala. En negativ udbøjning er den typiske reaktion, men den absolutte værdi registreres (f.eks -3.400 μV udbøjning er registreret som 3.400 μV). En forholdsvis svag respons prep til den positive kontrol kasseres. Figur 1 er en grafisk repræsentation af en dårlig respons på den positive kontrol navlen orangeworm.

For eksempel af en ringe kontrol resultat er den gennemsnitlige kvindelige antennal reaktion acetophenon typisk ca. 2600 μV (fig. 2), hvis prep kun gav en reaktion på ca. 1300 μV det ville blive kasseret, og et andet par af antenner prepped. Tilsvarende gennemsnitlige mandlige reaktion (Z, Z) blev -11,13-hexadecadienal typically 3.000 μV, og dermed noget svar på mindre end 1.500 μV blev typisk kasseret.

Den positive kontrol i starten og slutningen af ​​hvert forsøg tilvejebringer også information vedrørende tilstanden af ​​antenner. En tommelfingerregel vi følger for en hurtig screening er, hvis den antennal svar på pust af post-kontrol (Record # 12, tabel 2) er enten mindre end 75% af 1 ^m pust af præ-kontrol (record # 1 , tabel 2) eller mindre end ^2. sug af præ-kontrol (record # 2, tabel 2) derefter eksperimentet ikke anvendes i dataanalysen på grund af mulig degradering af det prep (figur 3). Et eksempel på den første tommelfingerregel vil være rekord # 1 = 2730 μV og Record # 12 = 1680 μV, og den anden tommelfingerregel, hvis Record # 2 = 2350 μV og Record # 12 = 1680 μV, I hvert af disse tilfælde ville prep og eksperimentets resultater kasseres.

Enrepræsentativt eksempel at korrigere de EAG respons værdier målt for den positive kontrol var som følger.

Ved hjælp af værdier over for en N = 3 eksperiment, er den negative kontrol respons subtraheres fra hver værdi inden hvert eksperiment under antagelse den negative kontrol, er udgangspunktet antennal reaktion på mekaniske sug og resterende opløsningsmiddel.

De positive kontroller for hvert forsøg vil derefter blive gennemsnit og korrigeret til 1.000 μV, at bemærke, at forholdet for korrektion til 1.000 μV. Et datablad (f.eks Excel) kan let manipuleres til at konvertere svar på anvendelige data.

Multiplicere med korrektionen forholdet inden hvert eksperiment værdierne for forbindelse A og forbindelse B justeres derefter.

Gennemsnitstal (midler) for hver forbindelse bestemmes derefter sammen med andre relevante statistiske data og Eag reaktioner for de testede forbindelser kan derefter evaluerestil kandidatur til yderligere undersøgelse.

Figur 1. Repræsentant EAG til mandlig antennal respons (1180 μV) til præ-kontrol ^(1. positiv kontrol sug), som ville blive kasseret på grund af dårlig antennal respons efter sikring af antennerne har god kontakt med gelen. Blå barer i bunden vinduer repræsenterer to sekunder pust af flygtige. Klik her for at se større figur .

Trong> Figur 2. repræsentant EAG for den kvindelige antennal respons (3400 μV) til 1 ^st pust pre-kontrol, som vil anses for passende. Klik her for at se større figur .

Figur 3. Repræsentant EAG for den kvindelige antennal respons (1680 μV) til efterkontrol (sidste positive kontrol for hvert forsøg), som ville blive anset for dårlig, og suggestivt af antenner nedbrydning (<75% af 1 ^st pre-kontrol eller < ^2. sug værdi af præ-kontrol). For dette eksempel 1 ^st pre-kontrol puff var 2.730 μV og 2 ^anden pre-kontrol puff var 2.350 μV. Klik her for at se større figur .

dflinebreak ">
Figur 4. Repræsentant Eag for den kvindelige antennal respons (3800 μV) til pust af en kandidat flygtig blanding, og de ​​efterfølgende målinger af den maksimale initiale nedbøjning (3800 μV), den initiale hældning under suget varighed (0,3 s/1.2 mV = 0,25 s / mV), og hældningen for den resterende sug varighed (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). Klik her for at se større figur .

Figur 5. Små ændringer beholder indeholdende en prøvematrix og tilhørende flygtige skal suges over A. transitella antenner.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
Tabel 1. In situ flygtig emission af Nonpareil mandler (2007) og EAG svar bestemt af en anden og mindre følsom konfiguration i Autospike programmet.

Tabel 2 nedenfor. Eksempel på en form til optagelse mandlige og kvindelige antennal reaktioner enkelte flygtige komponenter.

Tabel 3. Eksempel på en formular til registrering af mandlige og kvindelige antennal svar på flygtige blandinger og / eller buketter.

Tabel 4. Eksempler på fremstilling af 10 ml af en 5 mg / ml opløsning i to forskellige forhold af blandinger.

Tabel 5. Eksempel på formular til registrering af to på hinanden følgende pust af enlige flygtige komponenter på tværs af mandlige og kvindelige antenner.

Anvendelse af electroantennogram optagelser som et bioassay for at bestemme chemoreception responser et mål insekt er ret almindelig, og mange undersøgelser under anvendelse af EAG som en detektor for effluent fra et gaskromatogram (GC-EAD) kan findes i litteraturen. ^9,10 Fremgangsmåden vist vil give en hurtig screening af ækvivalente mængder af flygtige komponenter med høje gentagelser for sikker tildeling af den relative lydhørhed. Det AutoSpike programmet i Syntech software er et godt program for screening af flygtige stoffer, da det er i stand til at give den maksimale udbøjning amplitude signal fra antennerne (figur 1-3), som vi præsenterer her, som "screening" værdi. Derudover kan andre grundlæggende oplysninger til semi-avanceret brug (se figur 4) opnås med AutoSpike afhængig af konfigurationsindstillinger og hvad forskeren ønsker at stamme fra antennal respons. Den GcEAD eller EagPro Syntech programmer er caropriate for mere avancerede eksperimenter eller for videnskabsfolk er fortrolige med elektrofysiologiske svar, da de resulterende spor giver større detaljer i tidsforløbet for antennal depolarisering respons.

Før screeningen af ​​forbindelserne detekterede fra en værtsplante, korrekt identifikation af de flygtige stoffer er vigtig og bør følge strenge regler. Hvis det er muligt, bør to GC kolonner med forskellig polaritet (dvs. DB-Wax og DB-1) skal bruges til den indledende komponent identificering via matching af retention indekser (RIS, se tabel 1). Den bedste metode er at verificere identiteten af hver flygtig med en autentificere standard to kolonner. ^11. Hvis identiteten af nogle af forbindelserne ikke er mulig, kan belysningen af deres bioaktivitet stadig opnås ved en anvendelse af GC-EAD. ¹² imidlertid , replikation af bioassayet kan begrænses afhængigt flygtige indsamling metode, vil mængden af ​​analytten ikke readily tilgængelige uden en intern standard, vil forbindelsen identitet ikke umiddelbart er kendt, og den efterfølgende testning i blandinger ville ikke være mulig.

Hvis forseglet korrekt og nedkølet, kan opløsninger af flygtige stoffer i pentan typisk opbevares i cirka 1 uge. Hvis de forseglede pipetter indeholdende den fyldte skive anbringes i en lynlås posen og nedkølet de kan lagres i omkring 24 timer. Men vi fandt det bedst at indlæse skiverne morgenen den Eag analyser og korrekt bortskaffelse af sidesten pipetter ved slutningen af ​​dagen. Doseringer til standardiserede sug bør bestemmes eksperimentelt for hver insektarter, hvis relevant litteratur ikke er let tilgængelige.

Formulering af blandinger er typisk en besværlig proces. Vist her er nogle forholdsvis enkle metoder, men ikke omfattende. Forskere opfordres til at gøre yderligere læsning om forskellige teknikker. Efter evaluering af enkelte responses fra værtsplanten flygtige er blevet udført, kan undersøgelser af blandinger udføres. Et eksempel er ved hjælp af de flygtige stoffer at afæske de højere relative respons fra screeningen. Andre eksempler er:. Kombinationer af relativ udsendes mængder, forhold mellem relative respons versus relative mængder, sortering af klasse af forbindelser, eller flygtige forskelle i fænologiske stadier eller forskellige medlemsstater i matricer (beskadiget vs ubeskadiget) ¹³

De påviste blandinger er enkle kombinationer af disse forskellige tilgange. Den 01:01:01 er en tertiær blanding baseret på de relative høje responser i den indledende screening, men også repræsenterer forskellige klasser af forbindelser. Humulene er et sesquiterpen-, 2-undecanon er en fedtsyre nedbrydningsprodukt, og 2-phenylethanol, er en benzenoid. Disse forbindelser repræsenterer de vigtigste klasser af flygtige typisk ses i anlægsemissioner. Den 01:02:04 forholdet i den anden blanding omfatter de relative forhold mellem flygtige detekterede during af GC-MS-analyse. ⁴ Anvendelsen af SPME og GC-MS giver kun relative forhold og anvendelse af GC-FID-analyse i sammenhæng med kalibreringskurver for de klasser af forbindelser er anbefalet til en mere nøjagtig udgangspunkt for forholdet baseret på detekterede flygtige stoffer.

Gaflen elektrode EAG teknik er en af de mere simple metoder i elektrofysiologiske forsøg. ¹⁴ Læseren opfordres til at udføre yderligere litteratursøgning til avancerede anvendelser end denne metode. Desuden kan screening af ex situ matricer kan udføres under anvendelse af fremgangsmåden vist, men under anvendelse af små (60 ml) modificerede fartøjer (fig. 5) indeholdende plantedelene (f.eks hakkede mandler). Ved anvendelse af større beholdere (f.eks 120 ml låg beholder med særlige adaptere til anvendelse med EAG puffer) anbefales det at forøge strømningshastigheden for at sikre korrekt evakuering af beholderen. Et eksperiment skuldred udføres, hvis en positiv kontrol er placeret i beholderen for at sikre korrekt stimulering opnås ved den nødvendige strømningshastighed. Anvendelsen af ​​et to andet drag for de enkelte komponenter er ikke absolut nødvendigt, og sug i størrelsesordenen 0,5 til 1,0 sekunder er mere typisk. Men det giver mulighed for nemmere fremtidige sammenligninger med pust af containertransport flygtige buketter, da disse typisk kræve en længere pust ved højere flowhastigheder. Vore laboratorier anvender de to andet drag for at sammenligne enkelte komponenter og / eller blanding reaktioner direkte til sug ved hjælp af matricerne i små kar (se figur 5). De to andet drag på disse små fartøjer sikrer fuldstændig evakuering af beholderen, når den passende strømningshastighed indstilles.

Endvidere kan erhvervelse af et andet drag udføres imidlertid andet drag, er ikke absolut nødvendig til screening, da mængden af ​​det flygtiggjorte komponenten ikke længere holdes ved en streng standard (<strong> Tabel 5). Imidlertid kan denne information være værdifuld for efterfølgende dosis-respons-eksperimenter. ¹⁵ en meget lavere reaktion kan indikere en nedsat respons på lavere koncentrationer, mens en konsistent reaktion kan indikere dosis er nær grænsen for en høj respons. Det skal bemærkes, at der er andre fysiologiske forklaringer for ændringer i svar ¹⁴ til den anden pust, men oplysningerne ikke hjælpe med retningslinjer for de fremtidige eksperimenter. Hvis høj-throughput ikke er absolut afgørende, kan anvendelsen af ​​et andet drag på hver komponent være informativ.

Hvis ubrugte kvindelige møl er rettet prøven, NU larver i sidste stadium eller pupper kan kønsbestemmes og adskilt ¹⁶ for at tillade kvindelige fremkomsten at forekomme i separate beholdere.

Justering af skalaen kan være nødvendigt at rumme antennal respons, hvis det overstiger den aktuelle plan. De skalaer på EAG softwaren skærmen can bistå med at afgøre, hvor mange mm pr μV respons. Andre insekter kan variere i deres følsomhed.

Den viste fremgangsmåde tilvejebringer en let at lære, hurtig, pålidelig og high-throughput screening protokol til at reducere antallet af flygtige for bioaktivitet behandling af den komplekse sammensætning af værtsplanten flygtige stoffer. Forudsat antenner af prøven er egnet, forgaflen EAG metode giver mulighed for en hurtig vurdering af en række flygtige komponenter eller blandinger af komponenter og sammenligning af svarene på, at en standard. Sidste ende et bioassay, der vurderer aktiviteten af ​​komponenten eller blanding af komponenter i et felt indstilling er bedst egnet metode. Imidlertid feltundersøgelser ofte er meget tids-og arbejdskrævende, kostbare og kræver multiple måneder for at opnå korrekte resultater.