Essais biologiques électroantennographique comme outil de dépistage pour les substances volatiles de la plante hôte

1. Préparation de composés volatils détecté de la plante hôte pour EAG dépistage

1. Après une identification appropriée et l'authentification des toutes les substances volatiles par GC-MS, effectuer une analyse de chaque bouffée EAG volatile disponibles. Le dépistage initial peut être un nombre répétition faible taux de réponses antennaires (N = 3-5) pour chaque sexe afin de parvenir à une indication de chemoreceptivity relative dans un court laps de temps (tableau 1).
2. Préparer une solution de chaque volatile à un 5 mg / ml de concentration dans le pentane. Bien sceller et réfrigérer jusqu'au moment de l'échantillon pour une utilisation immédiate (par exemple, l'acétophénone, la densité = 1,03 g / mL, volume = (0,005 g/1.03 g / mL) x 1000 = 4,85 pl de l'acétophénone dans un flacon de 1,0 ml volumétrique et diluer à 1,0 ml avec du pentane).
3. Juste avant l'analyse EAG, retirer les flacons contenant les 5 mg / ml de concentration de substances volatiles à tester et laisser réchauffer à température ambiante. Pendant ce temps, étiqueter le nombre correct de pipettes Pasteur àen corrélation avec chaque volatile à tester, et envelopper un petit morceau de parafilm (environ 15 × 15 mm) sur la pointe de la pipette. Pour les pipettes de dépistage initiaux de relance 10 (N = 4 pour chaque mâle et femelle) sont chargés dans le cas d'une préparation ou d'autres mauvais obstacle imprévu.
4. En utilisant une paire de pinces à épiler, incorporer délicatement le disque bioessai en deux pour faciliter le placement dans la pipette, puis placez le disque partiellement plié dans le gros bout de la pipette de sorte que ca. 2-3 mm du disque sont exposées. Alignez les pipettes étiquetés et préparée dans un support en rack.
5. Aide d'une pipette ou une seringue, de charger 10 pi (50 ug) de solution volatile sur chaque disque et permettre à 2 minutes à passer devant insérant complètement les disques dans la pipette. Une fois chargé, fermer immédiatement l'extrémité de la pipette avec du parafilm (environ 15 × 30 mm). Le montant de la relance volatile pour être chargé et soufflé sera très probablement varient avec les espèces d'insectes.
6. Suivant le même protocole mentionné ci-dessus, préparer les témoins pourinclure dans chaque analyse. Pour le contrôle de la charge négative de 10 uL d'un peu de pentane sur chaque disque, attendre 2 minutes, chargez-le dans la pipette marquée, et le sceau. Pour le contrôle positif, de charger 10 pi (50 ug) sur le disque, attendre 2 minutes, la charge dans la pipette marquée, et le joint avec du parafilm.
7. La viabilité de la préparation des insectes antennaire sera très probablement varient avec les espèces, mais nous avons constaté que Amyelois transitella antennes généralement rester actif et cohérent pour plus de 30 minutes après l'excision selon le protocole décrit. Ce laps de temps permettra généralement pour un maximum de 4-10 échantillons volatils pour être évalués. Le tableau 2 donne un exemple des temps et des séquences.

2. Préparation des antennes des insectes pour les essais biologiques EAG

1. L'objectif de cette expérience est EAG analyse, donc, l'hypothèse que chaque chercheur aura accès à des insectes de façon appropriée élevés.
2. Pour cette expérience, nous allons étudier 3-4 jours old, accouplées papillons mâles et femelles. Papillons individuels sont transférés dans un petit couvercle, récipient en plastique le jour de l'analyse. Immédiatement avant l'essai biologique, la teigne à tester est transférée tête la première dans un dispositif de retenue (c.-à-fait à partir de diverses pointes de pipettes en plastique) et sécurisé par derrière. Manipulation de l'insecte peut être considérée sous un faible puissance stéréo-microscope afin de faciliter l'excision.
3. Les antennes sont taquinés à l'aide d'un outil à pointe métallique. Le support de fourche, avec un petit film d'électrode de gel, est placé à proximité immédiate pour le transfert rapide d'antennes. La première antenne est excisé avec des ciseaux micro et placé sur la fourche, en assurant la base de l'antenne est placée sur la partie non-rouge de la fourche (l'électrode de masse indifférente). Un ensemble minuterie pour 10 minutes est démarré et la seconde antenne est excisé et placé à côté de la première antenne avec deux bases sur le même côté de la fourche.
4. Alternativement, les antennes peuvent être laissés sécurisé au sein de la holdintube de g, excisé, puis doucement retiré de entre le tube et l'insecte à l'aide d'un outil à pointe métallique avec une noisette de gel sur la fin.
5. Antennes sont vérifiées pour assurer la base et la pointe sont immergés dans un gel d'électrode et pas de bulles sont présents dans le gel. Les extrémités et pourboires peuvent être découpés pour garantir une exposition complète sur le gel de l'électrode. Des précautions doivent être utilisés pour s'assurer que le reste de chaque antenne n'est pas recouverte de gel, garantissant ainsi un maximum de surface antennaire est exposé à la houppette.
6. La fourche préparée est ensuite inséré dans la sonde pré-amplificateur et maintenu sous un flux constant d'air humidifié à 200 mL / min pour la durée restante de la période d'attente de 10 minutes. Le temps d'accise et de l'EAG fois d'initiation sont notés (tableau 2) et 30 secondes avant la bouffée premier stimulus, la pipette contenant le contrôle positif n'est pas scellé et placé dans le support qui est ajusté pour diriger l'air / bouffée d'écoulement de 2-3 mm de l'préparée antennes.
7. Après chaque expertiseiment, les papillons de test sont euthanasiés dans un environnement de glace sèche et bien disposés.
8. Les papillons femelles sont disséquées pour vérifier l'état d'accouplement. Hommes cohabitent sont supposés se sont accouplés.

3. EAG Protocole pour les composants individuels

1. Réponses antennaires sont enregistrées via le logiciel AutoSpike inclus avec l'instrument EAG Syntech. La configuration dans les propriétés de l'onglet AutoSpike pour le canal avec la sonde EAG est fixé à un taux d'échantillonnage de 106,7, NON à la rectification, et d'un filtre de 0-42 Hz. Pour l'onglet Filter, le filtre EAG est en marche et le seuil de faible est fixé à 0,1 Hz.
2. Bouffées de stimulation sont 1-2 secondes dans la durée. Une minuterie est réglée pendant 1 minute est lancé après chaque bouffée.
3. La pipette test suivant volatile n'est pas scellé et placé dans le support. La séquence d'essai, randomisé volatiles entre court afin de s'assurer qu'aucun des composés d'essai systématiquement suivi un autre test volatile, est suivie (par exemple, le tableau 2) soigneusement allowing 1 minute entre les bouffées.
4. Pour faciliter la lecture des réponses EAG, des parties de dirigeants sont placés sur l'écran d'ordinateur et le niveau de base vers le sommet du signal de déviation vers le bas est mesurée en mm et connecté sur une feuille de données (par exemple, pour le réglage 5 mV, 33 mm = 2,5 mV). Le logiciel a la capacité de lecture des enregistrements sauvegardés pour une analyse future. Conversion de mm soit mV ou mV d'amplitude est effectuée dans l'analyse ultérieure des données.
5. Après la bouffée de contrôle final positif (par exemple, record # 12) est administré, les antennes sont retirées, la fourche est nettoyé avec une lingette éthanol saturé et on laisse sécher avant utilisation ultérieure.
6. Pour augmenter le débit des tests, l'excision de la prochaine série d'antennes peut être démarré par un personnel de laboratoire seconde environ 10 minutes avant la fin de l'expérience actuelle - après la bouffée quatrième le deuxième test volatile de l'expérience actuelle, selon le tableau 2. Cela permettra aux for le début de l'essai suivant directement après les extrémités d'expérimentation courant.
7. Augmentation du nombre de répétitions (sur les différentes antennes) peuvent être effectuées sur des composés d'intérêt de fournir une validation plus poussée des statistiques.

4. Un exemple d'analyse de mélanges EAG ou d'autres matrices (tableau 3)

1. Ensuite, les ratios et les volumes pour deux mélanges tertiaires (3-composants des mélanges) sont calculés pour donner un exemple de combiner volatiles obtenir des réponses EAG élevées (tableau 4). Les calculs sont pour certains ratios de base, un ratio de 1:1:1 molaire de α-humulène: 2-undécanone: 2-phényléthanol et en comparant ensuite à un rapport de mélange deuxième 1:02:04.
2. L'utilisation de protocoles similaires décrit précédemment, les mélanges sont préparés et étiquetés pipettes Pasteur sont chargés avec les contrôles nécessaires positifs et négatifs.
3. Les échantillons volatiles se sont enflés à travers les antennes mâles et femelles et les réponses sont mesurés et enregistrés surà une feuille de données (tableau 3).

5. Les résultats représentatifs

Pour orangeworm nombril des femmes les paramètres suivants sont utilisés: 2 bouffées seconde, 10 fois deuxième enregistrement, 10 seconde fenêtre, et une échelle de 5 mV. Une déviation négative est la réponse typique, mais la valeur absolue est enregistrée (par exemple, -3400 mV de déviation est comptabilisé comme 3400 mV). Une réponse relativement faible de la préparation au contrôle positif est mis au rebut. La figure 1 donne une représentation graphique d'une mauvaise réponse au contrôle positif par orangeworm nombril.

Par exemple d'un résultat un mauvais contrôle, la moyenne de réponse des femmes à antennaire acétophénone est typiquement ca. 2600 mV (Figure 2), si la préparation ne donne une réponse de ca. 1300 mV il être mis au rebut et une autre paire d'antennes préparée. De même, la réponse moyenne des hommes de (Z, Z) -11,13-hexadecadienal était typically 3000 mV; par conséquent, toute réponse inférieur à 1.500 mV a été généralement mis au rebut.

Le contrôle positif au début et à la fin de chaque expérience fournit également des informations concernant l'état de l'antenne. Une règle de base que nous suivons pour le dépistage rapide est de savoir si la réponse antennaire de la bouffée de contrôle a posteriori (dossier n ° 12, tableau 2) est soit inférieur à 75% de la bouffée 1 ^er de la pré-commande (dossier n ° 1 , tableau 2) ou inférieure à la houppette 2 ^ème de la pré-commande (dossier n ° 2, tableau 2), puis l'expérience n'est pas utilisé dans l'analyse des données due à une dégradation possible de la préparation (Figure 3). Un exemple de la première règle de base serait d'enregistrement n ° 1 = 2730 mV et notice # 12 = 1680 mV, et la deuxième règle de base si le dossier n ° 2 = 2350 mV et notice # 12 = 1680 mV, Dans chacun de ces cas , les résultats de préparation et d'expérimentation seraient mis au rebut.

Uneexemple représentatif de corriger les valeurs de réponse EAG telle que mesurée au contrôle positif serait la suivante.

En utilisant les valeurs ci-dessus pour N = 3 expérience, la réponse est négative de contrôle soustrait à toute valeur au sein de chaque expérience dans l'hypothèse le contrôle négatif est la réponse de base antennaire feuilletée à la mécanique et le solvant résiduel.

Les contrôles positifs pour chaque expérience serait alors en moyenne et corrigée pour 1000 mV, en notant le rapport pour la correction à 1000 mV. Une fiche de données (par exemple, Excel) peuvent être facilement manipulés pour convertir des réponses à des données utilisables.

En multipliant par le rapport de correction au sein de chaque expérience, les valeurs pour le composé A et B composé sont ensuite ajustés.

Les moyennes (moyen) pour chaque composé sont alors déterminés avec d'autres données statistiques pertinentes et les réponses EAG pour les composés testés peuvent ensuite être évaluésà candidature pour une enquête plus approfondie.

Figure 1. EAG Représentant pour la réponse antennaire mâle (1180 mV) de la pré-commande (1 ^er bouffée contrôle positif) qui seraient rejetés en raison de la réponse antennaire pauvre après s'être assuré les antennes ont un bon contact avec le gel. Des barres bleues dans les fenêtres du bas représente la bouffée deux secondes de volatile. Cliquez ici pour agrandir la figure .

ère feuilletée pré-contrôle qui serait jugé approprié. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. EAG Représentant pour la réponse des femmes antennaire (1680 mV) au poste de contrôle (dernière contrôle positif pour chaque expérience) qui seraient considérés comme pauvres, et suggestif de la dégradation des antennes (<75% des 1 ^er pré-commande ou < 2 La valeur bouffée ^e de pré-commande). Pour cet exemple, le 1 ^er pré-commande feuilletée était 2730 mV et 2 ^ème pré-commande feuilletée était 2350 mV. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4. Représentative de la réponse EAG femelle antennaire (3800 mV) à la bouffée d'un mélange candidat volatile et les mesures ultérieures de la déviation maximale initiale (3800 mV), la pente initiale au cours de la durée de la bouffée (0,3 mV s/1.2 = 0,25 s / mV), et la pente de la durée de la bouffée restante (1,6 mV s/1.9 = 0,84 s / mV). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 5. Des petits vaisseaux modifié contenant une matrice de l'échantillon et volatiles associés à être soufflée dans A. transitella antennes.

Tableau 1. En sUIT émission volatile d'amandes Nonpareil (2007) et les réponses EAG déterminées par une configuration différente et moins sensible dans le programme Autospike.

Tableau 2. Exemple d'un formulaire d'enregistrement masculins et féminins des réponses antennaires aux différents composants volatils.

Tableau 3. Exemple d'un formulaire d'enregistrement masculins et féminins des réponses antennaires aux mélanges volatils et / ou des bouquets.

Tableau 4. Des exemples de préparation de 10 ml d'une dose de 5 mg / ml de la solution de deux rapports différents de mélanges.

Tableau 5. Exemple de formulaire pour l'enregistrement de deux conséquencescutif de bouffées simples composants volatils à travers les antennes mâle et femelle.

Utilisation des enregistrements électroantennogramme comme un bio-essai pour déterminer les réponses chimioréception d'un insecte cible est assez commun et de nombreuses études utilisant des EAG comme un détecteur pour les effluents d'une chromatographie en phase gazeuse (GC-EAD) peut être trouvé dans la littérature. ^9,10 La méthode illustrée fournira un dépistage rapide de quantités équivalentes de composants volatils avec des réplications d'assignation d'confiant de la réactivité relative. Le programme AutoSpike dans le logiciel Syntech est un bon programme pour volatiles de dépistage car il est en mesure de fournir le signal de déviation maximale d'amplitude à partir des antennes (figures 1-3), dont nous présentons ici comme le "screening" de valeur. En outre, d'autres informations de base pour les semi-avancée d'utilisation (voir figure 4) peut être obtenu avec AutoSpike en fonction des paramètres de configuration et ce que le chercheur veut tirer de la réponse antennaire. Le GcEAD ou EagPro programmes Syntech sont appropriate pour des expériences les plus avancées ou pour les scientifiques connaissent la réponse électrophysiologique car des traces résultantes fournissent plus de détails sur l'évolution temporelle de la réponse de dépolarisation antennaire.

Avant le processus de sélection des composés détectés à partir d'une plante hôte, l'identification correcte des substances volatiles est importante et doit suivre des protocoles stricts. Si possible, deux colonnes GC de polarités différentes (c.-à-DB-Wax et DB-1) doit être utilisé pour l'identification des composants par l'intermédiaire initial correspondant des indices de rétention (RIS, voir tableau 1). La meilleure méthode consiste à vérifier l'identité de chaque volatile avec une authentification standard sur deux colonnes. ¹¹ Si l'identité de certains des composés n'est pas possible, l'élucidation de leur bioactivité peuvent encore être atteints par une utilisation de la GC-EAD ^12. Toutefois , la réplication de l'essai biologique peut être limitée en fonction de la méthode de collecte volatile, la quantité de l'analyte ne sera pas reaDily disponible sans un étalon interne, l'identité du composé ne sera pas immédiatement connue, et des essais ultérieurs dans les mélanges ne serait pas possible.

Si bien scellés et réfrigérés, des solutions de substances volatiles dans le pentane peut généralement être stocké pendant environ 1 semaine. Si les pipettes scellées contenant le disque chargé sont placés dans un sac zip-lock et réfrigéré, ils peuvent être stockés pendant environ 24 heures. Toutefois, nous avons trouvé qu'il vaut mieux charger les disques le matin des analyses EAG et jetez les restes des pipettes à la fin de la journée. Les doses pour les bouffées normalisées devraient être déterminées expérimentalement pour chaque espèce d'insectes si la littérature connexe n'est pas facilement disponible.

Formulation de mélanges est généralement un processus ardu. On voit ici quelques approches relativement simples, quoique non exhaustive. Les chercheurs sont encouragés à faire la lecture supplémentaires sur diverses techniques. Après l'évaluation de la responsab composants individuelses par les volatiles de la plante hôte a été réalisée, les études de mélanges peuvent être entrepris. Un exemple est l'utilisation des substances volatiles suscitant des réponses plus élevés par rapport au dépistage. D'autres exemples sont les suivants:. Combinaisons de quantités relatives émis, les ratios de réponses relatives par rapport aux quantités relatives, le tri par classe de composés volatils, ou des différences dans les stades phénologiques ou états différents des matrices (endommagé vs intact) ¹³

Les mélanges sont démontrées de simples combinaisons de ces différentes approches. La 01:01:01 est un mélange supérieur sur la base des réponses relativement élevées dans l'examen initial, mais aussi représente différentes classes de composés. Humulène est un sesquiterpène, 2-undécanone est un produit d'acide gras ventilation, et le 2-phényléthanol est un benzénoïde. Ces composés représentent les principales catégories de matières volatiles généralement vus dans les émissions des centrales. Le ratio de 01:02:04 dans le second mélange intègre les rapports relatifs des produits volatils détectés dusonner l'analyse par GC-MS. ⁴ Toutefois, l'utilisation de la SPME et GC-MS ne fournissent que des rapports relatifs et l'utilisation de l'analyse GC-FID en liaison avec les courbes d'étalonnage des classes de composés est recommandé pour un point plus précis de départ pour des rapports sur la base de matières volatiles détectées.

La technique EAG fourche électrode est l'une des méthodes les plus simples utilisés dans l'expérimentation électrophysiologique. ¹⁴ Le lecteur est encouragé à effectuer des recherches en outre la littérature pour les applications avancées au-delà de cette méthode. En outre, le dépistage des matrices ex situ peut être réalisée en utilisant la méthode démontrée, mais en utilisant de petites (60 ml) aux navires modifiés (figure 5) contenant des parties de plantes (par exemple, les amandes moulues). Lorsque vous utilisez des contenants plus grands (par exemple, 120 ml à couvercle navire avec des adaptateurs spéciaux pour une utilisation avec la pompe EAG), il est recommandé d'augmenter le débit pour assurer une bonne évacuation du conteneur. Une expérience should effectuer un contrôle positif où est placé dans le récipient pour assurer la stimulation appropriée est réalisé au débit nécessaire. L'utilisation d'une bouffée deux secondes pour les composants individuels n'est pas absolument nécessaire et bouffées de l'ordre de 0,5 à 1,0 secondes sont plus typiques. Cependant, elle permet de faciliter les comparaisons futures avec des bouffées de conteneurs bouquets volatils puisque ceux-ci exigent généralement une plus longue bouffée à des débits plus élevés. Nos laboratoires utilisent la bouffée deux secondes afin de comparer un seul composant et / ou des réponses mélange directement à l'aide de matrices de bouffées petits vaisseaux (voir Figure 5). La bouffée deux secondes sur ces petits bateaux assure l'évacuation complète du conteneur lorsque le débit approprié est mis.

En outre, l'acquisition d'une seconde bouffée peut être effectuée, mais la seconde bouffée n'est pas absolument nécessaire pour le dépistage, puisque le montant de la composante volatilisé n'est plus maintenu à une norme stricte (<forte> Tableau 5). Toutefois, cette information peut être utile pour toutes les suivantes dose-réponse des expériences ^15. Une réponse beaucoup plus faible peut indiquer une diminution de la réponse à de faibles concentrations tandis qu'une réponse cohérente peut indiquer la dose est près du seuil pour une réponse élevé. Il convient de noter qu'il existe d'autres explications physiologiques pour le changement dans les réponses ¹⁴ à la seconde bouffée, mais l'information ne aider à l'orientation pour de futures expériences. Si à haut débit n'est pas absolument critique, l'utilisation d'une deuxième bouffée de chaque composant peut être informatif.

Si les papillons femelles vierges sont l'échantillon ciblé, MAINTENANT larves dans le dernier stade ou de nymphes peuvent être sexés et séparés de ¹⁶ à permettre l'émergence des femmes à se produire dans des récipients séparés.

Ajustement de l'échelle peut être nécessaire de tenir compte de la réponse antennaire si elle dépasse l'échelle actuelle. Les écailles sur le logiciel EAG écran can aider à déterminer combien de mm par réponse microvolt. D'autres insectes peuvent varier dans leur sensibilité.

La méthode fournit une preuve facile à apprendre, rapide, fiable, et le protocole de criblage à haut débit afin de réduire le nombre de volatiles pour examen bioactivité de la composition complexe de substances volatiles de la plante hôte. Pourvu les antennes de l'échantillon sont adaptés, la méthode EAG fourche permet l'évaluation rapide de nombreux composants volatils ou des mélanges de composants, et la comparaison des réponses à celle d'un standard. Finalement, un nouveau test qui évalue l'activité du composant ou le mélange de composants dans un cadre champ est la méthode la plus valide. Cependant, des études de terrain sont souvent beaucoup de temps et de travail, coûteux, et nécessitent plusieurs mois pour obtenir des résultats corrects.