Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

1. Gösterim EAG için Konak Bitki gelen Tespit uçucu hazırlanması

1. GC-MS ile tüm uçucu uygun tanımlama ve kimlik doğrulama sonra, her mevcut uçucu EAG puf analizi gerçekleştirmek. Başlangıç ​​tarama süresinin kısa bir miktarda (Tablo 1) göreceli chemoreceptivity bir gösterge sağlamak için her bir cinsiyet antennal tepkilerin bir düşük kopyalayan numarası (N = 3-5) olabilir.
2. Pentan içinde 5 mg / ml konsantrasyonunda her uçucu bir çözeltisi hazırlayın. Sıkıca (örneğin, asetofenon, yoğunluğu = 1,03 g / ml, hacim = (0.005 g/1.03 g / ml) × 1.000 = 4.85 1.0 mL ölçülü balona asetofenon ile uL ve sulandırmak hemen kullanıma hazır olana kadar örnek mühür ve soğutmak 1,0 pentan ile mL).
3. Hemen önce EAG analizi için, test edilecek Uçucu maddeler arasında 5 mg / ml konsantrasyonda ihtiva eden şişeler kaldırmak ve oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verir. Bu arada, Pasteur pipetler için uygun sayıda etiketTest edilecek her uçucu ile korelasyon ve pipet ucu üzerinde parafilm küçük bir parça (yaklaşık 15 × 15 mm) sarın. Ilk tarama 10 uyaran pipetler için (N = 4, her erkek ve kadın için) kötü bir hazırlık ya da diğer öngörülemeyen bir engel halinde yüklenir.
4. Cımbız kullanılarak, yavaşça pipetle içine yerleştirilmesini kolaylaştırmak üzere ikiye katlamak bioassay diski, daha sonra kısmen ca böylece pipet ucu içine büyük katlanmış diski yerleştirin. Diskin 2-3 mm maruz kalmaktadır. Raf tutucu etiketli ve prepped pipetler hizalayın.
5. Bir pipet veya şırınga kullanılarak her diske uçucu solüsyon 10 L (50 mikrogram) yüklemek ve tam pipet içine diskleri takmadan önce geçmesi için 2 dakika bekleyin. Bir kez yüklenmiş, hemen parafilm (ca. 15 x 30 mm) ile, pipet ucu mühürlemek. Yüklenir ve kabarık olması uçucu teşvik miktarı en muhtemel böcek türleri ile değişecektir.
6. Aynı protokolü takiben yukarıda belirtildiği üzere kontroller hazırlamakHer bir analize içerir. Her diske sadece pentan negatif kontrol yükü 10 uL için, 2 dakika bekleyin etiketli pipet içine yerleştirin ve mühür. Pozitif kontrol için, disk üzerine 10 L (50 mg) yüklemek 2 dakika bekleyin, etiketli pipet içine yük ve parafilm ile mühür.
7. Böcek antennal prep yaşayabilirliği, büyük olasılıkla türler göre değişir, ama Amyelois transitella antenler tipik olarak tanımlanan protokol kullanılarak çıkarıldıktan sonra> 30 dakika için aktif kalması ve tutarlı bulduk. Bu kadar süre genellikle yukarı değerlendirilmek üzere 4-10 uçucu örnekleri için izin verecektir. Tablo 2 kez ve dizileri bir örnek sağlar.

2. Biyoassay EAG için Böcek Anten hazırlanması

1. Bu deneyin odak analizi EAG edilir; dolayısıyla, her araştırmacının uygun yetiştirilen böceklerin erişimi olacak varsayımı.
2. Bu deneme için biz ol 3-4 gün çalışıyor olacağımd, evlendirilen kız ve erkek güveler. Bireysel kelebekler küçük, kapaklı, plastik kap analiz gün aktarılır. Biyoassay hemen önce, test edilecek güve bir tutma aparatı (yani, çeşitli plastik pipet uçları yapılmış) ve arkasından güvenli bodoslama-ilk transfer edilir. Böceğin Manipülasyon eksizyonu kolaylaştırmak için düşük güçlü bir stereo-mikroskop altında görülebilir.
3. Anten bir tel uçlu aracını kullanarak dışarı alay edilir. Elektrot jeli küçük bir film ile çatal tutucu, antenlerin hızlı transfer için yakın yerleştirilir. İlk anten mikro makas kullanılarak çıkarıldı ve çatal üzerine yerleştirilir, antenin tabanı sağlanması çatal (kayıtsız toprak elektrot) of non-kırmızı bir kısmı üzerine yerleştirilir edilir. 10 dakika boyunca bir zamanlayıcı kümesi başlatıldı ve ikinci bir anten çatal aynı tarafta hem bazlar ile birinci antenin yanında çıkarıldı ve yerleştirilir.
4. Alternatif olarak, antenleri holdin içinde güvenli bırakılabilirg tüp çıkarılarak, sonra yavaşça tüp ve ucunda jel, orayı bir tel uçlu aracını kullanarak böcek arasındaki kaldırılır.
5. Anten tabanı ve ucu elektrot jeli dalmış emin olmak için kontrol ve kabarcık jel bulunmaz. Uçları / ipuçları elektrot jeli tam maruz garanti kesilmiş olabilir. Care her bir anten kalanı, böylece puf maruz maksimum antennal yüzey alanı garanti jeli ile kaplı emin olmak için kullanılmalıdır.
6. Prepped çatal sonra prob pre-amplifikatör içine yerleştirilir ve 200 ml / bekleme süresi 10 dakika kalan süre dakikada nemlendirilmiş sabit bir hava akışı altında tutulur. Hava / puf akış 2-3 mm yönlendirmek için ayarlanabilir olduğu zaman ve tüketim inisiyasyon kez EAG belirtilmiştir (Tablo 2) ve birinci uyaran puf önce 30 saniye, pozitif kontrol içeren pipetle sonuçlandırılmamış ve tutucu yerleştirilir antenler prepped.
7. Her exper sonraiment, testi güveler bir kuru buz ortamda ötenazi ve düzgün bir şekilde bertaraf edilmektedir.
8. Erkek kelebeklerin çiftleşme durumunu kontrol etmek için disseke edilir. Birlikte yaşayan erkek evlendirilen olduğu varsayılmaktadır.

3. Bireysel Bileşenleri için Protokol EAG

1. Antennal yanıtları Syntech EAG aleti ile birlikte AutoSpike yazılım aracılığı ile kaydedilir. EAG probu ile kanal için AutoSpike Özellikler sekmesindeki yapılandırma 106.7 bir örnekleme oranı, NO düzeltmek için ve 0-42 Hz bir filtre olarak belirlenmiştir. Filtre sekmesini için EAG filtre ON ve düşük kesme 0.1 Hz olarak ayarlanır.
2. Stimulus ponponları süresi 1-2 saniyedir. 1 dakika için ayarlanmış bir zamanlayıcı her nefeste sonra başlatılır.
3. Sonraki test uçucu pipet mühürsüz ve tutucu yerleştirilir. Randomize arasında, test uçucuların, dizisi, hiçbir test bileşikleri sürekli olarak başka bir test uçucu takip sağlamak için çalışır daha sonra takip eder (örneğin, Tablo 2) dikkatle allowiponponları arasındaki ng 1 dakika.
4. EAG yanıtları okuma kolaylığı sağlamak için, hükümdarlar kısımlarını bilgisayar ekranında yerleştirilir ve Çökmelerin sinyal apekse temel düzeyde mm ölçülen ve bir veri sayfası (yani, 5 mV ayarı için, 33 mm oturum = 2.5 mV). Yazılım gelecek analizi için kaydedilen kayıtların oynatma yeteneğine sahiptir. MV ya μV amplitüd birine mm arasında dönüşüm sonrası veriler analiz yapılır.
5. Son pozitif kontrol puf (örneğin, kayıt # 12) uygulandığında sonra, antenleri kaldırılır, çatal, etanol-doymuş silin ile temizlenir ve sonraki kullanımdan önce kurumaya bırakılır.
6. Tahlillerin verimi artırmak için, antenlerin sonraki bölümün çıkarılması yaklaşık 10 dakika güncel deney bitmeden ikinci bir laboratuvar personeli tarafından başlatılmış olabilir - Dördüncü puf sonra; mevcut Deneyin ikinci testi uçucu, Masa başı olarak 2. Bu fo sağlayacakr doğrudan geçerli deney bittikten sonra bir sonraki deney başlamadan.
7. Tekrarlamalı Yüksek sayısı (farklı antenler üzerine) daha ileri istatistiksel doğrulama sağlamak ilgi bileşikler üzerine yapılabilir.

4. Karışımlar veya Diğer Matrisler EAG Analizi Örneği (Tablo 3)

1. Sonra, iki üçüncül karışımları (3-bileşenli karışımları) için hacim oranları ve yüksek EAG tepkileri (Tablo 4) eliciting uçucuların birleştiren bir örneği sağlamak için hesaplanır. Daha sonra 2-phenylethanol ve 01:02:04 ikinci bir karışım oranı ile karşılaştırarak: 2-undecanone: hesaplamalar bazı temel oranları, α-humulene bir 01:01:01 molar oranı içindir.
2. Benzer protokolleri kullanarak daha önce, karışım hazırlanır ve etiketli Pasteur pipetler gerekli pozitif ve negatif kontrollerle birlikte yüklenir tarif edilir.
3. Uçucu örnekleri ve erkek antenler arasında kabarık ve yanıtları ölçülür ve oturumbir veri sayfası (Tablo 3).

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Kadın göbeği orangeworm için aşağıdaki ayarları kullanılır: 2 saniye ponponları, 10 saniyelik kayıt süreleri, 10 saniyelik penceresi ve 5 mV ölçek. Negatif bir sapma tipik tepki, henüz mutlak değeri (örneğin, -3400 μV saptırma 3,400 μV olarak kaydedilir) kaydedilir. Pozitif kontrol için hazırlık A nispeten zayıf tepki atılır. Şekil 1 göbek orangeworm tarafından pozitif kontrol yanıtı zayıf bir grafiksel bir temsilini sağlar.

Zayıf bir kontrol sonucu Örneğin, asetofenon için ortalama kadın antennal tepkisi tipik olarak ca. 2.600 μV (Şekil 2), hazırlık sadece ca bir yanıt verseydim. 1.300 μV atılır ve antenler başka bir çift prepped olacaktır. Benzer şekilde, ortalama bir erkek tepkisi (Z, Z) -11,13-hexadecadienal typicall idiy 3000 μV, bu yüzden, herhangi bir yanıt az 1.500 'den μV tipik olarak atılmıştır.

Her bir deney başlamadan ve sonunda da pozitif kontrol antenler durumu ile ilgili bilgi sağlar. Sonrası kontrolü (kayıt # 12, Tablo 2) puf için antennal yanıtı öncesi kontrol ^1. puf (kayıt # 1 az% 75 ya eğer biz hızlı bir tarama için takip etmeniz gereken bir kuraldır Tablo 2) ya da ön-kontrolü (kayıt # 2, Tablo 2) daha sonra deney (Şekil 3) bağlı prep olası degradasyona veri analizi kullanılan değildir ve ^2. puf daha azdır. Başparmak ilk kuralı bir örneği kayıt # 1 olurdu = 2,730 μV ve kayıt # 12 = 1.680 μV ve başparmak ikinci kural varsa, bu durumların her birinde kayıt # 2 = 2.350 μV ve kayıt # 12 = 1.680 μV, , hazırlık ve deney sonuçlarını iptal olacaktır.

Aolarak pozitif kontrol için ölçülen EAG yanıt değerleri düzeltmek temsili örnek aşağıdaki gibi olacaktır.

Bir N = 3 deneyi için yukarıda değerleri kullanılarak, negatif kontrol tepkisi negatif kontrol mekanik puf ve artık çözücü için taban antennal tepkisi olduğu varsayımını altındaki her bir deney içindeki her bir değeri çıkarılır.

Her bir deney için pozitif kontroller sonra ortalama ve 1,000 μV için düzeltme oranı belirterek, 1000 μV için düzeltilmiş olacaktır. Bir veri sayfası (örneğin, Excel) kolay kullanılabilir veri yanıtları dönüştürmek için manipüle edilebilir.

Her deney içinde düzeltme oranı ile çarpılması, bileşik için değerler A ve bileşik B daha sonra ayarlanır.

Her bileşik için ortalamalar (vasıtası) daha sonra daha sonra değerlendirilebilir test bileşikleri için diğer ilgili veriler ve istatistiksel EAG yanıtları ile birlikte belirlenendaha fazla araştırma için adaylığı için.

Şekil 1. Antenleri olduktan sonra fakir antennal tepkisi nedeniyle iptal olacağını ön kontrol ^(1. Pozitif kontrol puf) için erkek antennal yanıt (1,180 μV) Temsilcisi EAG jel ile iyi temas var. Alt pencereler Mavi bar uçucu iki ikinci puf temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Trong> Şekil 2. için kadın antennal yanıt (3,400 μV) Temsilcisi EAG ^1. puf uygun olarak düşünülebilir ön kontrolü. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3. Kadın antennal yoksul olarak düşünülebilir sonrası kontrolü yanıt (1,680 μV) (her bir deney için son pozitif kontrol) ve antenleri bozulması (<75 ^1. ön kontrol veya% <düşündüren Temsilcisi EAG öncesi kontrol ^2. puf değer). Bu örnek için ^1. ön kontrol puf ön kontrol puf 2.350 μV oldu 2,730 μV ve ^2. oldu. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

"dflinebreak>
Şekil 4. Bir aday uçucu harmanından puf için dişi antennal yanıt (3800 μV) ve en çok başlangıç ​​saptırma (3800 μV), puf süresi sırasında ilk eğimi (daha sonraki ölçümler için EAG Örnek 0,3 s/1.2 mV = 0.25 s / mV) ve kalan puf süre için eğim (1.6 s/1.9 mV = 0.84 s / mV). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Örnek bir matris ve ilişkili uçucu içeren Şekil 5. Küçük modifiye gemi A. arasında söndürdü edilecek transitella antenler.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
Tablo 1. Autospike programında farklı ve daha az duyarlı yapılandırması tarafından belirlenir Nonpareil badem (2007) ve EAG yanıtları yerinde uçucu emisyon olarak.

Tablo 2. Bireysel uçucu bileşenleri, kadın ve erkek antennal yanıtları kaydetmek için bir form örneği.

Tablo 3. Uçucu karışımları ve / veya buketleri, kadın ve erkek antennal yanıtları kaydetmek için bir form örneği.

Tablo 4. Karışımları, iki farklı oranları için, bir 5 mg / mL çözelti 10 mL hazırlama örnekleri.

Tablo 5. Ve erkek anten üzerinden tek uçucu bileşenlerin üst üste iki ponponları kayıt formu örneği.

Bir hedef böcek chemoreception yanıtları belirlemek için bir biyoassay olarak electroantennogram kayıtların kullanın gaz kromatogramı (GC-EAD) gelen atık için bir dedektör olarak EAG kullanan çalışmaları literatürde bulunabilir oldukça yaygın ve çok sayıda olduğunu. ^9,10 yöntemi gösterdi göreceli yanıt emindir atama için yüksek tekrarlı olarak uçucu bileşenlerin eşdeğer miktarda hızlı bir tarama sağlayacaktır. Biz "tarama" değer olarak burada mevcut antenlerden maksimum sehim genlik sinyal (Şekil 1-3), verebilmektedir yana Syntech yazılım AutoSpike programı tarama uçucular için iyi bir programdır. Ayrıca, yarı-gelişmiş kullanım için diğer temel bilgiler (bkz. Şekil 4) AutoSpike yapılandırma ayarlarını ve ne araştırmacı antennal yanıt türetmek istiyor bağlı olarak elde edilebilir. GcEAD veya EagPro Syntech programları uygulaması vardırçıkan izleri antennal depolarizasyon yanıt zaman tabii daha ayrıntılı sağladıklarından dolayı daha ileri deneyler için veya elektrofizyolojik yanıtları aşina bilim adamları için uygun olur.

Bir ana bitkiden tespit bileşiklerin tarama işlemi öncesinde, uçucu maddeler arasında uygun bir şekilde tanımlanması önemlidir ve sıkı protokolleri uymalıdır. Mümkünse, polarite (yani, DB-Wax ve DB-1) farklı iki GC sütun retansiyon indeksi (RI, bkz. Tablo 1) eşleştirilmesi yoluyla ilk bileşeni tanımlanması için kullanılmalıdır. En iyi yöntemi, bir, iki sütun üzerinde standart kimlik her uçucu kimlik doğrulama etmektir. ¹¹ bileşiklerin bazılarının kimlik mümkün olmadığı durumlarda, bu biyoaktivitesi aydınlatılması halen GC-EAD bir kullanımı ile elde edilebilir. ¹² Ancak , bioassay ile replikasyon uçucu toplama yöntemine bağlı olarak sınırlı olabilir, analitin miktarı rea olmayacakbir iç standart olmadan Dily'dan mevcut, bileşik kimliğini hemen bilinen olmayacak ve harmanlarda sonraki testleri mümkün olmazdı.

Düzgün bir şekilde kapatılır ve buzdolabında ise, pentan içinde uçucuların çözeltileri genel olarak yaklaşık 1 hafta boyunca saklanabilir. Yüklenen disk içeren mühürlü pipetleri bir zip-lock çanta yerleştirilir ve buzdolabında ise onlar hakkında 24 saat saklanabilir. Ancak, biz diskler EAG analizlerin sabah yüklemek ve düzgün bir günün sonunda artık pipetleri kurtulmak için en iyi bulundu. Ilgili literatür hazır değilse standart ponponları Dozajları her böcek türü için deneysel olarak belirlenmelidir.

Karışımları formülasyonu tipik olarak zorlu bir işlemdir. Kapsamlı olmasa da, bazı görece basit yaklaşımlar, burada gösterilen vardır. Araştırmacılar, çeşitli tekniklerle ilgili daha fazla okuma yapmak için teşvik edilir. Bireysel bileşeni düzelen değerlendirilmesi sonucundakonukçu bitki uçucu gelen es yapılmıştır, karışımlar çalışmaları yapılabilir. Bir örnek, eleme den daha yüksek bağıl yanıtları eliciting Uçucu maddeler kullanılarak edilir. Diğer örnekler şunlardır:. Yayılan göreceli miktarları ile kombinasyonları, bileşikler sınıfına göre sıralama göreceli miktarları karşı göreceli yanıtları, veya fenolojik aşamaları ya da matrisler çeşitli devletler (hasar vs hasarsız) uçucu farklılıklar oranları ¹³

Gösterdi karışımları bu çeşitli yaklaşımların basit kombinasyonlar vardır. 01:01:01 başlangıç ​​taramasında görece yüksek yanıtları dayanan bir tersiyer karışımı, aynı zamanda, çeşitli bileşiklerin sınıflarını temsil ederler. Humulene bir seskiterpen olup, 2-undecanone, bir yağlı asit bozulma ürünü olup, 2-phenylethanol bir benzenoid olup. Bu bileşikler tipik olarak bitki emisyon görülen Uçucu maddeler arasında büyük sınıfları temsil eder. Ikinci bir karışım içerisinde 01:02:04 oranı du tespit Uçucu maddeler arasında nispi oranları içermektedirGC-MS analizi halka. ⁴ Bununla birlikte, SPME ve GC-MS kullanılarak sadece nispi oranları ve bileşiklerin sınıflarının kalibrasyon eğrileri ile birlikte GC-FID analizi kullanım oranları için daha hassas bir başlangıç ​​noktası için tavsiye edilir sağlamak tespit uçucuların dayalı.

Çatal elektrot EAG tekniği elektrofizyolojik deney kullanılan daha basit yöntemlerden biridir. ¹⁴ okuyucu bu yöntemi ötesinde gelişmiş uygulamalar için başka literatür araştırması gerçekleştirmek için teşvik edilmektedir. Buna ek olarak, eski in situ matrislerin eleme göstermiştir yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir, fakat bitki parçaları (örneğin, öğütülmüş badem) ihtiva eden küçük (60 mL) modifiye kaplar (Şekil 5) kullanılarak yapılabilir. Büyük konteynerler (örn., EAG kirpi ile kullanım için özel adaptörler ile 120 ml kapaklı damar) kullanırken, konteyner uygun tahliye sağlamak için akış hızı artırmak için önerilir. Bir deney omuzBir pozitif kontrol uygun bir uyarılma gerekli akış hızında elde edilir sağlamak için kap içinde yerleştirildiği d gerçekleştirilebilir. Münferit bileşenler için bir iki saniyelik puf kullanımı kesinlikle gerekli ve ponponları 0,5 ile 1,0 saniye sırası hakkında daha fazla tipik değil. Ancak bu genellikle daha yüksek akış hızlarında daha uzun bir puf gerektiren bu yana konteynerle uçucu buketleri puf ile daha kolay gelecek karşılaştırmaları için izin vermiyor. Bizim laboratuarları küçük damarlarda matrisler (bkz. Şekil 5) kullanarak ponponları doğrudan tek bileşen ve / veya karışım cevapları karşılaştırmak amacıyla iki ikinci puf kullanmaktadır. Bu küçük damarlar üzerinde iki ikinci puf uygun akış hızı ayarlanır kabın boşaltımı sağlar.

Ayrıca, ikinci bir puf edinimi Ancak ikinci puf uçucu bileşen miktarı beri taranması için kesinlikle gerekli değil, yapılabilir artık <sıkı bir standart (tutulurstrong> Tablo 5). Ancak, bu bilgileri herhangi bir sonraki doz-yanıt deneyler için değerli olabilir. Tutarlı bir yanıt dozu yüksek bir tepki için eşik yakın gösterebilir iken ¹⁵ daha düşük bir yanıt düşük konsantrasyonlarda bir azalma tepki gösterebilir. Bu ikinci puf için ¹⁴ yanıtlarında değişiklik için diğer fizyolojik açıklamaları vardır unutulmamalıdır, ancak bu bilgiler ileride deneyler için rehberlik yardımcı yoktur. Yüksek verim kesinlikle önemlidir değilse, her bir bileşenin bir ikinci püskürtmesindeki kullanımı aydınlatıcı olabilir.

Bakire dişi kelebekler hedeflenen örnek ise, ŞİMDİ son dönem larva veya pupa da ölçülerinden ve kadın ortaya çıkması ayrı kaplarda meydana sağlamak için ¹⁶ ayrı olabilir.

Ölçek ayarlanması da mevcut ölçekli aşarsa antennal tepkisi yerleştirmek için gerekli olabilir. EAG yazılım ekranı ca ölçeklern μV yanıt başına kaç mm belirlenmesinde yardımcı olur. Diğer böceklerin hassasiyeti değişebilir.

Gösterdi yöntemi ana bitkinin uçucu karmaşık kompozisyon biyoaktivite değerlendirilmek üzere uçucu sayısını azaltmak için, öğrenmesi kolay, hızlı, güvenilir ve yüksek verimli tarama protokolü sağlar. Uygun numune antenleri şartıyla, çatal EAG yöntemi çok sayıda uçucu bileşenlerin veya bileşenlerin karışımlar ve standart bir o kadar yanıtlarının karşılaştırılması hızlı bir değerlendirmesini sağlar. Sonuçta, bir alanın bir ortamda bir bileşen veya bileşenlerin karışımı aktivitesi değerlendirir bir bioassay en geçerli bir yöntemdir. Ancak, saha çalışmaları genellikle çok zaman ve emek pahalı, alıcı olan ve doğru sonuçlar elde etmek için birden fazla ay gerektirir.