Развитию облитерирующего бронхиолит в мышиной модели ортотопической трансплантации легких

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).

Ортотопической трансплантации легких у крыс было впервые сообщено Asimacopoulos и его коллеги в 1971 году ^1. В настоящее время этот метод хорошо приняты и стандартизированы не только для изучения алло-отказ, но и между сингенных штаммов для изучения механизмов ишемии-реперфузии после трансплантации легких. Хотя применение крыс и других крупных животных ² модели внесли значительный вклад в выяснение этих исследований, объем этих исследований ограничены нехваткой нокаут и трансгенных крыс. Благодаря нет эффективных методов лечения для облитерирующего бронхиолита, ведущей причиной смерти у пациентов пересадка легкого, наблюдается интенсивный поиск доклинических моделях, которые копируют облитерирующего бронхиолита. Трахеи модели аллотрансплантата является наиболее широко используемым и может воспроизводить некоторые гистологические особенности облитерирующего бронхиолита ^3. Тем не менее, отсутствие нетронутыми vasculatЮр, не имеющих отношения к проведению дыхательных путей получателя, и неполное патологические признаки облитерирующего бронхиолита ограничивает полезность этой модели ^4. В отличие от трансплантации других солидных органов, сосудистой трансплантации легких мышей только недавно сообщили Окадзаки и его коллеги впервые в 2007 году ^5. Применение основных принципов по трансплантации легких крыс, наша лаборатория приступила к облитерирующего бронхиолита модель использования незначительных histoincompatible антигена мышиные ортотопической одного левого легкого трансплантации, которая позволяет в дальнейшем изучении облитерирующего бронхиолита иммунопатогенезе ^6.

1. Донор процедура

1. Все хирургические процедуры выполняются с использованием стерильной техники. Нет антибиотики даются донора и реципиента мышей.
2. Индукция анестезии доноров мыши начинается с 5% Изофлюран.
3. Мышь orotracheally интубированных с 20 калибра внутривенный катетер, а затем помещают на грызунах вентилятора, с использованием 100% кислорода в размере 125 вдохов / мин и примерно 0,5 мл дыхательного объема (2% от массы тела).
4. Анестезия поддерживается с вдыхаемым 1-2% Изофлюран.
5. Донорами мышь находится в лежачем положении, нацелен на 70% спирте.
6. Laparosternotomy выполнена в виде комбинированной линии и поперечный разрез.
7. Гепарин 100 ЕД / кг вводят в нижнюю полую вену (НПВ), с чуть ниже печени.
8. Диафрагму разрезают вдоль брюшной реберной привязанность к позвоночнику и грудной полости подвергается, сокращая обе стороны грудистены на шее.
9. После надрезание IVC на уровне диафрагмы, в правом предсердии придаток режется и легкие промыть 2 мл охлажденной (4 ° С), лактата Рингера впрыском и 0,1 мл гепарина через поперечный разрез в корне легочной артерии ( PA) ствола.
10. Арест вентиляции на две трети в конце выдоха инфляции, сердца и легких блоков вырезали и хранили на льду (4 ° С).
11. Легких донора левой готовится к получателю крепления манжеты. Легочной связки вырезается до легочных вен (PV). Рубчик выносится на удаление пищевода и аорты.
12. Определить ПА, расположенной на самой черепной аспект воротах, а также прилагаемые главного бронха (Br). Тщательно анализировать ПА из бронхов.
13. PA манжета из 24 калибра внутривенное (IV) катетер и сократить до 0,5 мм в длину с расширением 0,7 мм.
14. Вся поверхность манжеты затем прошлифовать для облегчения anastoMOSIS.
15. Манжета для бронхов происходит от 20 калибра катетер, и нарезать длиной 1,0 мм с расширением 0,7 мм.
16. Используя те же материалы, манжеты PV меняется в зависимости от веса донора мыши. В частности, для мышей 24-27 граммов манжеты размер составляет 22 калибра 0,7 мм в длину 0,7 мм расширением. Для мышей весом 27-32 грамм, исследования использовали 20 калибра катетер, который составляет 0,7 мм в длину 0,7 мм расширением.
17. Манжеты вставляются в дистальных концов ПА, ПВ и Br и закрепляется 9-0 шва.
18. Донор легких покраснел и промывают стерильным физиологическим раствором с гепарином стерильной перед хранением. Донор легких затем обматывают стерильной марлей, смоченной в стерильном физиологическом растворе на льду (4 ° С), который держит легких очень чисто и стерильно.
19. Зажим микрососудов находится на бронхи, чтобы предотвратить вступление лактата Рингера в дыхательные пути.

2. Получатель процедур

1. Индукция ANESанестезии и искусственной вентиляции легких такие же, как описано выше доноров.
2. Левая стена грудь побрился и нацелен на 70% спирте и хирургического поля задрапированы.
3. Торакотомия разрез в левой третьего межреберья, расширяя разрез сверху близко к позвоночнику, и микрососудов зажим Расположенные слева легочных сосудов и бронхов, прилегающих к сердцу. Вы можете видеть, PA в черепной аспект, PV на хвостовом конце воротах и ​​Br между ними.
4. Использование нежной тяги на кровоостанавливающего, чтобы вызвать легкое напряжение на ПА, Br и PV, левого легкого вырывается из грудной полости, оставляя центральных структур грудной зажаты.
5. ПА, ПВ и Br изолированы от тупой диссекции следует поместить 9-0 шов расположен свободно вокруг ПА, ПС и Br.
6. После вскрытия ПА полностью от адвентиции влагалища, небольшой поперечный разрез приблизительно 1/4 окружности судна являетсясделано в передней стенке, в результате чего продолжение спинной части артерии нетронутыми.
7. Донор легких, завернутый в холод, лактата Рингера пропитанной хлопковой марли и получали, как описано выше, то положение в грудной полости, и манжет вставлена ​​получателя ПА, ПВ и Br и закрепляется 9-0 шва.
8. Грудной зажим крест удален позволяет реперфузии и вентиляции.
9. После размещения трансплантированных легких обратно в получатель грудной клетки, торакотомия разрез закрыт с помощью 5-0 шва.
10. Мышь имеет право взыскать с анестезией. Бупренорфин (0,05-0,15 мг / кг) вводят сразу после операции, и каждые 8 ​​часов в течение 2-3 дней после операции.

3. Представитель Результаты

Наш опыт учит нас, что он требует нескольких месяцев повторяют практику, чтобы стать специалистами в пересадке легкого модель мыши. После того, как знание достигается, мыchieved 96% (96/100 последовательных операций) периоперационной выживаемость при смерти, происходящих в течение семи дней после операции. Две смерти были связаны с кровотечением, которое началось во время операции, и pneumothraces были причиной смерти в двух других мышей. Для всех процедур, теплое время ишемии 14,32 ± 3,14 минут, а холодное время ишемии 58,51 ± 18,06 минут. Три группы ортотопической трансплантации легких изучали: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, аллотрансплантата: C57BL/10 → C57BL / 6 и C57BL / 6 → C57BL/10. Мы использовали только самцов мышей, но наш метод может быть также применен к самкам мышей, потому что нет никаких существенных анатомических различий между полами.

Классификация отказа патология была проведена в слепым методом с использованием стандартных критериев для клинической трансплантации легких ⁷ (табл. 1). В то время как наблюдается легкая или не отказ в isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), как аллотрансплантат комбинации разработанных компаниямиРабле острого или хронического отторжения (рис. 1). В отличие от ОВ достоверно чаще в C57BL/10 → C57BL / 6, чем C57BL / 6 → C57BL/10 группы day28 (табл. 1).

Таблица 1. Гистологическое оценки острого отторжения и распространение облитерирующего бронхиолита после пересадки. Скоринг острого отторжения ("A" результаты) с помощью стандартных критерияteria, как описано в представительные результаты. Данных представляет собой среднее ± стандартное отклонение "А" результаты на дней 28 после трансплантации. Данные представляют количество и процент мышей в каждой группе, которая разработала Б. в дни 21 и 28 после трансплантации.

Рисунок 1. Макроскопические выводы и гистопатология через 28 дней после трансплантации легких. Группа 1А представляет макроскопических выводы и H & E окрашенных легких Isograft и право наивно легких. 1В и 1С группа представляет собой H & E и трехцветного окрашенных Массона BL/10 легких аллотрансплантата пересаживают в BL / 6 мышей получателя, который разработал О. и не О.Б., соответственно. Белая стрелка указывает 1B поражений ОВ. Группа 1D показывает BL / 6 легких аллотрансплантата пересаживают в BL/10 мыши получателя.

Главная устранения неисправностей во время процедуры были следующими.

1. Кровоток расстройства: Флеш легких донора доцвет становится белого цвета. Использование избыточного давления может вызвать отек легких. Но не давите слишком сильно, чтобы предотвратить отек после пересадки.
2. Сложность манжеты вставки в доноры: Удостоверьтесь, что сосудистая имеет достаточную длину и бесплатно прилагается жира и соединительной ткани.
3. Кровотечение на месте анастомоза: Используйте Q советы, чтобы оказать давление на пораженный участок в течение приблизительно 5 минут.
4. Получатель ПА кровоток препятствия: в основном вызвано кручение в манжете вставки. Если воздух наблюдается в ПА повторно делать анастомоза необходимо.
5. Трудно анастомоза PV: PV Мембрана очень тонкая и легко слез. Выберите нужный размер манжеты и вставить прямо в PV получателя очень мягко.
6. Получатель PV кровотока препятствие: Убедитесь, что положение и направление манжеты. Отпустите сжатия от бронхиальной манжеты.
7. Пневмоторакс: Это может быть вызвано либо бронхиальной перфорации из-за manipulatioп дыхательных путей, или перфорация поверхности легких из-за травмы связаны с процедуры трансплантации. В первом случае лечение с хирургическим закрытием отверстия в стене дыхательных путей, а это последнее трактуется oversewing утечки на поверхность с помощью легких 10-0 нейлона шва.

Ортотопической трансплантации легких у мышей является сложной задачей в связи с микрохирургической требования и чрезвычайная хрупкость тканей. Введение в манжету техники позволило широко распространенное использование ортотопической трансплантации легких у крыс ^8. Это стало основой для разработки модели ортотопической трансплантации легких у мышей, в нашей лаборатории. У мышей и крыс, в отличие от людей, левого легкого содержит только одну долю и составляет лишь 25% от общей массы легких. Это делает левая одной трансплантации легких возможно в мышиной модели без системы поддержки кровообращения.

Наши предварительные операции выяснилось, что вентиляция и кровоснабжение пересаженных легких в значительной степени зависит от размера PV анастомоза. Конкретные PV анастомоза Размер манжеты были использованы в соответствии с донорами и получателями, как сообщил ^9. Несоответствующий манжета размера в результате либо ателектаз трансплантированных легких или зияние в PV anastomosis. Окадзаки и др. сообщили об использовании комбинированных перевязки сосуда и отсечения бронха ^5. В настоящем исследовании мы используем аневризмы клип для всех внутригрудных структур, которые мы предлагаем может сократить теплой ишемии. Одним из ограничений ортотопической трансплантации левого легкого в мышиной модели является то, что получатель животные могут выжить после аллоимунный опосредованного некроз их аллотрансплантатов ^5. Таким образом, выживание исследований не представляется возможным и взяточничества оценка зависит от гистологического исследования пересаженных легких ^10.

Используя эту технику, мы разработали модель доклинических облитерирующего бронхиолита у мышей. В частности, доноры мыши C57BL/10 и получатель C57BL / 6. Это говорит о роли несовершеннолетнего, а не основной, гистосовместимости антигенов в патогенезе облитерирующего бронхиолита ^6. Кроме того, мы уже сообщали нейтрализации IL-17 позволяет облитерирующий бронхиолит в мышиной модели. Этот режимл представляет собой новый инструмент исследования для изучения трансплантации легких и улучшения клинической трансплантации легких.

Нет конфликта интересов объявлены.

Источники финансирования: Эта работа поддерживается Национальным институтом здравоохранения грантов HL067177, HL096845 и P01AI084853 в DSW

1. Asimacopoulos, P.J., Molokhia, F.A., Pegg, C.A., & Norman, J.C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585, (1971).
2. Yoshida, S., et al. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
3. McDyer, J.F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
4. Sato, M., Keshavjee, S., & Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
5. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
6. Fan, L., et al. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
7. Stewart, S., et al. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
8. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., & Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
9. Jungraithmayr, W.M., Korom, S., Hillinger, S., & Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
10. Li, W., et al. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., (2010).

1 Comment

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.