Obliterative bronchiolitis के विकास Orthotopic फेफड़े प्रत्यारोपण के एक murine मॉडल में

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).

पहले चूहों में orthotopic फेफड़ों प्रत्यारोपण और Asimacopoulos 1971 ¹ में उनके सहयोगियों द्वारा सूचना मिली थी. वर्तमान में, इस विधि अच्छी तरह से स्वीकार कर लिया है और न केवल allo अस्वीकृति के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी फेफड़ों प्रत्यारोपण के बाद ischemia-reperfusion की चोट के तंत्र की जांच के लिए syngeneic उपभेदों के बीच मानकीकृत है. हालांकि चूहे और अन्य बड़े जानवर ² मॉडल के आवेदन के इन अध्ययनों की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया, उन की जांच के दायरे से पीटा और ट्रांसजेनिक चूहों की कमी के द्वारा सीमित है. Obliterative श्वासनलिकाशोथ, फेफड़ों के प्रत्यारोपण के रोगियों में मृत्यु के प्रमुख कारण के लिए कोई प्रभावी उपचार के कारण, वहाँ पूर्व नैदानिक ​​मॉडल है कि obliterative श्वासनलिकाशोथ को दोहराने के लिए एक गहन खोज कर दिया गया है. सांस की नली allograft मॉडल सबसे व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है और histopathologic obliterative ³ bronchiolitis के सुविधाओं के कुछ पुन: पेश कर सकते है. हालांकि, एक अक्षुण्ण vasculat की कमीप्राप्तकर्ता का आयोजन वायुमार्ग, और obliterative bronchiolitis के अधूरा वैकृत सुविधाओं के साथ कोई संबंध नहीं उरे इस ⁴ मॉडल की उपयोगिता की सीमा. अन्य ठोस अंगों के प्रत्यारोपण के विपरीत, vascularized माउस फेफड़ों प्रत्यारोपण हाल ही में ⁵ 2007 में पहली बार के लिए किया गया है Okazaki और उनके सहयोगियों द्वारा रिपोर्ट. चूहा फेफड़ों प्रत्यारोपण के बुनियादी सिद्धांतों को लागू करने, हमारी प्रयोगशाला obliterative bronchiolitis के मॉडल मामूली प्रतिजन histoincompatible murine orthotopic एकल - बाएँ फेफड़ों प्रत्यारोपण जो की obliterative श्वासनलिकाशोथ ⁶ immunopathogenesis आगे के अध्ययन की अनुमति देता का उपयोग शुरू की.

1. दाता प्रक्रिया

1. सभी शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं बाँझ तकनीक का उपयोग किया गया. कोई एंटीबायोटिक दवाओं दोनों दाता और प्राप्तकर्ता के चूहों को दिया जाता है.
2. दाता माउस के संज्ञाहरण की प्रेरण Isoflurane 5% के साथ शुरू की है.
3. माउस orotracheally एक 20 गेज नसों में कैथेटर के साथ intubated है और फिर एक कृंतक वेंटीलेटर पर रखा, 125 साँस / मिनट और लगभग 0.5 मिलीग्राम ज्वार मात्रा (अपने शरीर के वजन के 2%) की दर में 100% ऑक्सीजन का उपयोग कर.
4. यह संज्ञाहरण साथ साँस 1-2% Isoflurane बनाए रखा है.
5. दाता माउस एक लापरवाह स्थिति में रखा गया है, 70% शराब के साथ तैयार है.
6. Laparosternotomy एक संयुक्त midline और अनुप्रस्थ चीरा के रूप में किया जाता है.
7. 100 / u किलो पर हेपरिन अवर रग Cava (IVC) में इंजेक्ट किया जाता है, जिगर बस के नीचे से.
8. डायाफ्राम रीढ़ की ओर उदर तटीय लगाव के साथ कट जाता है, और वक्ष गुहा छाती के दोनों पक्षों के काटने से अवगत कराया हैगर्दन के लिए दीवार.
9. डायाफ्राम के स्तर पर IVC के incising के बाद, सही आलिंद उपांग और कटौती ठंडा के 2 मिलीग्राम के साथ फेफड़ों प्लावित (4 डिग्री सेल्सियस) Lactated घंटी और फुफ्फुसीय धमनी की जड़ (अनुप्रस्थ चीरा के माध्यम से हेपरिन की 0.1 मिलीग्राम इंजेक्शन फिलीस्तीनी अथॉरिटी) ट्रंक.
10. अंत ज्वार मुद्रास्फीति के दो तिहाई पर वेंटिलेशन गिरफ्तार, ब्लॉक दिल फेफड़ों excised और बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर संग्रहीत.
11. दाता बाएं फेफड़े में कफ की कुर्की द्वारा प्राप्तकर्ता के लिए तैयार है. फेफड़े के बंधन पल्मोनरी शिरा (पीवी) के लिए छिन्न है. नाभिका हटाने घुटकी और महाधमनी से बाहर लाया जाता है.
12. फिलीस्तीनी अथॉरिटी, नाभिका की सबसे कपाल पहलू पर स्थित है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संलग्न मुख्य श्वसनी (Br) को पहचानें. श्वसनी से पीए ध्यान से काटना.
13. पीए कफ एक 24 गेज अंतःशिरा (चतुर्थ) कैथिटर से बना है और 0.7 मिमी की एक विस्तार के साथ लंबाई में 0.5 मिमी की कटौती.
14. कफ की पूरी सतह तो anasto की सुविधा abradedmosis.
15. श्वसनी के लिए कफ एक 20 गेज चतुर्थ कैथेटर से ली गई है, और 0.7 मिमी की एक विस्तार के साथ 1.0 मिमी की लंबाई में कटौती.
16. एक ही सामग्री का उपयोग, पी.वी. कफ के दाता माउस के वजन के साथ बदलता रहता है. विशेष रूप से, चूहों के लिए 24-27 ग्राम कफ आकार 22 गेज, एक 0.7 मिमी विस्तार के साथ लंबाई में 0.7 मिमी है. 27-32 ग्राम वजन चूहों के लिए अध्ययन 20 गेज कि 0.7 मिमी एक्सटेंशन के साथ लंबाई में 0.7 मिमी है एक कैथेटर का उपयोग.
17. कफ पीए पी.वी., और Br के बाहर छोर में डाला जाता है और एक 9-0 सीवन के साथ सुरक्षित है.
18. दाता फेफड़ों प्लावित है और भंडारण से पहले बाँझ हेपरिन साथ बाँझ खारा साथ धोया. दाता फेफड़ों तो बाँझ बर्फ बाँझ खारा में भिगो धुंध (4 डिग्री सेल्सियस) है, जो फेफड़ों के बहुत साफ है और बाँझ रहता है के साथ लिपटे है.
19. एक microvessel दबाना के श्वसनी पर रखा गया है के लिए airway में Lactated घंटी प्रविष्टि को रोकने के लिए.

2. प्राप्तकर्ता प्रक्रिया

1. Anes की प्रेरणथेसिया और यांत्रिक वेंटीलेशन ऊपर दाता के लिए वर्णित के रूप में वही कर रहे हैं.
2. बाएं सीने दीवार मुंडा और 70% शराब और शल्य चिकित्सा क्षेत्र लिपटी है के साथ तैयार है.
3. एक thoracotomy चीरा बाईं तीसरे पसलियों के बीच अंतरिक्ष में किया जाता है, पीछे की ओर रीढ़ की हड्डी में करीब चीरा, और एक microvessel बाएँ फेफड़े वाहिकाओं और दिल को निकट श्वसनी पर रखा दबाना का विस्तार. आप उन दोनों के बीच नाभिका और Br की दुम का अंत में पी.वी. कपाल पहलू पर पीए, देख सकते हैं.
4. Hemostat पर सौम्य कर्षण का प्रयोग पीए Br, और पी.वी. पर हल्के तनाव के कारण, बाएं फेफड़े वक्ष गुहा से बाहर खींच लिया है, जबकि छोड़ने के केंद्रीय hilar संरचनाओं clamped.
5. पीए पी.वी., और Br हैं कुंद 9-0 सीवन शिथिल पीए पी.वी., और Br के आसपास तैनात रखने के बाद विच्छेदन के द्वारा अलग कर रहे हैं.
6. पीए इसके बाह्यास्तर अथवा किसी अंग की बनावट के बाहरी आवरण संबंधित म्यान, पोत परिधि के लगभग एक चौथाई एक छोटे से अनुप्रस्थ चीरा से पूरी तरह से विदारक के बाद हैपूर्वकाल दीवार में बने, धमनी की पृष्ठीय भाग की निरंतरता बरकरार जा रही है.
7. दाता फेफड़ों, ठंड, Lactated है घंटी भिगो कपास धुंध में लिपटे और तैयार के रूप में ऊपर वर्णित है, तो वक्ष गुहा में तैनात है, और कफ प्राप्तकर्ता पीए पी.वी., और Br में डाला और 9-0 सीवन के साथ सुरक्षित है.
8. hilar पार दबाना reperfusion की और वेंटिलेशन के लिए अनुमति देता है हटा दिया जाता है.
9. प्रत्यारोपित फेफड़ों प्राप्तकर्ता छाती में वापस स्थिति के बाद, thoracotomy चीरा 5-0 से सीवन का उपयोग कर बंद कर दिया है.
10. माउस संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दी है. Buprenorphine (0.05-0.15 मिलीग्राम / किग्रा) सर्जरी के बाद तुरंत प्रशासित किया जाता है, और 2-3 दिन के बाद सर्जरी के लिए हर 8 घंटे के लिए.

3. प्रतिनिधि परिणाम

हमारा अनुभव हमें सिखाया है कि यह दोहराया अभ्यास के कई महीनों के फेफड़ों प्रत्यारोपण के माउस मॉडल में कुशल बनने के लिए की आवश्यकता है. प्रवीणता प्राप्त करने के बाद, हम एकoperatively सात दिन के बाद के भीतर होने वाली मौतों के साथ एक 96% (96/100 लगातार सर्जरी) perioperative जीवित रहने की दर chieved. दो मौतों से खून बह रहा है कि intraoperatively शुरू हुआ के कारण थे, और pneumothraces अन्य दो चूहों में मौत का कारण थे. सभी प्रक्रियाओं के लिए, गर्म ischemia के समय 14.32 था ± 3.14 मिनट, और ठंड ischemia के समय 58.51 ± 18.06 मिनट था. में तीन orthotopic फेफड़ों प्रत्यारोपण समूहों का अध्ययन किया गया: isograft: / C57BL 6 → C57BL / 6, allograft: C57BL/10 → C57BL / 6 और C57BL / 6 C57BL/10 →. हम केवल नर चूहों का इस्तेमाल किया लेकिन हमारे तकनीक मादा चूहों के लिए भी लागू किया जा सकता है, क्योंकि वहाँ लिंगों के बीच कोई महत्वपूर्ण संरचनात्मक अंतर है.

अस्वीकृति विकृति की ग्रेडिंग एक अंधा नैदानिक ​​फेफड़ों ⁷ प्रत्यारोपण (तालिका 1) के लिए मानक मापदंड का उपयोग फैशन में आयोजित किया गया. जबकि हम isograft (C57BL / 6 → C57BL 6 /) में हल्के या नहीं अस्वीकृति मनाया, दोनों allograft संयोजन कंपनियों विकसितrable तीव्र या पुराना अस्वीकृति (चित्रा 1). इसके विपरीत, ओ काफी अधिक C57BL/10 में लगातार में → C57BL / C57BL / day28 (तालिका 1) 6 → C57BL/10 समूह से 6.

तालिका 1 तीव्र अस्वीकृति और obliterative bronchiolitis के बाद प्रत्यारोपण के प्रसार के histological स्कोर. तीव्र अस्वीकृति की मानक रियायती ब्याज दर स्कोरिंग ("एक" स्कोर)teria प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित है. डेटा मतलब ± दिन 28 के बाद प्रत्यारोपण में 'ए' स्कोर के एसडी का प्रतिनिधित्व करता है. डेटा और प्रत्येक समूह में चूहों कि 21 दिन और 28 के बाद प्रत्यारोपण में ओबी विकसित की मात्रा प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 1 28 दिनों के बाद फेफड़ों प्रत्यारोपण पर macroscopic और निष्कर्ष ऊतकविकृतिविज्ञानी. पैनल 1A macroscopic के निष्कर्ष और एच ई कलंकित Isograft फेफड़े और सही भोले फेफड़ों के प्रतिनिधित्व करते हैं. पैनल 1B और 1C एच ई और मेसन Trichrome दाग BL/10 फेफड़ों बीएल / 6 माउस प्राप्तकर्ता, जो ओबी और गैर ओ विकसित, क्रमशः में प्रत्यारोपित allograft का प्रतिनिधित्व करता है. 1B में सफेद तीर ओ के घावों को दिखाता है. पैनल 1D बीएल / 6 फेफड़ों BL/10 माउस प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित allograft से पता चलता है.

प्रक्रिया के दौरान मुख्य मुसीबत शूटिंग के रूप में निम्नानुसार थे.

1. रक्त प्रवाह विकार: फ्लश दाता फेफड़ों तकरंग में रंग सफेद हो जाता है. अत्यधिक दबाव का प्रयोग फुफ्फुसीय edema उत्पन्न कर सकता है. लेकिन बहुत ज्यादा नहीं पुश करने के लिए प्रत्यारोपण के बाद edema रोकने नहीं है.
2. कफ प्रविष्टि के दाता में यह पता लगाना है कि vasculature को पर्याप्त लंबाई और संलग्न वसा और संयोजी ऊतक से मुक्त है.
3. शाखामिलन संबंधी साइट पर खून बह रहा: क्यू युक्तियों का उपयोग करने के लिए लगभग 5 मिनट के लिए प्रभावित साइट पर दबाव लागू होते हैं.
4. प्राप्तकर्ता पीए रक्त प्रवाह रुकावट: मुख्य रूप से कफ प्रविष्टि के दौरान की मरोड़ की वजह से है. यदि हवा पीए भीतर मनाया जाता है तो फिर से करना का सम्मिलन आवश्यक है.
5. मुश्किल पी.वी. सम्मिलन: पी.वी. की झिल्ली बहुत पतली है और आसानी से आँसू है. उचित कफ आकार का चयन करें और सीधे प्राप्तकर्ता पी.वी. बहुत धीरे से सम्मिलित है.
6. प्राप्तकर्ता पी.वी. रक्त प्रवाह बाधा: सुनिश्चित करें कि और कफ की स्थिति और दिशा. ब्रोन्कियल कफ से संपीड़न छोड़ें.
7. वातिलवक्ष: यह या तो ब्रोन्कियल manipulatio करने के लिए कारण वेध द्वारा कारण हो सकता हैn, या airway के फेफड़ों के प्रत्यारोपण की प्रक्रिया के साथ जुड़े आघात के कारण सतह की वेध के. पूर्व की airway दीवार के भीतर छेद की शल्य चिकित्सा बंद होने के साथ व्यवहार किया जाता है, और बाद फेफड़ों 10-0 नायलॉन सीवन का उपयोग कर सतह पर रिसाव oversewing द्वारा इलाज किया जाता है.

चूहों में orthotopic के फेफड़ों प्रत्यारोपण microsurgical मांग और ऊतकों की चरम भंगुरता के कारण चुनौतीपूर्ण है. कफ तकनीक का परिचय ⁸ चूहों में orthotopic फेफड़ों के प्रत्यारोपण के व्यापक उपयोग के लिए अनुमति दी गई है. यह हमारी प्रयोगशाला में चूहों में orthotopic फेफड़ों प्रत्यारोपण मॉडल के विकास के लिए आधार बन गया. चूहों और चूहों में, मानव के विपरीत, बाएं फेफड़े केवल एक पालि होता है और फेफड़ों के कुल द्रव्यमान का केवल 25% बनाता है. यह बाएँ एकल फेफड़ों प्रत्यारोपण murine मॉडल एक संचार का समर्थन प्रणाली के लिए जरूरत के बिना में संभव बनाता है.

हमारे प्रारंभिक सर्जरी से पता चला है कि और प्रतिरोपित फेफड़ों के वेंटिलेशन छिड़काव उच्च पी.वी. सम्मिलन के आकार पर निर्भर था. विशिष्ट पी.वी. शाखामिलन संबंधी कफ आकार दाता मैच के लिए उपयोग किया गया है और प्राप्तकर्ता के रूप में ⁹ की सूचना दी. अनुचित कफ आकार देने वाले प्रत्यारोपित या पी.वी. anast के फेफड़ों के स्फुटन की या तो श्वासरोध के परिणामस्वरूपomosis. ओकाज़ाकि एट अल संयुक्त पोत बंधाव की उपयोग की सूचना दी और श्वसनी ⁵ कतरन. वर्तमान अध्ययन में हम hilar सभी संरचनाओं के लिए एक धमनीविस्फार क्लिप है, जो हम सुझाव है कि गर्म इस्कीमिक समय कम हो सकता है का उपयोग करें. Murine मॉडल में orthotopic बाएं फेफड़े प्रत्यारोपण की एक सीमा है है कि प्राप्तकर्ता जानवरों को उनके ⁵ allografts का परिगलन alloimmune की मध्यस्थता के बाद जीवित रह सकते हैं. इसलिए, अस्तित्व का अध्ययन संभव है और नहीं कर रहे हैं भ्रष्टाचार मूल्यांकन प्रतिरोपित ¹⁰ फेफड़ों के histological परीक्षा पर निर्भर करता है.

इस तकनीक का उपयोग करना, हम चूहों में एक preclinical obliterative श्वासनलिकाशोथ मॉडल विकसित किया है. विशेष रूप से, दाता माउस C57BL/10 है और प्राप्तकर्ता C57BL 6 / है. यह नाबालिग की भूमिका है, और नहीं obliterative bronchiolitis के रोगजनन में ⁶ प्रमुख उतक अनुरूपता प्रतिजनों पता चलता है. इसके अलावा, हम निष्क्रिय आईएल -17 murine मॉडल में obliterative श्वासनलिकाशोथ को रोकता है की सूचना दी है. यह मोडमैं फेफड़ों प्रत्यारोपण की परीक्षा और नैदानिक ​​फेफड़ों के प्रत्यारोपण की उन्नति के लिए एक उपन्यास अनुसंधान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

इस काम के रूप में स्वास्थ्य HL067177 अनुदान, HL096845 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है, और P01AI084853 DSW: धन स्रोतों

1. Asimacopoulos, P.J., Molokhia, F.A., Pegg, C.A., & Norman, J.C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585, (1971).
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