Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).

O crescimento da rede Microvacular e remodelação são aspectos críticos da cicatrização de feridas, inflamação, retinopatia diabética, crescimento tumoral e outras condições de doença ^{1, 2.} Crescimento da rede é comumente atribuída a angiogênese, definido como o crescimento de novos vasos a partir de vasos pré-existentes. O processo angiogénico está também directamente ligado ao arteriogênese, definida como a aquisição capilar de um revestimento de célula perivascular e alargamento do vaso. Escusado será dizer que, a angiogênese é complexo e envolve vários jogadores a nível celular e molecular ^3. Entender como uma rede microvascular cresce exige a identificação da dinâmica espacial e temporal ao longo da hierarquia de uma rede ao longo do tempo de angiogênese. Esta informação é crítica para o desenvolvimento de terapias destinadas a manipular o crescimento dos vasos.

O modelo de exteriorização descrito neste artigo representa um modelo simples e reprodutível para estimularcirculantes angiogênese no mesentério de ratos. Foi adaptado a partir de cicatrização de feridas modelos no rato mesentério ^4-7, e é uma alternativa para estimular a angiogénese no mesentério através de injecções ip de pró-angiogénicos agentes ^{8, 9.} O modelo de exteriorização é atraente porque requer a intervenção cirúrgica mínima e produz aumentos dramáticos, reprodutíveis em brotos capilares, área vascular e da densidade vascular ao longo de um curso de tempo relativamente curto em um tecido que permite a visualização bidimensional de redes microvasculares inteiras para baixo para único nível celular. O crescimento estimulado reflecte naturais respostas angiogénicas em um ambiente fisiológico, sem interferência de estrangeiros moléculas angiogénicas. Usando métodos de marcação imuno-histoquímica, este modelo já demonstrou ser extremamente útil na identificação de novos eventos celulares envolvidos na angiogênese. Os investigadores podem prontamente correlacionar as métricas angiogénicos durante o curso de tempo de remodelação com o tempo spdinâmica ecific, tais como celulares alterações fenotípicas ou interações celulares ^{4, 5, 7, 10, 11.}

1. Set-Up Procedimento Cirúrgico Notes

1. Antes da cirurgia esterilizar material cirúrgico e instrumentos. Materiais utilizados para o procedimento cirúrgico estéril para cada rato incluem uma cortina de ser Definiu como uma superfície estéril para a colocação dos instrumentos, uma cortina com um orifício pré-cortado em cerca de 0,5 x 1,5 em no centro para ser colocada sobre o rato , gaze e. O orifício pré-cortado na cortina irá alinhar com a incisão feita no rato. Instrumentos necessários para a cirurgia incluem um par de tesouras padrão a ser utilizado para cortar material de sutura, duas pinças e um suporte de agulha fina para a manipulação e agarrando da sutura, e um bisturi, com uma lâmina. Listamos as ferramentas mais comuns utilizadas por nosso laboratório na Tabela de específicos materiais cirúrgicos e ferramentas. No entanto, a seleção ferramenta final depende das preferências experimentador.
2. Preparar o espaço cirurgia. Coloque um 100 mL de 0,9% saco de soro fisiológico estéril sob uma almofada de aquecimento para assegurar que a solução salina que entra em contacto wtecido om o mesentério é pré-aquecido a aproximadamente 37 ° C. Como uma alternativa para a solução salina, é possível utilizar a solução de Ringer ou outro tampão fisiológico. Dispor de instrumentos cirúrgicos esterilizados e suprimentos em uma cortina estéril para fácil acesso durante o processo de exteriorização. Além disso, você vai precisar de aplicadores de algodão estéreis ponta e as apropriadas 3 tipos de suturas (4-0, 5-0 e 7-0). Faz pacotes certeza que são pré-aberta de modo que os materiais podem ser acessados ​​com a manipulação estéril. Finalmente, desinfectar, a fase de pré-modificado de plástico por imersão em etanol a 100% durante pelo menos 5 minutos. A fase é de 100 mm placa de Petri com um furo elíptico cortado no centro (Figura 1). Uma ferramenta Dremel pode ser usado para fazer inicialmente e, se necessário, amplia o furo. Após o buraco é feito, as arestas de corte do plástico são feitas usando um papel liso areia de grãos diferentes. A fase é então lavado e, finalmente, quer argila inerte (adquirido a partir de um armazenamento de artesanato local) ou silicem cola é adicionado à borda do furo, a fim de proporcionar uma elevada superfície lisa. Antes do contacto com o tecido, a fase terá de ser adequadamente lavados com solução salina estéril.
3. Para este modelo de angiogênese, que normalmente usam ratos Wistar machos (350 ± 25 g). Outras linhagens de ratos e idades podem ser usados. No nosso laboratório, os ratos são anestesiados por injecção intramuscular com cetamina (80 mg / kg de peso corporal), xilazina (8 mg / kg de peso corporal), e atropina (0,08 mg / kg de peso corporal). Depois de aproximadamente 5 minutos, o efeito da anestesia é confirmada e pele abdominal do rato é raspada.

2. Rat Modelo exteriorização Mesentério

1. Posicionar o rato anestesiado na sua parte traseira de uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo. Técnicas assépticas são utilizados durante o procedimento cirúrgico. Usar luvas estéreis e não permitir que os instrumentos e fontes de entrar em contato com não-estéreis outras superfícies que os tecidos de ratos.
2. Limpe a área abdominal com a alternância de toalhetes using a gaze estéril embebido em isopropílico a 70% e iodo.
3. Com a lâmina de bisturi, fazer uma incisão (aproximadamente 0,75 polegadas) pequena longitudinal ao longo da pele e, em seguida, a linha alba aproximadamente 1 polegada abaixo do esterno.
4. Coloque a cortina de pré-corte sobre a secção abdominal de modo que a abertura se alinha com a incisão.
5. Suavemente aplicar pressão em torno da incisão. Isto normalmente irá resultar na exposição do intestino delgado suficiente para que possa ser facilmente identificados.
6. Usando os aplicadores de ponta de algodão, puxe cuidadosamente uma secção do intestino delgado e localizar o íleo. À medida que o mesentério é puxado para fora, deve-se suavemente Definiu na fase de plástico (Figura 2).
7. Identificar 6-8 janelas mesentéricos vascularizados. Uma janela mesentérica é definida como a membrana fina e translúcida entre os pares de artéria / veia de alimentação do intestino delgado (Figura 2).
8. Anote o tempo inicial de exteriorização. Deixe o mesentery seção exteriorizado por 20 minutos. Durante o período de exteriorização, utilizar uma seringa estéril (5 mL) para intermitentemente reabastecer a solução salina na placa de Petri para garantir que o tecido permanece imerso e não secar.
9. Durante o tempo de exposição de 20 minutos, marcar os 2 janelas mesentéricos localizados centralmente com sutura 7-0 estéril. As marcas devem ser feitos na área de gordura perto do intestino.
10. Retornar a região exteriorizada do mesentério para a cavidade abdominal.
11. Feche o músculo abdominal com sutura de monofilamento 5-0 em padrão interrompido.
12. Feche a pele com sutura monofilamentar 4-0 em padrão interrompido.
13. Limpe a área suturada com a alternância de panos usando a gaze estéril embebida em isopropoyl 70% e iodo.
14. Espalhe gel lubrificante olho em ambos os olhos do rato. O objectivo da lubrificação do olho é para evitar a dessecação da córnea durante o procedimento cirúrgico e recuperação. A aplicação de lubrificante olho deve ser aplicadaantes do início da intervenção cirúrgica. Se necessário, a re-aplicar lubrificante olho antes de retornar o rato para a sua gaiola para a recuperação.

3. Coleta de Tecidos e Fixação

1. No dia da estimulação pós interesse, anestesiar e euthanize no rato. No nosso laboratório, os ratos são anestesiados por injecção intramuscular com cetamina (80 mg / kg de peso corporal), xilazina (8 mg / kg de peso corporal), e atropina (0,8 mg / kg de peso corporal) e, em seguida sacrificados por injecção intracardíaca de beuthanasia. Beuthanasia é uma solução de sódio / fenitoína pentobarbital que pode ser usado para a eutanásia rápida e indolor. Por rato nosso laboratório normalmente injeta 0,1-0,2 ml.
2. Volte a abrir a cavidade abdominal e remova cuidadosamente o intestino delgado e localizar as janelas de dois marcados.
3. Corte cada uma das janelas mesentéricos exteriorizado usando uma pinça e micro-tesouras. Incluindo uma borda da janela por gordura é vantajoso para o tecido mais tarde se espalhando em lâminas de microscópio. Imediatamente, Mergulhe cada janela em PBS. Ao cortar, tentar evitar o corte através da artéria / veia pares dentro da fronteira de gordura do sangue janelas para minimizar o potencial de enchimento do windows. Além disso, minimizar o corte através do intestino, que resulta em conteúdo intestinal contactando as janelas.
4. Use fórceps para espalhar tecidos em lâminas de microscópio carregados positivamente. Dois tecidos pode ser montado por lâmina.
5. Permitir que os tecidos para secar parcialmente e usando uma lâmina de bisturi remover o excesso de gordura.
6. Os tecidos são agora pronto para ser corrigido. Métodos de fixação típicos podem ser usados. No nosso laboratório, que vulgarmente fixar as lâminas em metanol (-20 ° C) durante 30 min. Rotulagem bem sucedido foi também realizada com tecidos não fixadas. Métodos de fixação pode depender de seu anticorpo preferido.

4. Imunomarcação tecido

1. Os tecidos podem geralmente ser agora identificadas de acordo com instruções por anticorpo para imuno-histoquímica. Dado o nosso interesse em identificar os papéisde pericitos vasculares durante a angiogênese, o nosso laboratório comumente rotula de células endoteliais e perivasculares ^{10, 12, 13.} Etiquetas útil para identificar células endoteliais ao longo da hierarquia das redes microvasculares são um anticorpo anti-PECAM ou BSI lectina. Marcadores de células perivasculares utilizados neste tecido incluem NG2, desmina, SM-α actina, PDFGRβ, e classe III β-tubulina. Abaixo, na seção 3.3, há uma lista de protocolos para os protocolos imunomarcação colorimétricos e fluorescentes PECAM.
2. Antes da incubação com anticorpo primário inicial, as lâminas são secos sob vácuo para remover excesso de solução tampão. Além disso, os tecidos são inicialmente descrito com uma caneta de cera para evitar o fluxo de descontrolada de soluções de anticorpos de distância a partir do tecido. Finalmente, todos os passos de etiquetagem são seguidos por passos de lavagem. Para lavar os passos, as lâminas são colocadas dentro de tinas de coloração. A solução tampão é trocado 3 vezes durante a duração de lavagem.
3. Células endoteliais de anticorpos procedimentos de rotulagem: <classe p = "jove_step"> PECAM colorimétrico Lableing
   1. Incubação do anticorpo primário: gotejamento aproximadamente 100-200 mL de solução de anticorpo primário (1:200 monoclonal de ratinho CD31 anticorpo biotinilado diluído em tampão de anticorpo (0,1% de saponina em PBS + BSA a 2%)) no topo de cada tecido; certificar-se de todo o tecido é coberta com uma solução de anticorpo. Incubação durante 1 hora à temperatura ambiente.
   2. Lavar os tecidos com PBS saponina 0,1% durante 30 minutos.
   3. Incubação do anticorpo secundário: gotejamento solução de anticorpo secundário (Vectastain Elite ABC solução de Vector Laboratories; uma peroxidase estreptavidina solução de anticorpo secundário) na parte superior dos tecidos. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
   4. Lavar os tecidos com PBS saponina 0,1% durante 30 minutos.
   5. Incubar os tecidos com Vector Nova Red durante 15 minutos. Em seguida, subir tecidos com água.
   6. Lâminas de montagem: Dip lâminas em etanol 95% 10 vezes. Imergir desliza em etanol a 100% durante 2 minutos. Imergir as lâminas em outro etanol 100% paralução durante 2 minutos. Em seguida, Imergir as lâminas em consecutivos soluções xileno 100% durante 2 minutos cada. Deixa-se secar e cobrir tecidos com uma fina camada de VectaMount e uma lamela.

   PECAM marcação fluorescente

   1. Incubação do anticorpo primário: gotejamento aproximadamente 100-200 mL de solução de anticorpo primário (1:200 monoclonal de ratinho CD31 anticorpo biotinilado diluído em tampão de anticorpo (0,1% de saponina em PBS + BSA a 2%)) no topo de cada tecido; certificar-se de todo o tecido é coberta com uma solução de anticorpo. Incubação durante 1 hora à temperatura ambiente.
   2. Lavar os tecidos com PBS saponina 0,1% durante 30 minutos.
   3. Incubação do anticorpo secundário:. Gotejamento solução de anticorpo secundário ((1:100 Estreptavidina-Cy3 diluído em tampão de anticorpo (0,1% de saponina em PBS + BSA a 2%)) no topo de tecidos Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
   4. Lavar os tecidos com PBS saponina 0,1% durante 30 minutos.
   5. Lâminas de montagem: gotejamento 50:50 PBS com glicerol em cima dos tecidos. Cobrircom lamínula. Em seguida, use unhas polonês para selar o intervalo entre lamínula e slide.

5. Os resultados representativos

Imagens representativas de tecidos de rato mesentério imuno etiquetadas para PECAM são apresentados na Figura 3. PECAM rotulagem identifica todos os tipos de navios ao longo da hierarquia de remodelação redes microvasculares e pode ser usado para quantificar as métricas angiogénicas em específica estimulação pós pontos de tempo. PECAM rotulagem também permite a determinação de arteríolas, versus vénulas. Arteríolas alimentação exibem tipicamente diâmetros menores e morfologia de célula endotelial alongada em comparação com vénulas emparelhados (Figura 4). Capilares e rebentos capilares podem ser identificados com base na sua diâmetro do vaso e posição relativa dentro de uma rede. As características típicas de redes de remodelação incluem o aumento da densidade de vasos capilares brotando, área vascularizada e tortuos venularesdade. Quantificação de várias métricas angiogénicos identifica o tempo de curso do crescimento da rede (Figura 5). Capilar germinação a partir de vasos pré-existentes, picos entre o dia 3 eo dia 5 e retorna para o nível não estimulada por dia 10. Este aumento transitório na germinação é seguido por um aumento na densidade vascular e área vascularizada. Como evidência para a remodelação dos vasos maiores neste modelo, o número de segmentos das arteríolas e vénula também aumenta ao longo do tempo.

No nosso laboratório, este modelo tem sido utilizado para identificar alterações celulares fenotípicas no ponto de tempo específico durante este processo de remodelação ^{10, 11.} Por exemplo, a classe III β-tubulina identifica pericitos ao longo dos vasos angiogénicas (Figura 6). Em tecidos não estimuladas, classe III expressão β-tubulina é específico do nervo. Em contraste, durante o pico de germinação capilar, classe III β-tubulina é expressa pelas células perivasculares. Este tipode resultado destaca a utilização deste modelo simples e robusta angiogénico para identificar novos tipos de células envolvidas no processo angiogénico.

Figura 1. Imagens da fase de plástico pré e pós-modificação. A fase de pré-modificado é de 100 mm placa de Petri. As modificações incluem um corte furo elíptico no centro ea subsequente adição de argila ou uma cola de silicone para a borda do orifício para a criação de uma elevada superfície lisa. Esta superfície fornece um limite interno que facilita superfusão das janelas mesentéricos exteriorizado. Barra de escala é de 1 cm.

Figura 2. Imagem da região mesentérica exteriorizado. Janelas mesentéricos são definidos como as membranas finas translúcidas entre os pares de artéria / veia de alimentação do intestino delgado. Durante a exteriorizaçãoduração, a região mesentérica é colocado para fora e imerso em solução salina no interior de uma placa de Petri modificado. Plasticina amarelo inerte proporciona uma superfície lisa para o mesentério a ser puxado através do orifício pré-cortado. Barra de escala é de 1 cm.

Figura 3. Imagens representativas dos mesentéricos redes microvasculares de tecidos e tecidos não estimuladas a 3 e 10 dias após a exteriorização do mesentério. PECAM rotulagem identificou a hierarquia de redes microvasculares, incluindo, arteríolas (A), vénulas (V) e capilares (C). Estimulação Post, redes microvasculares apresentado um aumento na germinação capilar (cabeças de seta) e densidade de vasos. Barra de escala é 100 mm.

Figura 4. Imagens representativas da arteríola / vênula pares dentro adulto rede microvascular mesentérico de ratos. Em ambas as imagens, arteríolas (A) pode ser diferenciada de vénulas (V) com base em um diâmetro menor relativa e morfologia das células alongada endotelial. Barras de escala são 20 microns.

Figura 5. Quantificação representativas de métricas angiogénicos ao longo do decurso de tempo de microvascular exteriorização mesentério crescimento pós. A) área por área de tecido vascular. B) O número de brotos capilares por área vascular. C) Comprimento total vascular por área vascular. * Representa diferença significativa quando comparado ao grupo não estimulado. As comparações estatísticas foram feitas usando uma ANOVA One-Way seguida pelo teste de Dunn. (P <0,05). ONU representa desestimulados.

Figura 6. Representativos imagens fluorescentes de mesentéricos redes microvasculares a partir de tecidos não estimuladas e tecidos em 3 e 10dias após o exteriorização do mesentério. Imunofluorescência PECAM rotulagem (vermelho) identifica as células endoteliais, e classe III rotulagem β-tubulina (verde) identifica os nervos (cabeças de seta) e células perivasculares (setas). Células perivasculares transitoriamente upregulate classe III β-tubulina durante capilar brotação. Em não estimuladas redes microvasculares, classe III β-tubulina é nervo específico e não identifica as células perivasculares. 3 dias após a estimulação, classe III β-tubulina positivamente rotula células perivasculares juntamente microvasos. Por dia 10, classe III padrão de expressão β-tubulina começa a voltar para o cenário não estimulada. Barra de escala é de 50 mM.

Figura 7. Imagens de apoio a viabilidade de rastreio pré-células marcadas aplicados localmente durante o crescimento da rede microvascular estimulada pela exteriorização mesentério. As células foram superfused sobre mesenterIC janelas durante o período de exteriorização de 20 minutos. 1 dia após a cirurgia, as células marcadas DII (vermelho), foram observados no plano focal Dame com PECAM positivo microvasos (verde). A, B) Exemplos de células de medula óssea que exibem DII rotulados arredondado e alongado morfologias. Em alguns casos (setas) ao longo de células foram alongadas microvasos. C) Exemplo de um aglomerado de DiI rotulado células estaminais mesenquimais perto da ponta de um capilar broto (seta). Barras de escala são 50 mM (A), e 20 uM (B, C).

O modelo de exteriorização foi relatado em 2006 e é adaptado de lesões mecânicas anteriores modelos de ratos mesentério de angiogênese ^4-7 e produz resultados semelhantes aos bem estabelecidos modelos de injeção IP que se aproveitam do rato mesentério ^9. O tempo de exteriorização 20 minutos foi determinado experimentalmente para produzir uma resposta robusta angiogênico. Embora este período de tempo pode ser variada, ele permite que a aplicação local de inibidores angiogénicos ⁴ para estudos mecanísticos e aplicação directa de células exógenas para estudos linhagem celular. Viabilidade da incorporação da célula em remodelação do tecido mesentérica é apoiada por estudos preliminares em nosso laboratório usando células ósseas pré-rotulados de medula e células-tronco mesenquimais (Figura 7), e pelo sucesso de investigar o destino do ser humano ip injeção derivadas de tecido adiposo células do estroma ¹⁴ . Em nosso laboratório, utilizamos este modelo para identificar phen pericytealterações otypic ao longo do tempo da resposta angiogénica ¹⁰ e para avaliar o potencial angiogénico durante condições patológicas, tais como hipertensão ^12. A resposta angiogénica e alterações celulares fenótipo associado com este modelo pode também ser observada em modelos de ratos outros mesentéricos angiogénicos, incluindo a exposição a hipóxia crónica ^{10, 11.}

Uma limitação do modelo exteriorização é que os mecanismos exactos desencadeadores de angiogénese são desconhecidos. Exteriorização do mesentério tem sido associada a degranulação dos mastócitos e aumento dos níveis de histamina ^6, ainda mais investigação é necessária para ter mais conhecimento. O estímulo angiogênico é, sem dúvida, multi-fatorial, produzindo uma resposta de remodelação robusta em toda a hierarquia de uma rede microvascular. Enquanto os mecanismos desconhecidos continuam a ser uma grande crítica deste modelo, a sua reprodutibilidade e simplicidade o tornam atraente para identificar a dinâmica celular envolvived no processo inerentemente complexo capilar brotação. A reprodutibilidade do modelo é suportado por comparáveis ​​métricas angiogénicos ao longo do tempo de curso do crescimento da rede microvascular através estirpes de ratos múltiplas (Wistar macho e fêmea Sprague-Dawley) em estudos anteriormente publicados do nosso laboratório ^{10, 12.} Uma vez que, na maioria dos tecidos mesentéricos adultos ratos são vascularizados, o modelo também permite a múltiplos tecidos a serem examinadas por animal. Infelizmente, este modelo não é obviamente aplicável aos modelos de mouse genéticos como janelas mesentéricos rato tem menos vascularização nativa e, em nossa experiência, geralmente carecem de observáveis ​​redes de ramificação. Aplicativos futuros incluem a investigação de funcionalidade navio durante a angiogênese usando microscopia intra-vital em momentos específicos e relacionados com a investigação da dinâmica celulares envolvidos na linfangiogênese e neurogênese. Embora a extensão da vascularização nativo por janela mesentérica parece ser roughly proporcional com a idade, observou-se ramificando redes microvasculares em ratos Wistar machos jovens como 4-5 semanas de idade. Estas observações sugerem que o modelo exteriorização pode também ser aplicado para comparar as diferenças angiogénicas em toda idades.

Não temos nada a divulgar.

Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Regentes do Estado de Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) e da Hipertensão Tulane e Centro Renal de Excelência financiado pelo NIH concessão P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

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