Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell'angiogenesi

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).

Crescita della rete Microvacular e il rimodellamento sono aspetti critici di guarigione delle ferite, l'infiammazione, retinopatia diabetica, la crescita del tumore e le condizioni di altre malattie ^{1, 2.} Crescita di rete è comunemente attribuito angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi da vasi preesistenti. L'angiogenesi è inoltre direttamente collegata arteriogenesi, definito come l'acquisizione capillare di un rivestimento cellula perivascolare e allargamento vaso. Inutile dire, l'angiogenesi è complessa e coinvolge più giocatori a livello cellulare e molecolare ^3. La comprensione di come una rete microvascolare cresce richiede identificare le dinamiche spaziali e temporali lungo la gerarchia di una rete nel corso del tempo angiogenesi. Queste informazioni sono importanti per lo sviluppo di terapie mirate a manipolare crescita dei vasi.

Il modello esteriorizzazione descritto in questo articolo rappresenta un modello semplice e riproducibile per stimolarelante angiogenesi nel mesentere ratto. E 'stato adattato da modelli di guarigione delle ferite nel ratto mesentere ^4-7, ed è una alternativa per stimolare l'angiogenesi nel mesentere tramite iniezioni ip di pro-angiogenici agenti ^{8, 9.} Il modello esteriorizzazione è interessante perché richiede un minimo intervento chirurgico e produce drammatiche, aumenti riproducibili in germogli capillari, zona vascolare e la densità vascolare in un corso di tempo relativamente breve in un tessuto che permette la visualizzazione bidimensionale di reti microvascolari interi fino a singola Level Cell. La crescita riflette naturali stimolato risposte angiogenici in un ambiente fisiologico, senza interferenza di stranieri molecole angiogenici. Utilizzando i metodi immunoistochimici etichettatura, questo modello è stato dimostrato estremamente utile per identificare nuovi eventi cellulari coinvolti nell'angiogenesi. Gli investigatori può facilmente correlare le metriche angiogenici nel corso del tempo rimodellamento con tempo specific dinamiche, quali cellulari modificazioni fenotipiche o interazioni cellulari ^{4, 5, 7, 10, 11.}

1. Set-Up Notes Procedura chirurgica

1. Prima della chirurgia sterilizzare gli strumenti chirurgici e forniture. Forniture utilizzati per la procedura chirurgica sterile per ciascun ratto includono 1 pellicola di essere disposti come una superficie sterile per il collocamento di strumenti, un telo con un foro pretagliato in circa 0,5 x 1,5 nel nel centro per essere posizionato sul ratto , e garza. Il foro pretagliato sul telo si allinea con l'incisione fatta sul ratto. Gli strumenti necessari per l'intervento chirurgico comprendono 1 paio di forbici norma da utilizzare per tagliare materiale di sutura, due pinze e un porta ago sottile per la movimentazione e presa della sutura, un bisturi e con una lama. Abbiamo elencato i comuni strumenti utilizzati dal nostro laboratorio nella tabella di specifici materiali e strumenti chirurgici. Tuttavia, strumento di selezione finale dipende dalle preferenze sperimentatore.
2. Preparare lo spazio chirurgico. Inserire un mL 100 0,9% sacca salina sterile sotto un cuscinetto riscaldante per garantire che la soluzione salina che viene in contatto wesima il tessuto mesenterico viene preriscaldata a circa 37 ° C. In alternativa alla soluzione salina, è possibile utilizzare la soluzione di Ringer o altro tampone fisiologico. Lay out sterilizzati gli strumenti chirurgici e forniture su un telino sterile per un facile accesso durante la procedura di esteriorizzazione. Inoltre, avrete bisogno di cotton-fioc sterili applicatori e gli opportuni 3 tipi di suture (4-0, 5-0 e 7-0). Crea pacchetti sicuri sono già aperti in modo che i materiali possono essere raggiunti con la manipolazione sterile. Infine, disinfettare la pre-modificato fase plastica immergendolo in etanolo al 100% per almeno 5 minuti. Lo stadio è di 100 millimetri capsula Petri con un foro ellittico tagliato al centro (Figura 1). Uno strumento Dremel può essere usato per fare inizialmente e, se necessario, allargare il foro. Dopo che il foro viene effettuato, i bordi della plastica taglio sono realizzati liscia con carta abrasiva di grani diversi. Il palco è poi lavato e, infine, sia plastilina inerte (acquistato da un negozio di artigianato locale) o Silicil collante viene aggiunto al bordo del foro per fornire una posizione sollevata, superficie liscia. Prima di contatto con il tessuto, la fase dovrà essere adeguatamente lavate con soluzione fisiologica sterile.
3. Per questo modello di angiogenesi, si utilizzano in genere ratti maschi adulti Wistar (350 ± 25 g). Altri ceppi di ratto ed età possono essere utilizzati. Nel nostro laboratorio, i ratti vengono anestetizzati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo), xilazina (8 mg / kg di peso corporeo) e atropina (0,08 mg / kg di peso corporeo). Dopo circa 5 minuti, l'effetto di anestesia è confermata e la pelle addominale del ratto viene rasato.

2. Rat mesentere Modello Esteriorizzazione

1. Posizionare il ratto anestetizzato sulla sua schiena su un tappetino di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea. Tecniche asettiche vengono utilizzati durante la procedura chirurgica. Indossare guanti sterili e non consentono di strumenti e forniture a contatto con superfici diverse da quelle dei tessuti di ratto non sterili.
2. Pulire zona addominale con un'alternanza di salviette USIng la garza sterile imbevuta nel 70% isopropilico e iodio.
3. Usando il bisturi, fare un piccolo (circa 0,75 cm) incisione longitudinale lungo la pelle e poi la linea alba di circa 1 cm sotto lo sterno.
4. Posizionare il pre-taglio telo sul tratto addominale in modo che l'apertura si allinea con l'incisione.
5. Esercitare una leggera pressione attorno l'incisione. Ciò solitamente comporta l'esposizione del piccolo intestino abbastanza per essere facilmente identificato.
6. Utilizzando gli applicatori di cotone punta, estrarre delicatamente una sezione dell'intestino tenue e individuare l'ileo. Poiché il mesentere viene estratta, esso dovrebbe essere leggermente spiegate in fase plastica (Figura 2).
7. Identificare 6-8 finestre mesenteriche vascolarizzati. Una finestra mesenterica è definita come la membrana sottile trasparente tra le dell'arteria / vena coppie di alimentazione del piccolo intestino (Figura 2).
8. Registrare l'ora di inizio del esteriorizzazione. Lasciare la mesenteRy sezione esteriorizzato per 20 minuti. Durante il periodo esteriorizzazione, utilizzare una siringa sterile (5 mL) per ricostituire la soluzione salina in modo intermittente nella capsula Petri per garantire che il tessuto rimanga immersa e non si secca.
9. Durante i 20 minuti di tempo di esposizione, segnano le 2 finestre mesenterici situati in posizione centrale con sutura sterile 7-0. I segni dovrebbero essere nella zona grasso vicino l'intestino.
10. Ritorna la regione esteriorizzato del mesentere alla cavità addominale.
11. Chiudere il muscolo addominale con 5-0 sutura monofilamento in pattern interrotto.
12. Chiudere la pelle con sutura monofilamento 4-0 nel modello interrotto.
13. Pulire l'area suturata con alternanza di salviette con la garza sterile imbevuta nel 70% isopropoyl e iodio.
14. Stendere gel lubrificante occhio entrambi gli occhi del ratto. Lo scopo di lubrificare l'occhio è per prevenire l'essiccamento della cornea durante la procedura chirurgica e il recupero. L'applicazione di lubrificante oculare deve essere applicatoprima dell'inizio di un intervento chirurgico. Se necessario, ri-applicare il lubrificante occhi prima di restituire il ratto alla sua gabbia per il recupero.

3. Tissue Raccolta e Fixation

1. Il giorno dopo stimolazione interesse, anestetizzare e euthanize il ratto. Nel nostro laboratorio, i ratti vengono anestetizzati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo), xilazina (8 mg / kg di peso corporeo) e atropina (0,8 mg / kg di peso corporeo) e poi l'eutanasia mediante iniezione intracardiaca di beuthanasia. Beuthanasia è un pentobarbital di sodio / fenitoina soluzione che può essere utilizzato per l'eutanasia rapida e indolore. Per ratto nostro laboratorio inietta in genere 0,1 - 0,2 ml.
2. Riaprire la cavità addominale e rimuovere delicatamente l'intestino tenue e individuare i due segnalati finestre.
3. Tagliare ciascuna delle finestre mesenterici esteriorizzato con una pinzetta e micro-forbici. Compreso un bordo di grasso per ogni finestra è vantaggioso per il tessuto dopo la diffusione su vetrini da microscopio. Immediatamente, Immergere ogni finestra in PBS. Durante il taglio, cercare di evitare di tagliare attraverso l'arteria / vena coppie all'interno del bordo grasso delle finestre per ridurre al minimo il potenziale sangue riempimento delle finestre. Inoltre, minimizzare il taglio attraverso l'intestino che risulta in contatto con il contenuto intestinale finestre.
4. Utilizzare pinze per diffondere tessuti su vetrini con carica positiva. Due tessuti possono essere montati per vetrino.
5. Lasciare asciugare i tessuti parzialmente e con una lama da bisturi rimuovere il grasso in eccesso.
6. I tessuti sono ora pronta per essere fissata. Tipici metodi di fissaggio possono essere usati. Nel nostro laboratorio, che comunemente fissare gli scivoli in metanolo (-20 ° C) per 30 min. L'etichettatura di successo è stato eseguito anche con i tessuti non fissati. Metodi di fissaggio potrebbe dipendere il tuo preferito anticorpi.

4. Tissue immunomarcatura

1. I tessuti in genere possono ora essere etichettati secondo le istruzioni per anticorpi per immunoistochimica. Dato il nostro interesse per identificare i ruolidi periciti vascolari durante l'angiogenesi, il nostro laboratorio etichetta comunemente per le cellule endoteliali e perivascolari ^{10, 12, 13.} Etichette utili per identificare le cellule endoteliali lungo la gerarchia delle reti microvascolari sono un anti-anticorpo o BSI PECAM-lectina. Marcatori cellulari perivascolari utilizzati in questo tessuto sono NG2, desmina, SM-α actina, PDFGRβ, e la classe III β-tubulina. Sotto, nella sezione 3.3, abbiamo elencato i protocolli per i protocolli PECAM colorimetriche e fluorescenti immunomarcatura.
2. Prima della prima incubazione anticorpo primario, vetrini sono essiccato sotto vuoto per rimuovere l'eccesso di soluzione tampone. Inoltre, i tessuti sono inizialmente descritto con una penna cera per impedire flusso incontrollato di soluzioni anticorpo lontano dal tessuto. Infine, tutte le fasi di etichettatura sono seguiti da fasi di lavaggio. Per le fasi di lavaggio, i vetrini sono collocati all'interno di contenitori per i lavaggi. La soluzione tampone viene scambiato 3 volte durante la durata di lavaggio.
3. Anticorpi delle cellule endoteliali delle procedure in materia di etichettatura: <p class = "jove_step"> PECAM colorimetrico Lableing
   1. Incubazione primaria: Drip circa 100-200 mL soluzione di anticorpo primario (1:200 monoclonale di topo biotinilato CD31 anticorpo diluito in un tampone di anticorpi (saponina 0,1% in PBS + 2% BSA)) sulla parte superiore per ogni tessuto, assicurarsi che il tessuto intero è coperto con soluzione di anticorpo. Incubazione per 1 ora a temperatura ambiente.
   2. Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti.
   3. Incubazione anticorpo secondario: soluzione di anticorpi Drip secondario (Vectastain Elite soluzione ABC da Vector Laboratories, una streptavidina perossidasi secondaria soluzione di anticorpi) sulla parte superiore dei tessuti. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
   4. Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti.
   5. Incubare tessuti con Vector Red Nova per 15 minuti. Poi salire i tessuti con acqua.
   6. Diapositive Mount: Immergere i vetrini in etanolo al 95% 10 volte. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 2 minuti. Immergere i vetrini in un altro modo di etanolo al 100%luzione per 2 minuti. Poi Immergere i vetrini in soluzioni consecutivi xilene 100% per 2 minuti ciascuno. Lasciare asciugare e coprire i tessuti con uno strato sottile di VectaMount e un coprioggetto.

   PECAM fluorescente Labeling

   1. Incubazione primaria: Drip circa 100-200 mL soluzione di anticorpo primario (1:200 monoclonale di topo biotinilato CD31 anticorpo diluito in un tampone di anticorpi (saponina 0,1% in PBS + 2% BSA)) sulla parte superiore per ogni tessuto, assicurarsi che il tessuto intero è coperto con soluzione di anticorpo. Incubazione per 1 ora a temperatura ambiente.
   2. Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti.
   3. Incubazione anticorpo secondario:. Soluzione di anticorpo secondario Drip ((1:100 streptavidina-CY3 diluito in tampone di anticorpo (0,1 saponina% in PBS + 2% BSA)) sulla sommità di tessuti Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
   4. Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti.
   5. Diapositive: Mount Drip 50:50 PBS con glicerolo in cima dei tessuti. Coprirecon polizza di copertura. Quindi, utilizzare smalto per sigillare il divario tra coprioggetto e scivolo.

5. Risultati rappresentativi

Immagini rappresentative di tessuti mesentere ratto immunoistochimicamente etichettati per PECAM sono mostrati in Figura 3. PECAM etichettatura identifica tutti i tipi di navi lungo la gerarchia di rimodellamento reti microvascolari e può essere usato per quantificare metriche angiogenici al momento specifico dopo stimolazione punti. PECAM etichettatura permette inoltre per la determinazione delle arteriole rispetto delle venule. Arteriole di alimentazione tipicamente presentano diametri più piccoli e di forma allungata morfologia delle cellule endoteliali rispetto a venule coppie (Figura 4). Capillari e germogli capillari possono essere identificati in base alla loro diametro del vaso e posizione relativa all'interno di una rete. Caratteristiche tipiche delle reti rimodellamento comprendono un aumento capillare germinazione, la densità di navi, per zona vascolarizzata e tortuoso venularelità. Quantificazione di vari parametri angiogenici identifica l'andamento nel tempo di crescita di rete (Figura 5). Capillare spuntano da vasi preesistenti, picchi tra il giorno 3 e il 5 ° giorno e ritorna al livello non stimolato dal 10 ° giorno. Questo aumento transitorio della germinazione è seguita da un aumento della densità vascolare e zona vascolarizzata. Come prova per il rimodellamento dei grandi vasi in questo modello, il numero di segmenti arteriole e venule aumenta anche nel corso del tempo.

Nel nostro laboratorio, questo modello è stato utilizzato per identificare cellulari variazioni fenotipiche al punto nel tempo specifico durante questo processo di rimodellamento ^{10, 11.} Ad esempio, classe III β-tubulina identifica periciti lungo vasi angiogenici (Figura 6). In tessuti non stimolate, classe III β-tubulina espressione è specifica del nervo. Al contrario, durante il picco di germinazione capillare, classe III β-tubulina è espresso da cellule perivascolari. Questo tipodel risultato evidenzia l'uso di questo modello semplice e robusto angiogenico di identificare nuovi tipi di cellule coinvolte nel processo angiogenico.

Figura 1. Immagini della fase plastica pre-e post-modifica. La fase di pre-modificato è un piatto di 100 millimetri Petri. Le modifiche comprendono un taglio ellittica foro al centro e la successiva aggiunta di creta o colla silicio al bordo del foro per la creazione di una sollevata, superficie liscia. Questa superficie fornisce un limite interno che facilita superfusione delle finestre mesenteriche esteriorizzato. Bar La scala è 1 cm.

Figura 2. Immagine della regione mesenterica esteriorizzato. Finestre mesenteriche sono definite come le membrane sottili traslucide tra l'arteria / vena coppie alimentano il piccolo intestino. Durante l'esteriorizzazionedurata, la regione mesenterici è disposto e immersa in soluzione salina all'interno di una capsula Petri modificato. Inerte plastilina giallo fornisce una superficie liscia per il mesentere per essere tirato attraverso il foro pretagliato. Bar La scala è 1 cm.

Figura 3. Immagini rappresentative dei mesenterici reti microvascolari non stimolate dai tessuti e tessuti a 3 e 10 giorni dopo l'esteriorizzazione del mesentere. PECAM etichettatura individuato la gerarchia delle reti microvascolari compreso, arteriole (A), venule (V) e capillari (C). Stimolazione Post, reti microvascolari visualizzato un aumento della germinazione capillare (punte di freccia) e la densità nave. Barra della scala è di 100 micron.

Immagini rappresentative Figura 4. Di arteriole / venule coppie di adulti all'interno della rete microvascolare mesenterica di rattos. In entrambe le immagini, arteriole (A) può essere differenziata da venule (V) basato su un diametro minore rispetto allungata e la morfologia delle cellule endoteliali. Barre di scala sono 20 micron.

Figura 5. Quantificazione Rappresentante di metriche angiogenici nel corso del tempo microvascolare esteriorizzazione mesentere messaggio crescita. A) nell'area vascolare per area di tessuto. B) Numero di germogli di capillari per area vascolare. C) Lunghezza totale vascolare per area vascolare. * Rappresenta una differenza significativa rispetto al gruppo non stimolato. Confronti statistici sono stati realizzati con un One-Way ANOVA seguita dal test di Dunn. (P <0,05). Delle Nazioni Unite rappresenta non stimolato.

Figura 6. Rappresentativi immagini fluorescenti di mesenterici reti microvascolari non stimolate dai tessuti e tessuti a 3 e 10giorni dopo l'esteriorizzazione del mesentere. Immunofluorescenza PECAM etichettatura (rosso) identifica le cellule endoteliali, e la classe III β-tubulina etichettatura (verde) identifica i nervi (punte di freccia) e cellule perivascolari (frecce). Cellule perivascolari transitoriamente upregulate classe III β-tubulina durante la germinazione capillare. In stimolate reti microvascolari, classe III β-tubulina è nervo specifico e non identificare le cellule perivascolari. 3 giorni dopo la stimolazione, classe III β-tubulina etichetta positivamente cellule perivascolari lungo microvasi. Di giorno 10, classe III β-tubulina modello di espressione inizia a ritornare allo scenario non stimolato. Barra della scala è di 50 micron.

Figura 7. Immagini che sostengono la fattibilità di monitoraggio pre-etichettati cellule localmente applicati durante la crescita della rete microvascolare stimolata dalla esteriorizzazione mesentere. Le cellule sono state superfuso sopra mesenteric finestre durante il periodo di 20 minuti l'esteriorizzazione. 1 giorno post-operatorio, Dii cellule marcate (rosso) sono stati osservati nel piano focale con dame PECAM positivo microvasi (verde). A, B) Esempi di cellule del midollo osseo Dii marcate esporre arrotondata e allungata morfologie. In alcuni casi (frecce) le cellule sono state allungata lungo microvasi. C) Esempio di un cluster di DII marcato cellule staminali mesenchimali in prossimità della punta di un capillare germoglio (freccia). Barre di scala sono 50 micron (A), e 20 micron (B, C).

Il modello di esteriorizzazione è stato segnalato nel 2006 e adattato da precedenti modelli meccanici mesentere ratto lesioni dell'angiogenesi ^4-7 e produce risultati simili a quelli già consolidati modelli ad iniezione ip che sfruttano il ratto mesentere ^9. Il tempo di esteriorizzazione 20 minuti è stato determinato sperimentalmente per produrre una robusta risposta angiogenica. Durante questo periodo di tempo può essere variata, lo fa permettere l'applicazione locale di inibitori angiogenici ⁴ per studi meccanicistici e l'applicazione diretta di cellule esogene per gli studi linea cellulare. Fattibilità di incorporazione cella in rimodellamento tissutale mesenterica è supportata da studi preliminari nel nostro laboratorio utilizzando pre-etichettati cellule del midollo osseo e cellule staminali mesenchimali (figura 7), e dal successo di indagare il destino dell'essere umano derivate da tessuto adiposo cellule stromali iniezione ip ¹⁴ . Nel nostro laboratorio, abbiamo usato questo modello per identificare Phen pericitiotypic modifiche nel corso del tempo di risposta angiogenica ¹⁰ e valutare il potenziale angiogenico in condizioni patologiche, quali ipertensione ^12. La risposta angiogenica e le modifiche fenotipo delle cellule associate a questo modello può essere osservato anche in altri modelli mesenteriche del ratto angiogenici tra cui l'esposizione cronica ipossia ^{10, 11.}

Un limite del modello di esteriorizzazione è che l'esatto meccanismo di innesco di angiogenesi sono sconosciuti. Esteriorizzazione del mesentere è stato collegato a degranulazione dei mastociti e aumento dei livelli di istamina ^6, ma sono necessarie ulteriori ricerche per ottenere un quadro più chiaro. Lo stimolo angiogenico è indubbiamente multi-fattoriale, producendo una risposta forte rimodellamento attraverso la gerarchia di una rete microvascolare. Mentre i meccanismi sconosciuti rimangono una critica importante di questo modello, la sua riproducibilità e la semplicità lo rendono interessante per l'identificazione dinamica del cellulare coinved nel intrinsecamente complesso processo di germinazione capillare. La riproducibilità del modello è supportato da comparabili metriche angiogenici nel corso tempo di crescita di rete microvascolare in ceppi multipli di ratto (Wistar maschi e femmina Sprague-Dawley) in studi pubblicati in precedenza dal nostro laboratorio ^{10, 12.} Poiché, la maggior parte dei tessuti adulti mesenterici ratto sono vascolarizzati, il modello consente anche per diversi tessuti da esaminare per animale. Purtroppo, questo modello non è ovviamente applicabile ai modelli murini genetici come finestre mesenterici mouse hanno meno vascolarizzazione nativa e, nella nostra esperienza, comunemente osservabili mancano reti ramificate. Le applicazioni future includono l'indagine di funzionalità nave durante l'angiogenesi con intra-vital microscopia in punti temporali specifici e l'indagine delle relative dinamiche cellulari coinvolti in linfoangiogenesi e neurogenesi. Anche se il grado di vascolarizzazione nativa per finestra mesenterica sembra essere roughly proporzionale con l'età, abbiamo osservato ramificazione reti microvascolari in ratti maschi Wistar di appena 4-5 settimane di età. Queste osservazioni suggeriscono che il modello esteriorizzazione potrebbe essere applicata anche per confrontare le differenze angiogeniche attraverso età.

Non abbiamo nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Board of Regents dello Stato della Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) e la Tulane e Centro Ipertensione renale di Eccellenza finanziato dal NIH concessione P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

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