Rata Exteriorización Mesenterio: un modelo para investigar la dinámica celulares implicados en la angiogénesis

Yang, M., Stapor, P. C., Peirce, S. M., Betancourt, A. M., Murfee, W. L. Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis. J. Vis. Exp. (63), e3954, doi:10.3791/3954 (2012).

Crecimiento de la red Microvacular y remodelación son aspectos críticos de la curación de heridas, la inflamación, retinopatía diabética, el crecimiento del tumor y otras condiciones de enfermedad ^{1, 2.} Crecimiento de la red se atribuye comúnmente a la angiogénesis, que se define como el crecimiento de nuevos vasos a partir de vasos preexistentes. El proceso angiogénico está también directamente relacionada con arteriogénesis, definida como la adquisición capilar de un revestimiento de células perivasculares y ampliación del vaso. Huelga decir que, la angiogénesis es complejo e involucra a varios jugadores en el nivel celular y molecular ^3. La comprensión de cómo una red microvascular crece es necesario identificar la dinámica espacial y temporal a lo largo de la jerarquía de una red a través de la evolución temporal de la angiogénesis. Esta información es crítica para el desarrollo de terapias dirigidas a manipular el crecimiento de vasos.

El modelo de exteriorización se describe en este artículo representa un modelo simple y reproducible para estimularlando la angiogénesis en el mesenterio de rata. Se adaptó a partir de modelos de cicatrización de heridas en la rata mesenterio ^4-7, y es una alternativa para estimular la angiogénesis en el mesenterio mediante inyecciones ip de agentes pro-angiogénicos ^{8, 9.} El modelo de exteriorización es atractiva debido a que requiere una intervención quirúrgica mínima y produce un aumento espectacular y reproducibles en los brotes capilares, área vascular y la densidad vascular durante un transcurso de tiempo relativamente corto en un tejido que permite la visualización en dos dimensiones de las redes microvasculares entero a un solo a nivel de célula. El crecimiento estimulado refleja naturales respuestas angiogénicas en un entorno fisiológico sin interferencia de extranjeros moléculas angiogénicas. El uso de métodos de etiquetado de inmunohistoquímica, este modelo se ha demostrado ser extremadamente útil en la identificación de nuevos eventos celulares implicados en la angiogénesis. Los investigadores pueden fácilmente relacionar las métricas angiogénicos durante el curso temporal de la remodelación con el tiempo specific dinámicas, tales como cambios fenotípicos celulares o interacciones celulares ^{4, 5, 7, 10, 11.}

1. Set-Up procedimiento quirúrgico Notas

1. Antes de la cirugía esterilizar material quirúrgico e instrumentos. Fuentes utilizadas para el procedimiento quirúrgico estéril para cada rata incluyen 1 drapeado que se tumbábamos como una superficie estéril para la colocación de instrumentos, una sábana con un agujero de pre-corte en aproximadamente 0,5 x 1,5 en el centro en que se coloca sobre la rata , y la gasa. El agujero de pre-corte en el paño se alinearán con la incisión hecha en la rata. Instrumentos necesarios para la cirugía incluyen 1 par de tijeras estándar que se usa para cortar material de sutura, pinzas dos y un soporte de aguja fina para la manipulación y la sujeción de la sutura, y un bisturí con una cuchilla. Hemos hecho una lista de las herramientas más comunes utilizadas por nuestro laboratorio en la tabla de determinados materiales y herramientas quirúrgicas. Sin embargo, la herramienta de selección final depende de las preferencias del experimentador.
2. Preparar el espacio cirugía. Colocar un 100 ml 0,9% bolsa de solución salina estéril bajo una almohadilla térmica para asegurar que la solución salina que entra en contacto won el tejido mesenterio es pre-calentado a aproximadamente 37 ° C. Como una alternativa a la solución salina, se puede utilizar la solución de Ringer o otro tampón fisiológico. Coloque los instrumentos quirúrgicos esterilizados y suministros en un campo estéril para facilitar el acceso durante el procedimiento de exteriorización. Además, tendrá estériles aplicadores de punta de algodón y los correspondientes 3 tipos de suturas (4-0, 5-0 y 7-0). Hace paquetes estén previamente abierto de modo que los materiales se puede acceder a la manipulación estéril. Finalmente, la desinfección de la etapa de plástico pre-modificado por inmersión en etanol al 100% durante al menos 5 minutos. La etapa es una placa de Petri de 100 mm con un agujero elíptico cortado en el centro (Figura 1). Una herramienta de Dremel se puede utilizar para hacer inicialmente y, si es necesario, ensanchar el agujero. Después de que el agujero se hace, los bordes de la corte se hacen de plástico liso usando papel de lija de diferentes granos. La etapa se lava a continuación y, finalmente, ya sea arcilla inerte (comprado en una tienda de artesanía local) o silícicoen cola se añade al borde del agujero con el fin de proporcionar una elevada, superficie lisa. Antes de ponerse en contacto con el tejido, la etapa tendrá que ser adecuadamente enjuaga con solución salina estéril.
3. Para este modelo de la angiogénesis, que normalmente utilizan ratas Wistar macho adultas (350 ± 25 g). Otras cepas de ratas y edades puede ser utilizado. En nuestro laboratorio, las ratas son anestesiadas por vía intramuscular con ketamina (80 mg / kg de peso corporal), xilacina (8 mg / kg de peso corporal), y la atropina (0,08 mg / kg de peso corporal). Después de aproximadamente 5 minutos, el efecto de la anestesia y se confirma la piel abdominal de la rata se afeitó.

2. Mesenterio Rata Exteriorización Modelo

1. Coloque la rata anestesiada en su espalda en un cojín de calefacción para mantener la temperatura corporal. Técnicas asépticas se utilizan durante el procedimiento quirúrgico. Use guantes estériles y no permitir que los instrumentos y suministros para ponerse en contacto con superficies no estériles que no sean los tejidos de rata.
2. Limpie la zona abdominal con la alternancia de paños using la gasa estéril empapada en isopropílico al 70% y el yodo.
3. Uso de la hoja de bisturí, hacer una pequeña (aproximadamente 0,75 pulgadas) incisión longitudinal a lo largo de la piel y luego la línea alba aproximadamente 1 pulgada por debajo del esternón.
4. Coloque el paño de pre-corte sobre la parte abdominal de modo que la abertura se alinea con la incisión.
5. Aplique suavemente la presión alrededor de la incisión. Esto suele resultar en una exposición del intestino delgado, lo suficiente para que pueda ser fácilmente identificado.
6. Uso de los aplicadores de punta de algodón, tire suavemente de una sección del intestino delgado y localizar el íleon. Como el mesenterio se sacó, se debe suavemente tumbábamos en la etapa de plástico (Figura 2).
7. Identificar 6-8 ventanas mesentéricas vascularizados. Una ventana mesentérica se define como la fina membrana translúcida entre los pares en la arteria / vena de alimentación del intestino delgado (Figura 2).
8. Anote la hora de inicio de exteriorización. Deje el mesenteRy sección exteriorizada durante 20 minutos. Durante el período de exteriorización, utilice una jeringa estéril (5 ml) para reponer la solución salina de forma intermitente en la placa de Petri para asegurar que el tejido permanece sumergido y no se seca.
9. Durante el tiempo de exposición de 20 minutos, marcar los 2 céntricos ventanas mesentéricas con estériles de sutura 7-0. Las marcas deben hacerse en la zona cerca de la grasa en el intestino.
10. Volver la región exteriorizada del mesenterio a la cavidad abdominal.
11. Cierre el músculo abdominal con sutura monofilamento 5-0 en el patrón de interrupción.
12. Cierre la piel con sutura monofilamento 4-0 en el patrón de interrupción.
13. Limpie el área suturada con la alternancia de paños con la gasa estéril empapada en el 70% isopropoyl y yodo.
14. Corre de gel lubricante ocular en ambos ojos de la rata. El propósito de lubricar el ojo es para evitar la desecación de la córnea durante el procedimiento quirúrgico y la recuperación. La aplicación de lubricante del ojo debe ser aplicadoantes del comienzo de la intervención quirúrgica. Si es necesario, volver a aplicar lubricante ocular antes de devolver la rata a su jaula para su recuperación.

3. La recolección y fijación de tejidos

1. En el día de estimulación interés puesto, anestesiar y la eutanasia a la rata. En nuestro laboratorio, las ratas son anestesiadas por vía intramuscular con ketamina (80 mg / kg de peso corporal), xilacina (8 mg / kg de peso corporal), y la atropina (0,8 mg / kg de peso corporal) y luego sacrificados mediante inyección intracardíaca de beuthanasia. Beuthanasia es una pentobarbital sódico / fenitoína solución que puede ser utilizado para la eutanasia rápida y sin dolor. Por rata nuestro laboratorio por lo general se inyecta 0,1 a 0,2 ml.
2. Vuelva a abrir la cavidad abdominal y retire con cuidado el intestino delgado y ubicar las ventanas de dos marcadas.
3. Recorta cada una de las ventanas mesentéricas exteriorizadas con pinzas y tijeras micro. La inclusión de una frontera de la ventana por la grasa es ventajosa para el tejido más adelante la difusión en portaobjetos de microscopio. Inmediatamente, Sumerja cada ventana en PBS. Al cortar, tratar de evitar que se corte a través de pares de la arteria / vena en el territorio de grasa de las ventanas para minimizar el potencial de la sangre de llenado de las ventanas. Además, minimizar el corte a través del intestino que resulta en contenido intestinal contactando las ventanas.
4. Use unas pinzas para extender los tejidos en el microscopio cargados positivamente. Dos tejidos se puede montar en cada diapositiva.
5. Permita que los tejidos se seque parcialmente y el uso de una hoja de bisturí quitar el exceso de grasa.
6. Los tejidos son ahora listo para ser reparado. Los métodos típicos de fijación puede ser utilizado. En nuestro laboratorio, que comúnmente se fijan los portaobjetos en metanol (-20 ° C) durante 30 min. El éxito de etiquetado También se ha realizado con tejidos no fijadas. Métodos de fijación podría depender de su anticuerpo preferido.

4. Tejido inmunomarcación

1. Los tejidos en general, pueden ahora ser etiquetados de acuerdo a las instrucciones por anticuerpos de inmunohistoquímica. Dado nuestro interés en la identificación de los rolesde pericitos vasculares durante la angiogénesis, nuestro laboratorio comúnmente etiquetas para las células endoteliales y perivasculares ^{10, 12, 13.} Etiquetas útiles para identificar las células endoteliales a lo largo de la jerarquía de las redes microvasculares son un anticuerpo anti-PECAM o BSI-lectina. Marcadores perivasculares de células utilizadas en este tejido incluyen NG2, desmina, actina SM-α, PDFGRβ, y clase III β-tubulina. A continuación, en la sección 3.3, ofrecemos una lista de protocolos para los protocolos de inmunomarcación colorimétricas y fluorescentes PECAM.
2. Antes de la incubación del anticuerpo primario inicial, los portaobjetos son secó a vacío para eliminar el exceso de solución tampón. Además, los tejidos se describe inicialmente con un lápiz de cera para evitar el flujo incontrolado de soluciones de anticuerpos lejos del tejido. Finalmente, todos los pasos de etiquetado son seguidos por los pasos de lavado. Para la limpieza de los pasos, las diapositivas se colocan dentro de recipientes de tinción. La solución tampón se intercambia 3 veces durante la duración de lavado.
3. Los procedimientos de las células endoteliales de anticuerpos de etiquetado: <p class = "jove_step"> PECAM colorimétrico Lableing
   1. Incubación del anticuerpo primario: goteo aproximadamente 100-200 ml de solución de anticuerpo primario (1:200 anticuerpo monoclonal de ratón biotinilado CD31 anticuerpo diluido en tampón de anticuerpo (0,1% de saponina en PBS + 2% de BSA)) en la parte superior de cada tejido; asegurarse de que el tejido completo es cubierto con una solución de anticuerpo. La incubación durante 1 hora a temperatura ambiente.
   2. Lavar tejidos con saponina PBS 0,1% durante 30 minutos.
   3. Incubación del anticuerpo secundario: solución por goteo anticuerpo secundario (Vectastain ABC Elite solución de Vector Laboratories; una solución peroxidasa estreptavidina anticuerpo secundario) en la parte superior de los tejidos. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
   4. Lavar tejidos con saponina PBS 0,1% durante 30 minutos.
   5. Incubar los tejidos con el vector de Nova Roja durante 15 minutos. A continuación, aumentar los tejidos con agua.
   6. Diapositivas de montaje: Dip diapositivas en el 95% de etanol 10 veces. Sumergir desliza en etanol al 100% durante 2 minutos. Sumerja los portaobjetos en etanol al 100% otra maneralución durante 2 minutos. Luego Sumerja los portaobjetos en xileno consecutivos soluciones 100% durante 2 minutos cada uno. Dejar secar y cubrir los tejidos con una capa delgada de VectaMount y un cubreobjetos.

   PECAM fluorescente de etiquetado

   1. Incubación del anticuerpo primario: goteo aproximadamente 100-200 ml de solución de anticuerpo primario (1:200 anticuerpo monoclonal de ratón biotinilado CD31 anticuerpo diluido en tampón de anticuerpo (0,1% de saponina en PBS + 2% de BSA)) en la parte superior de cada tejido; asegurarse de que el tejido completo es cubierto con una solución de anticuerpo. La incubación durante 1 hora a temperatura ambiente.
   2. Lavar tejidos con saponina PBS 0,1% durante 30 minutos.
   3. Incubación del anticuerpo secundario:. Solución por goteo anticuerpo secundario ((1:100 estreptavidina-CY3 diluyó en tampón de anticuerpo (0,1% de saponina en PBS + 2% de BSA)) en la parte superior de los tejidos Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
   4. Lavar tejidos con saponina PBS 0,1% durante 30 minutos.
   5. Diapositivas de montaje: goteo 50:50 PBS con glicerol en la parte superior de los tejidos. Cubrircon cubreobjetos. A continuación, utilice el esmalte de uñas para sellar la brecha entre cubreobjetos y portaobjetos.

5. Los resultados representativos

Imágenes representativas de los tejidos de rata mesenterio inmunohistoquímicamente etiquetados para PECAM se muestran en la Figura 3. PECAM etiquetado identifica todos los tipos de buques a lo largo de la jerarquía de la remodelación de redes microvasculares y se puede utilizar para cuantificar parámetros angiogénicos en el después de la estimulación específica de puntos de tiempo. PECAM etiquetado también permite la determinación de las arteriolas versus vénulas. Arteriolas alimentación exhiben típicamente diámetros más pequeños y la morfología alargada de células endoteliales en comparación con las vénulas apareados (Figura 4). Los capilares y los brotes capilares pueden ser identificados en función de su diámetro de los vasos y la posición relativa dentro de una red. Las características típicas de las redes de remodelación incluyen el aumento de brotes capilares, densidad de los vasos, zona vascularizada y tortuos venularesdad. La cuantificación de diversos parámetros angiogénicos identifica el curso del tiempo de crecimiento de la red (Figura 5). Capilar que brota de vasos preexistentes, picos entre los días 3 y 5 y regresa al nivel estimulada por el día 10. Este aumento transitorio de la germinación es seguido por un aumento en la densidad vascular y área vascularizada. Como prueba de la remodelación de los buques más grandes en este modelo, el número de segmentos de arteriolas y vénulas también aumenta en el transcurso del tiempo.

En nuestro laboratorio, este modelo ha sido utilizado para identificar cambios celulares fenotípicos en el punto de tiempo específico durante el proceso de remodelación ^{10, 11.} Por ejemplo, la clase III β-tubulina identifica pericitos a lo largo de los vasos angiogénicos (Figura 6). En los tejidos no estimulados, la clase III β-tubulina expresión es específica de los nervios. En contraste, durante el pico de brotes capilares, clase III β-tubulina se expresa en las células perivasculares. Este tipodel resultado pone de manifiesto la utilización de este modelo angiogénico simple y robusto para identificar nuevos tipos de células que intervienen en el proceso angiogénico.

Figura 1. Imágenes de la etapa de plástico pre-y post-modificación. La etapa de pre-modificado es un 100 mm de placa de Petri. Las modificaciones incluyen un corte agujero elíptico en el centro y la posterior adición de arcilla o pegamento de silicona al borde del agujero para la creación de una superficie elevada y lisa. Esta superficie ofrece una frontera interior que facilita la superfusión de las ventanas mesentéricas exteriorizarse. Barra de escala es de 1 cm.

Figura 2. Imagen de la región mesentérica exteriorizado. Ventanas mesentéricos se definen como las membranas delgadas translúcidas entre los pares de la arteria / vena que alimentan el intestino delgado. Durante la exteriorizaciónduración, la región mesentérica se presenta y se sumerge en una solución salina dentro de un plato de Petri modificada. Arcilla inerte modelado amarillo proporciona una superficie lisa para el mesenterio a pasar a través del agujero de pre-corte. Barra de escala es de 1 cm.

Figura 3. Imágenes representativas de las redes microvasculares mesentéricos de los tejidos y los tejidos sin estimular a las 3 y 10 días después de la exteriorización del mesenterio. PECAM etiquetado identificado la jerarquía de redes microvasculares incluyendo, arteriolas (A), vénulas (V) y capilares (C). Después de la estimulación, las redes microvasculares muestran un aumento de brotes capilares (puntas de flecha) y la densidad de los vasos. Barra de escala es de 100 m.

Figura 4. Imágenes representativas de las arteriolas / vénula pares dentro de la red microvascular rata adulta mesentéricas. En ambas imágenes, arteriolas (A) puede ser diferenciada de las vénulas (V) en base a un diámetro menor relativa y morfología alargada de células endoteliales. Las barras de escala son de 20 micras.

Figura 5. Representante de cuantificación de las métricas de angiogénicos en el transcurso el tiempo de exteriorización mesenterio microvascular crecimiento posterior. A) Área por área vascular del tejido. B) El número de brotes de capilares por área vascular. C) La longitud total por unidad de superficie vascular vascular. * Representa una diferencia significativa en comparación con el grupo no estimulado. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante un ANOVA de un factor seguido de la prueba de Dunn. (P <0,05). De las Naciones Unidas representa sin estimular.

Figura 6. Representante imágenes fluorescentes de redes microvasculares mesentéricos de los tejidos y los tejidos sin estimular a los 3 y 10días posteriores exteriorización del mesenterio. Inmunofluorescencia PECAM etiquetado (rojo) identifica las células endoteliales, y la clase III β-tubulina etiquetado (verde) identifica los nervios (puntas de flecha) y las células perivasculares (flechas). Las células perivasculares transitoriamente upregulate clase III β-tubulina durante la brotación capilar. En estimulados redes microvasculares, clase III β-tubulina es nervio específico y no identifica a las células perivasculares. 3 días después de la estimulación, la clase III β-tubulina positivamente a lo largo de las etiquetas de las células perivasculares microvasos. Durante el día 10, la clase III β-tubulina patrón de expresión comienza a volver a la situación no estimulada. Barra de escala es de 50 micras.

Figura 7. Imágenes que apoyan la viabilidad de seguimiento pre-etiquetados células aplicadas a nivel local durante el crecimiento de la red microvascular estimulado por la exteriorización mesenterio. Las células fueron superfused sobre mesenterIC ventanas durante el periodo de exteriorización de 20 minutos. Un día después de la cirugía, las células marcadas DII (rojo) se observaron en el plano focal con Dame PECAM positivo microvasos (verde). A, B) Ejemplos de DII etiquetados células de médula ósea exhibiendo redondeado y alargado morfologías. En algunos casos (flechas) las células fueron alargados a lo largo de los microvasos. C) Ejemplo de un grupo de Dil marcado las células madre mesenquimales, cerca de la punta de un brote capilar (flecha). Las barras de escala son de 50 micras (A), y 20 micras (B, C).

El modelo de exteriorización fue reportado en 2006 y es una adaptación de los modelos anteriores de lesiones mecánicas mesenterio de rata de la angiogénesis ^4-7 y produce resultados similares a los bien establecidos modelos de inyección de propiedad intelectual que se aprovechan de la rata mesenterio ^9. El tiempo de exteriorización 20 minutos se determinó experimentalmente para producir una respuesta angiogénica robusto. Si bien este período de tiempo podría variar, sí permite la aplicación local de los inhibidores angiogénicos ⁴ para estudios sobre el mecanismo y la aplicación directa de las células exógenas para los estudios de linaje celular. Viabilidad de la incorporación de células en la remodelación de los tejidos mesentéricos se apoya en estudios preliminares en nuestro laboratorio utilizando pre-etiquetados células de médula ósea y células madre mesenquimales (Figura 7), y por el éxito de la investigación del destino de los humanos adiposo derivado del estroma ip inyección de las células ¹⁴ . En nuestro laboratorio, hemos utilizado este modelo para identificar phen pericitosotypic cambios en el curso temporal de la respuesta angiogénica ¹⁰ y para evaluar el potencial angiogénico en condiciones patológicas, como la hipertensión ^12. La respuesta angiogénica y cambios en las células fenotipo asociado con este modelo también se puede observar en otros modelos de ratas mesentéricos angiogénicos, incluyendo la exposición crónica hipoxia ^{10, 11.}

Una limitación del modelo de exteriorización es que los mecanismos exactos que desencadenan de la angiogénesis son desconocidos. Exteriorización del mesenterio se ha relacionado con la degranulación de los mastocitos y aumento de los niveles de histamina ^6, pero se necesita más investigación para obtener una visión más clara. El estímulo angiogénico es, sin duda, multifactorial, que produce una respuesta robusta a través de la remodelación de la jerarquía de la red microvascular. Si bien los mecanismos desconocidos siguen siendo una gran crítica de este modelo, su reproducibilidad y sencillez lo hacen atractivo para la identificación de la dinámica celular INVOLca en el proceso de por sí complejo capilar germinación. La reproducibilidad del modelo se apoya en indicadores comparables angiogénicos en el transcurso el tiempo de crecimiento de la red microvascular a través de múltiples cepas de ratas (Wistar macho y hembra Sprague-Dawley) en los estudios previamente publicados de nuestro laboratorio ^{10, 12.} Puesto que, la mayoría de los tejidos de rata adulta mesentéricos son vascularizado, el modelo también permite múltiples tejidos para ser examinados por animal. Desafortunadamente, este modelo no es, obviamente, aplicable a los modelos de ratón genéticos como las ventanas de ratón tienen vascularización mesentérica inferior nativa y, en nuestra experiencia, normalmente carecen de observables redes ramificadas. Las aplicaciones futuras incluyen la investigación de la funcionalidad de buques durante la angiogénesis mediante microscopía de vital importancia dentro de en los puntos de tiempo específicos y relacionados con la investigación de la dinámica de celulares implicados en linfangiogénesis y la neurogénesis. Aunque el grado de vascularización nativa por ventana mesentérica parece ser rutinaghly proporcional con la edad, hemos observado la ramificación de redes microvasculares en ratas Wistar macho de tan sólo 4-5 semanas de edad. Estas observaciones sugieren que el modelo exteriorización podría aplicarse también para comparar las diferencias angiogénicos a través de las edades.

No tenemos nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por la Junta de Regentes del Estado de Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) y la hipertensión de Tulane y del Centro Renal de Excelencia financiados por el NIH subvención P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

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