The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 3Aflac Cancer Center and Blood Disorders Service of Children's Healthcare of Atlanta, 4Winship Cancer Institute of Emory University
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Myers, D. R., Sakurai, Y., Tran, R., Ahn, B., Hardy, E. T., Mannino, R., et al. Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases. J. Vis. Exp. (64), e3958, doi:10.3791/3958 (2012).
तकनीक microfabrication अग्रिम में 1,2 और सूक्ष्म nanoscales में जैविक और जैव रासायनिक प्रयोगों का आयोजन करने के लिए सस्ती और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सिस्टम microfluidic के उत्पादन में सक्षम है. इसके अलावा, Microfluidics को भी विशेष रूप से किया गया है करने के लिए मात्रात्मक hematologic और microvascular प्रक्रियाओं का विश्लेषण उनके लिए आसानी से गतिशील fluidic पर्यावरण और जैविक 3-6 शर्तों को नियंत्रित करने की क्षमता की वजह से, इस्तेमाल किया. जैसे, शोधकर्ताओं और अधिक हाल ही में microfluidic प्रणालियों का इस्तेमाल किया है रक्त कोशिका विरूपता, रक्त कोशिका एकत्रीकरण, microvascular रक्त प्रवाह, और रक्त सेल endothelial सेल बातचीत 6-13 का अध्ययन हालांकि, इन microfluidic सिस्टम या तो सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं को शामिल नहीं किया है या बड़े थे. sizescale प्रासंगिक microvascular वैकृत प्रक्रिया की तुलना में. सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं के साथ एक microfluidic मंच कि सही का स्मरण दिलाता है सेलुलर, शारीरिक, और hemodynmicrocirculation के अमोनियाई वातावरण hematologic रोगों कि microvasculature शामिल की अंतर्निहित biophysical pathophysiology के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने की जरूरत है.
यहाँ, हम एक विधि इन विट्रो मॉडल में microvasculature के एक "endothelialized" बनाने के लिए, मानक endothelial सेल संस्कृति तकनीक, वैकृत biophysical microvascular बातचीत कि hematologic रोग में होने का अध्ययन करने के साथ संयोजन के रूप में एक सरल, एकल मुखौटा microfabrication प्रक्रिया का उपयोग कर रिपोर्ट. यह एक मजबूत परख कि कस के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जैविक के biophysical स्थितियों पर नियंत्रण और एक मानक सिरिंज पंप और brightfield / प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संचालित के साथ शोधकर्ता "microvasculature पर-a-चिप" प्रदान करता है. Microcirculatory hemodynamic शर्तों, endothelial सेल प्रकार, रक्त कोशिका प्रकार (ओं) और एकाग्रता (एस), दवा / निरोधात्मक एकाग्रता आदि, जैसे पैरामीटर सब आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है. जैसे, हमारे माइक्रोसिस्टम प्रदान करता हैमात्रात्मक रोग प्रक्रियाओं जो में microvascular प्रवाह के कोशिका आसंजन, एकत्रीकरण, और विरूपता, एक मौजूदा assays के साथ अनुपलब्ध क्षमता में परिवर्तन के कारण बिगड़ा हुआ है की जांच के लिए विधि.
1. Endothelial microdevice का निर्माण
2. PDMS तैयार (polydimethylsiloxane)
3. Endothelial कोशिकाओं के साथ microfluidic युक्ति बोने
4. प्रतिनिधि परिणाम
"_content> इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, मानक lithographic तकनीक microfabrication microfluidic चैनलों है physiologically (चित्र 1 ए) microvasculature sizescale नकल उत्पादन के लिए जरूरत ढालना बनाने में उपयोग किया जाता है एक अनुकूलित छिड़काव तकनीक का प्रयोग, endothelial कोशिकाओं तो बीज और confluently संस्कृति सेल बोने के 24-48 घंटे के भीतर microfluidic प्रणाली (चित्रा 1 बी) के पूरे अंदरूनी सतह. microfluidic प्रणाली पारदर्शी है, पूरे microdevice / इमेजिंग और डेटा संग्रह के लिए प्रतिदीप्ति खुर्दबीन मंच brightfield पर रखा जा सकता है.फिर हमारा सिस्टम hematologic रोगों है कि सिकल सेल रोग के रूप में biophysical गुण, जिसमें sickled लाल कोशिकाओं और न्यायपालिका ल्युकोसैट और endothelial आसंजन की वृद्धि की कठोरता microvascular रुकावट के लिए योगदान को बदल शामिल अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. एक चिकित्सकीय अनुमोदित दवा, hydroxyurea के, लक्षण, लेकिन अपनी घ amelioratesmicrovascular प्रवाह पर प्रभाव irect अज्ञात है. हमारे परख दोनों सेल कठोरता और आसंजन के खाते में लेता है, और यह दर्शाता है कि hydroxyurea के काफी सिकल सेल रोग (चित्रा 2) में प्रवाह ameliorates.
दरांती सेल रोग microvasculature पर एक चिप के लिए एक आवेदन के केवल एक उदाहरण है, के रूप में इस प्रणाली के आदर्श के लिए किसी भी hematologic प्रक्रिया है जिसमें रक्त कोशिकाओं microvasculature में एक दूसरे को और endothelial कोशिकाओं के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. अन्य चिकित्सकीय प्रासंगिक अनुप्रयोगों भड़काऊ रोग, पूति / फेफड़ों की चोट, thrombotic microangiopathies को, मलेरिया और कैंसर मेटास्टेसिस में शामिल हैं, जबकि अधिक बुनियादी अनुप्रयोगों ल्युकोसैट जीव विज्ञान और hematopoietic स्टेम कोशिका जीव विज्ञान, कई अन्य लोगों के अलावा शामिल हैं.
चित्रा 1) endothelialization से पहले प्रारंभिक PDMS microfluidic युक्ति. यहाँ, microdevice बुद्धि इंजेक्शन हैघंटे खाद्य प्रणाली के की sizescale और समग्र डिजाइन वर्णन रंग. बी) Brightfield माइक्रोस्कोपी से पता चलता है microfluidic प्रणाली पूरी तरह से सेल बोने के 48 घंटे के भीतर endothelialized है यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग.
चित्रा 2.) Microchannels साथ microvasculature पर एक चिप के बाद केश (30 माइक्रोन) venules, सिकल सेल microvascular प्रतिरोधी घटनाओं की साइट का आकार करीब है. सिकल सेल से प्राप्त रोगियों hydroxyurea और प्राप्त hydroxyurea नहीं रोगियों से दो अलग अलग microvasculature पर-a-चिप उपकरणों के माध्यम से पूरे रक्त प्रवाहित है. बी) सिकल सेल रिश्तेदार आसानी से endothelialized microchannels भीतर hydroxyurea के प्रवाह को प्राप्त रोगियों से पूरे रक्त. सी) एक ही hemodynamic शर्तों के तहत, सिकल सेल रोगियों से प्राप्त hydroxyurea नहीं पूरे रक्त, तथापि, microch साथ अधिक सुस्त प्रवाह प्रदर्शनannel बाधा. नीचे चैनल नहीं प्रवाह के साथ पूरी तरह से बाधित है और अन्य endothelialized microchannels में प्रवाह वेग hydroxyurea के हालत की तुलना में काफी कम कर रहे हैं. सभी तीन छवियों में बड़े पैमाने बार 30 माइक्रोन है.
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हमारे endothelialized microdevice प्रणाली सबसे अच्छा है जब, vivo प्रयोगों में साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया अनुकूल है, और अपने न्यूनकारी दृष्टिकोण hematologic प्रक्रियाओं है कि मानव और पशु मॉडल में मनाया जाता है biophysical तंत्र को स्पष्ट में मदद मिल सकती है. इसके अलावा, हमारी प्रणाली की सीमाओं के बिना नहीं है. उदाहरण के लिए, हमारे microfluidic चैनल पार अनुभाग में वर्ग हैं. हालांकि तकनीकी परिपत्र microchannels 10,11 गढ़े जा सकता है, हम एक अधिक सरलीकृत और मानक निर्माण प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए अन्य शोधकर्ताओं ने आसानी से अपने काम करने के लिए इस प्रणाली को लागू करने की अनुमति के लिए चुना. इसके अलावा, बाहर दौर प्रभावी लुमेन "" स्वाभाविक रूप से सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं की उपस्थिति प्रणाली को और अधिक शारीरिक होने के लिए सक्षम करने से. इसके अलावा, हमारे द्रव गतिशील मॉडलिंग से पता चलता है कि हमारी प्रणाली में प्रवाह की स्थिति में vivo में microvasculature में तुलना कर रहे हैं. अंत में, हाल ही में काम वर्ग में रक्त के प्रवाह को निस्र्पकघ आयताकार microchannels दिखाया गया है कि उन के geometries रक्त rheology 15 प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं.
अंत में, हमारे परख करने के लिए अलगाव में मापने के लिए,, अलग सेलुलर biophysical गुण है कि microvascular रोड़ा करने के लिए नेतृत्व करने के लिए इरादा नहीं है. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी, micropipette आकांक्षा, और ऑप्टिकल फँसाने के रूप में तकनीक को अच्छी तरह से किया गया है प्रयोगों के उन प्रकार के लिए विशेषता है. इसके बजाय, हमारे माइक्रोसिस्टम का मूल्य इसकी क्षमता पुनरावृत्ति करना है, एक साथ और इन विट्रो प्रणाली में एक एकल, शारीरिक प्रक्रियाओं और आसंजन अणु अभिव्यक्ति, न्यायपालिका रक्त कोशिका endothelial सेल बातचीत, रक्त कोशिका एकत्रीकरण (जैसे घनास्त्रता सहित biophysical गुण, एक कलाकारों की टुकड़ी के भीतर ), सेल विरूपता, सेल आकार / आकार, microvascular ज्यामिति, और hemodynamics, जो सभी के विभिन्न रोग राज्यों में वैकृत microvascular सेलुलर बातचीत के लिए योगदान.
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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
हम टी. हंट, एम. Rosenbluth, और उनकी सलाह और उपयोगी विचार - विमर्श के लिए लैम लैब धन्यवाद. हम जी स्पिनर और इलेक्ट्रॉनिक्स और जॉर्जिया प्रौद्योगिकी संस्थान में नैनो के लिए संस्थान से समर्थन स्वीकार करते हैं. एक NIH K08 - HL093360 अनुदान, UCSF reac पुरस्कार, एक NIH Nanomedicine विकास और केंद्र PN2EY018244 पुरस्कार, और बच्चों के अटलांटा के हेल्थकेयर के Endothelial सेल बायोलॉजी के लिए केंद्र से धन के द्वारा इस कार्य के लिए वित्तीय समर्थन प्रदान किया गया.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
