Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).

Surtos ligados à transmitidas por alimentos e hospitalar e para conta de patógenos por milhões de mortes e internações, bem como colossais perdas econômicas a cada ano. Prevenção da ocorrência de tais surtos e minimização do impacto de um lugar epidemia em curso uma demanda cada vez maior de métodos analíticos que podem identificar com precisão patógenos culpado na primeira fase. Embora exista uma grande variedade de métodos eficazes para a detecção de patógenos, nenhum deles pode satisfazer todos os seguintes cinco requisitos principais incorporados por um método de detecção ideal: alta especificidade (detectando apenas a bactéria de interesse), de alta sensibilidade (capaz de detectar como baixa como uma célula viva único bacteriana), curto tempo-para-resultados (de minutos a horas), grande simplicidade operacional (sem necessidade de procedimentos de amostragem longos eo uso de equipamentos especializados), e rentabilidade. Por exemplo, de métodos microbiológicos clássicos são altamente específico, mas requer um tempo longo (days para semanas) para adquirir um resultado definitivo. ¹ PCR e anticorpo de técnicas baseadas em oferecer os tempos de espera mais curtos (horas a dias), mas requerem a utilização de reagentes dispendiosos e / ou equipamento sofisticado. ^2-4 Consequentemente, existe ainda uma grande demanda para a pesquisa científica para o desenvolvimento de inovadores métodos de detecção de bactérias que oferecem características melhoradas em um ou mais dos requisitos acima referidos. Nosso laboratório está interessado em examinar o potencial de DNAzymes como uma nova classe de sondas moleculares para aplicações biosensoriamento incluindo a detecção de bactérias ^5.

DNAzymes (também conhecido como deoxyribozymes ou enzimas de ADN) são feitas pelo homem moléculas de cadeia simples de ADN com a capacidade de catalisar reacções químicas. ^6-8 Estas moléculas podem ser isoladas a partir de uma piscina de DNA vasta sequência aleatória (que contém até 10 ¹⁶ seqüências individuais) por um processo conhecido como "seleção in vitro" or "SELEX" (evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial). ^9-16 Estas moléculas de DNA especiais têm sido amplamente analisados ​​nos últimos anos como ferramentas moleculares para aplicações biosensoriamento ^6-8.

O nosso laboratório estabeleceu em procedimentos de selecção in vitro para isolar RNA-clivagem DNAzymes fluorescentes (RFDs;. Fig. 1) e investigou a utilização de RFDs como ferramentas analíticas ^17-29 RFDs catalisar a clivagem de um substrato de ADN RNA-quimérico em um ribonucleótido único. junção (R) que é flanqueada por um fluoróforo (F) e um supressor (Q). A proximidade estreita do F e Q processa a fluorescência do substrato não clivado mínima. No entanto, o evento de clivagem conduz à separação de F e Q, o qual é acompanhado por um aumento significativo da intensidade de fluorescência.

Mais recentemente, foi desenvolvido um método de isolar RFDs para a detecção de bactérias. ⁵ Estes RFDs especiais foram isolados para "acender ", na presença da mistura em bruto extracelular (CEM) deixado para trás por um tipo específico de bactérias no seu ambiente ou nos meios de comunicação que são cultivadas (Fig. 1). A utilização de mistura bruta contorna o tedioso processo de purificação e a identificação de um alvo adequado a partir do micróbio de interesse para o desenvolvimento de biossensores (que poderia levar meses ou anos para completar). A utilização de alvos extracelulares, o procedimento ensaio é simples porque não há necessidade de passos para obter alvos intracelulares.

Usando o método acima, nós derivado uma RFD que cliva o seu substrato (FS1;. Fig. 2A) apenas na presença do CEM produzido por E. coli (CEM-CE). ⁵ Este E. coli com detecção RFD, chamado RFD-EC1 (Fig. 2A), foi encontrada a ser estritamente responsivo a CEM-CE, mas não responsiva ao CEM a partir de um hospedeiro de outras bactérias (Fig. 3).

Aqui nós Present os procedimentos fundamentais experimentais para criação de E. coli ensaios de detecção utilizando resultados de RFD-EC1 e representativa.

1. Preparação de Soluções Químicas

1. 0,5 M de etileno diaminotetraacético ácido acético (EDTA): Em um litro 2 (L) copo de plástico, pesar 186,1 g de EDTA (EM Science) e adicionar 800 mililitro (mL) de água desionizada destilada autoclavado _(ddH2O). Ajustar o pH a 8,0 usando NaOH peletes (EM Science). Completar o volume final para 1 L utilizando DDQ ₂ O. Transferir a solução para frascos de vidro, autoclave e armazenar a 4 ° C.
2. 10 × Tris-borato EDTA solução (10 × TBE; 89 mM de Tris, 89 mM de ácido bórico, 2 mM de EDTA, pH 7,5): Pesar 432 g de Tris-base (BioShop Canadá) e 220 g de ácido bórico (BioShop Canadá) , e adicionar cada um para um copo de plástico 4 L. Medir 80 mL de EDTA 0,5 M (pH 8,0) e adicionar à proveta. Adicionar _ddH2O para um volume final de 4 L. Misturar cuidadosamente a solução com uma barra de agitação magnética até componentes são completamente dissolvido. Transferir a solução para frascos de vidro, autoclave e armazenar a 4 ° C.
3. 10% de desnaturação polyacrylamide estoque de gel: A uma proveta de plástico 4 L, adicionar 1681,7 g de ureia (BioShop Canadá), 400 mL de 10 × TBE, 1 L de 40% de acrilamida / bisacrilamida solução (29:1) (BioShop Canadá). Ajuste o volume de 4 L com DDH ₂ O. Dissolve-se a ureia, com agitação. Transferir a solução para 1 L frascos de vidro âmbar e armazenar a 4 ° C. (Atenção! acrilamida deve ser manuseado com luvas, máscara, óculos e jaleco, pois é uma neurotoxina antes de polimerização).
4. 2 × tampão de carregamento de gel (2 × GLB): A uma proveta de vidro de 200 mL, adicionar 44 g de ureia, 8 g de sacarose (BioShop Canadá), 10 mg de azul de bromofenol (BioShop Canadá), 10 mg de xylenecyanol FF (Sigma -Aldrich), 400 uL de sulfato de dodecilo de sódio a 10% (SDS; BioShop Canadá), e 4 mL de 10 × TBE. Ajustar o volume final para 40 mL com _ddH2O e dissolver os sólidos com aquecimento suave (50 ° C) e agitando com uma barra magnética. Transferir 1 alíquota mL em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e armazenar a 4 ° C. Com base no nossoexperiência, é necessário aquecer 2 × brevemente GLB a 90 ° C antes de usar, porque 2 × GLB solidifica sob a condição de armazenamento.
5. 1 M de Tris-HCl (pH 7,5): Pesar 12,1 g de Tris-base em um copo de vidro de 200 mL. Adicionar 60 ml de _ddH2O e dissolver os sólidos por agitação com um agitador magnético. Ajustar o pH a 7,5 usando HCl 1 M (Sigma-Aldrich). Perfaz-se o volume para 100 mL com _ddH2O e transferir para um frasco de vidro e autoclave. Armazenar a 4 ° C.
6. 5 M de NaCl: Em proveta de vidro de pesar 58,4 g de NaCl (BioShop Canadá) e dissolvem-se com 150 mL de DDQ ₂ O. Ajuste o volume para 200 mL com DDH ₂ O. Transferir a solução para um autoclave de vidro garrafa, e armazenar a 4 ° C.
7. Tampão de eluição de ADN: Em um copo de vidro, misturar 2 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 8 mL de NaCl 5 M e 0,4 mL de EDTA 0,5 M (pH 8,0). Ajuste o volume para 200 mL com DDH ₂ O. Autoclave e armazenar a 4 ° C.
8. 2 × reação tampão (2 x RB; 100 mM de HEPES, 300 mM de NaCl, 30 mM MgCl _2): A uma 50 mL Falcon tubo (BD Falcon), adicionar 1,2 g de HEPES (BioShop Canadá), 0,88 g de NaCl e 0,30 g de MgCl ₂ • 6H ₂ ó (Merck Química) e 30 mL de DDH ₂ O. Misturar por agitação suave até componentes são completamente dissolvido. Ajustar o pH a 7,5 por adição de 10 N solução de NaOH e ajustar o volume final para 50 mL com DDQ ₂ O. Purifica-se a solução usando uma unidade de seringa orientado de filtro (0,22, Millipore) e armazenar a 4 ° C.
9. Luria Bertani Broth (LB): Em um copo, pesar 20,0 g de pó de LB (Sigma-Aldrich), seguido pela adição de 1 L de DDQ ₂ O. Misturar bem a solução com uma barra de agitação magnética, transferir a solução para um balão de Erlenmeyer. Autoclavar a solução e armazenar à temperatura ambiente.
10. Agar LB 1,5%: Pesar 1,5 g de agar (BioShop Canadá) num balão de 250 mL e adicionar 100 mL de LB líquido. Autoclavar a mistura e armazenamento em temperatura ambiente.
11. Plaqueamento em ágar: Melt de agar LB num forno de microondas e solução a arrefecer até ~ 50 ° C. Despeje a solução em placas de Petri (Fisher Scientific), sob uma chama. Na nossa experiência, 100 mL de ágar LB pode produzir 5-6 placas.

2. Construção de RFD-EC1 e RFSS1 por Template Mediado Ligadura enzimática

RFD-EC1 (Fig. 2A) é o DNAzyme destaque. Consiste no EC1 sequência catalítica eo substrato sequência FS1 (indicado por linhas pretas e verde na Fig. 2A). RFSS1 (Fig. 2A) é uma versão codificada de RFD-EC1, onde o EC1 sequência catalítica é parcialmente embaralhada no SS1, mas a porção de FS1 permanece inalterado. RFD-EC1 e RFSS1 foram feitas por modelo mediada ligadura enzimática do FS1 oligonucleótido com EC1 oligonucleótido ou SS1, na presença de LT1 como o modelo de ligação (ver a caixa inserida na fig. 2A). O procedimento para a realização da reacção de ligação é fornecida abaixo.FS1 foi obtido a partir das instalações Síntese de Oligo Keck da Universidade de Yale, desprotegido e purificado por eletroforese em gel na sequência de um protocolo previamente estabelecido. ^17-24 EC1, SS1 e LT1 foram adquiridos a partir de Tecnologias Integradas de DNA e purificado por eletroforese em gel.

1. Prepare uma solução estoque 100 mM de FS1, EC1, SS1 e LT1 usando DDH ₂ O. Armazená-los a -20 ° C até à utilização.
2. Transferir 5 uL da solução de estoque de FS1 para dois tubos de microcentrífuga 1,5 uL marcados como o tubo 1 e do tubo 2. Para cada tubo, adicionar 38,5 uL de _ddH2O e, em seguida uL 5 de 10 × quinase de polinucleótidos de T4 (PNK) tampão de reacção A (MBI Fermentas), que contém 500 mM de Tris-HCl (pH 7,6, 25 ° C), 100 mM _MgCl2, 50 mM de DTT, 1,0 mM de espermidina. Misturar cada solução por pipetagem (pipetar a solução cima e para baixo algumas vezes).
3. Adicionar 1 mL de ATP (100 mM; MBI Fermentas) e misturar por pipetagem.
4. Adicionar 0,5 uL de quinase de polinucleótidos de T4 (PNK; 10 unidades / uL; MBI Fermentas) e misturar por pipetagem. Incubar as misturas reaccionais a 37 ° C durante 30 min. Certifique-se de cobrir os tubos com papel alumínio para minimizar a fotodegradação do fluoróforo.
5. Extingue-se a reacção por aquecimento a 90 ° C durante 5 min. Arrefecer as misturas de reacção à temperatura ambiente durante 10 min.
6. Adicionar 5 uL do EC1 e SS1 solução stock para o tubo 1 e do tubo 2, respectivamente.
7. Adicionar 5 uL da solução de estoque de LT1 a cada tubo da mistura, por pipetagem. Aquecer as misturas reaccionais a 90 ° C durante 1 min e arrefecer à temperatura ambiente durante 10 min.
8. Adicionar 118 uL de _ddH2O e em seguida 20 uL de 10 × T4 DNA ligase de tampão (MBI Fermentas), que contém 400 mM de Tris-HCl (pH 7,8 a 25 ° C), 100 _mM de MgCl2, 100 mM de DTT, e 5 mM de ATP. Misturar a solução por pipetagem.
9. Adicionar 2 ul de DNA-ligase de T4 (5 unidades / uL; MBI Fermentas) e misturar por pipetagem. Incubar as misturas de reacção à temperatura ambiente durante 1 h.
10. Adicionar 20 ul de NaOAc 3 M (pH 7,0) a cada tubo de vórtice, e girar para baixo. Adicionar 500 ul de etanol a 100% frio a cada tubo, misturar a solução por vórtice e colocar os tubos em congelador -20 ° C durante 30 min.
11. Centrifugar as misturas de 11.000 g durante 20 min a 4 ° C, numa centrífuga refrigerada (Allegra X22-R, Beckman Coulter) e cuidadosamente remover o sobrenadante por pipetagem.
12. Seca-se o sedimento de DNA usando um concentrador de DNA (Savant Speedvac DNA, Thermo Scientific) durante 10 min.
13. Pelotas de DNA Ressuspender em 30 ul de 1 × gel tampão de carregamento (GLB), brevemente vortex e girar com uma centrífuga de bancada (Minicentrifuge, VWR Scientific). As amostras de DNA ligado estão prontos para o carregamento de um gel dPAGE 10%.

3. Preparação de gel de 10% dPAGE

Os passos seguintes descrevem brevemente o aparelho de electroforese em gel ea sua configuração. Para maiores detalhes sobre os aparelhos, configurações e manuseio, consulte tOh nosso protocolos previamente publicados ^30,31.

1. Lavar e secar duas placas de vidro, dois espaçadores 0,75 mm e um pente 16 poços. Montar placas de vidro e espaçadores com os grampos e deitou horizontalmente sobre uma superfície plana, com placa de vidro com entalhe virado para cima.
2. Transferir 40 mL de mistura dPAGE 10% para um copo de 150 mL. Adicionar 40 ul de tetrametiletilenodiamina (TEMED; Bioshop Canadá), 400 uL de APS 10%, e misturar por agitação com um pipetador.
3. Verter a mistura cuidadosamente entre as placas e imediatamente inserir o pente. Permitir que a mistura a polimerizar durante 10 a 20 min. A polimerização pode ser confirmada através da verificação da mistura de gel residual deixado no copo.
4. Uma vez polimerizado, remover o pente suavemente e enxaguar os poços com _ddH2O para remover a solução de gel residual em poços.
5. Montar as placas para o aparelho de electroforese em gel com a placa sem entalhe rectangular voltada para fora e colocar uma placa de metal para trás a placa dentada. A utilização do pl de metalcomeu ajuda a evitar o superaquecimento, que pode quebrar as placas de vidro.
6. Adicionar 1 × TBE para as câmaras superior e inferior do aparelho. Verificar para assegurar que os poços são preenchidos com o tampão ea extremidade inferior do gel é imerso no buffer.
7. Aplicar um mA 40 (ou 750 V) de corrente e pré-executado por 10 a 15 min.

4. A purificação do ligadura RFD-EC1 e RFSS1 por Gel dPAGE 10%

1. Seguindo o passo de 3,7, lavar os poços com 1 × TBE utilizando uma seringa e uma agulha.
2. Carregar a mistura de ligação de RFD-EC1 e que de RFSS1 (a partir de 2,13) ​​em 2 poços (um para cada um) usando um pipetador e pontas de gel de carga (Diamed). Aplicar um mA 40 (750 V) de corrente até que o corante de fundo (azul de bromofenol) é de aproximadamente 5 cm acima da aresta inferior das placas.
3. Remover placas de vidro do aparelho funcionamento gel, deitar-se no topo de uma bancada plana e remova cuidadosamente os espaçadores.
4. Cuidadosamente remover as placas de vidro de topo a partir do gel eembrulhar o gel com plástico (tentar evitar rugas e pregueamento da envoltórios sobre o gel).
5. Os produtos com ligadura pode ser visualizada, quer por sombreamento UV (260 nm) ou por transiluminação (360 nm), o que irá produzir uma banda de DNA visível alguns centímetros acima EC1 ou SS1 (100 pmol de EC1 ou SS1 pode ser usado como um marcador e carregados em um poço no passo de 4,2). Marcar as bandas de ADN desejados com um marcador.
6. A banda de DNA Excise com lâminas de barbear estéreis, cortar o gel em pedaços pequenos e transferir para um tubo de microcentrífuga fresco 1,5 mL.
7. Triturar os pedaços de gel dentro do tubo de microcentrifugação, utilizando uma ponta de pipeta estéril (200 tamanho da ponta uL).
8. Adicionar 500 uL de tampão de eluição de DNA para cada tubo e cobrir com folha de alumínio para proteger os fluoróforos da luz. Vortex as amostras durante 10 min.
9. Centrifugar as amostras a 11.000 g durante 4 min a 4 ° C, numa centrífuga refrigerada (Allegra X22-R, Beckman Coulter) e transferir cuidadosamente a 350 uL de supernatant para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (se necessário, uma segunda eluição pode ser feito com 350 uL de tampão de eluição fresco para mais 10 min).
10. Adicionar 35 uL (0,1 × do volume da amostra) de acetato de sódio 3 M (NaOAc, pH 7,0) a cada tubo, mistura por vórtice e centrifugação para baixo. Adicionar 900 uL de etanol a 100% frio a cada tubo. Misturar cada amostra com a mão-agitação do tubo durante alguns segundos. Colocar os tubos à temperatura de -20 ° C durante pelo menos 1 h.
11. Centrifugar as amostras a 11.000 g durante 20 min a 4 ° C, numa centrífuga refrigerada e cuidadosamente remover o sobrenadante por pipetagem.
12. Adicionar 100 ul de etanol a 70% frio e usá-lo para enxaguar levemente toda a parede interior do tubo. Re-centrifuga a 11.000 g durante 7 minutos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e secar o sedimento utilizando o concentrador de DNA durante 10 min.
13. Dissolve-se os peletes de DNA em 100 uL de _ddH2O e vórtice. Determinar a concentração de DNA com base na absorvância de UV a 260 nm. Armazene as amostras a -20° C até à utilização.

5. Preparação de Bactérias

1. O alvo bactéria E. coli K12 (MG1655) e estirpes de controlo relevantes são em primeiro lugar semeados em placas de ágar LB das existências de glicerol. Sob uma chama ou dentro de uma cabine de segurança biológica, tocar o estoque de glicerol bacteriana com uma ponta de pipeta estéril e gentilmente raia para a superfície da placa para evitar danificar o agar LB.
2. Inverter as placas listradas e incubar a 37 ° C por 14 h. Após a incubação, selar todo o perímetro das placas com Parafilm (Pechiney embalagens de plástico) e armazenar a 4 ° C. Estas placas podem ser armazenados por um período máximo de 4 semanas.

6. Preparação de Misturas bruto extracelulares (CEM)

1. Dispense 2 mL de LB em tubos de cultura estéreis 14 ml (BD Falcon), usando uma arma pipeta (Corning).
2. Usando uma ponta de pipeta estéril, escolher uma única colónia de uma placa de agar preparado na etapa de 5,2 e inseri-lo em actubo ulture. Colocar os tubos em um incubador (New Brunswick Scientific), fixado em 37 ° C, e agitar a 250 rpm durante 14 h.
3. 1% de cultura re-inoculação: Pipetar 2 mL de LB fresco em 14 tubos de cultura mL e espiga com 20 uL de culturas bacterianas, preparado no passo 6.2. Incubar os tubos a 37 ° C com agitação a 250 rpm até que cada solução bacteriana atinge uma _DO600 (densidade óptica medida a 600 nm) de aproximadamente 1. Para medir a OD _600, transferir 1 mL de cada cultura para uma cuvete descartável e absorvância medida a 600 nm com um espectrofotómetro de UV (Genesys UV 10, Thermo Scientific).
4. Transferir 1 mL de cada cultura para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e as células de pelotas por centrifugação a 11.000 g durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Transferir o sobrenadante límpido para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20 ° C, se não for utilizado imediatamente.

7. Detecção utilizando Espectrofotômetro de Fluorescência

1. Ligue espectrofotômetro de fluorescência (Cary Eclipse, Varian Inc) e configurar os parâmetros de aquisição de dados com excitação a 488 nm e emissão a 520 nm. As leituras são realizadas em cada minuto durante 1 h.
2. Lavar 3 cuvetes de cristal de quartzo (Varian Cary) com _ddH2O, seguido por etanol a 100%. Seque as cubetas pelo piscar de gás nitrogênio. Rótulo cuvetes C1 (controle 1), C2 (controle 2) e T (teste).
3. Transferir 24 uL de _ddH2O para C1 e 24 uL de CEM-CE para C2 e T. Adicionar 25 ul de 2 × RB para cada cuvete e colocá-los no espectrofotômetro de fluorescência. Iniciar a coleta de dados de fluorescência para primeiros 5 min.
4. Adicionar 1 mL de RFSS1 (a partir de uma solução estoque de 5 mM) para C2 e 1 uL de RFD-EC1 (a partir de uma solução estoque de 5 mM) a T e C1. Misturar cada solução por pipetagem. Isto deve ser cuidadosamente iniciada de modo que as leituras de fluorescência não são interrompidos. Permitir que a reacção continuar durante o resto do tempo de aquisição de 1 h.
5. Salvaros dados em formato Excel, transferir os dados para um computador pessoal e dados de processo para criar uma imagem gráfica.

8. Detecção por eletroforese em gel

As misturas de reacção idênticas, preparado no passo 7,4 pode ser usado para a análise por electroforese em gel, alternativamente novas reacções podem ser preparados de forma semelhante e incubadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Em qualquer dos casos:

1. As reacções de têmpera (após 1 h) por adição de 5 ul de NaOAc 3 M e 125 ul de etanol a 100%. Misturar cada solução por vórtice e colocar os tubos em congelador -20 ° C durante 1 h.
2. Centrifugar as misturas reaccionais a 11.000 g durante 20 min a 4 ° C e cuidadosamente remover o sobrenadante por pipetagem.
3. Secam-se as pelotas usando o concentrador de DNA durante 10 min.
4. Ressuspender pelotas em 20 uL de 1 × GLB por breves instantes vortex. Girar tubos muito brevemente com uma centrífuga de bancada (Minicentrifuge, VWR Scientific). Estas amostras são lidosy para o carregamento num gel dPAGE.
5. Preparar um gel dPAGE 10% tal como descrito no 3,1-3,7. Carregar as amostras reaccionais (a partir do passo 8.4) para os poços, utilizando um pipetador e pontas de gel de carga (Diamed). Aplicar um mA 40 (750 V) de corrente até que o corante de fundo (azul de bromofenol) é de aproximadamente 5 cm acima da aresta inferior das placas.
6. Remover placas de vidro e lave com água da torneira para remover todos os pedaços de gel. Limpe as placas com um Kimwipe (Kimberly-Clark Professional).
7. Verificar a placa de gel de fluorescência usando um scanner Typhoon (Tufão 9200, de modo variável, a GE Healthcare). Analisar os dados utilizando software ImageQuant (Dinâmica Molecular).

9. Especificidade Detecção

1. Para testar a especificidade bacteriana, os mesmos procedimentos descritos acima para a cultura de E. coli, a preparar o seu CEM e conduzindo um ensaio de reacção de clivagem pode ser realizada por um número de diferentes estirpes bacterianas, tais como B. subtilis, P. Peli, Y. ruckeri, L. planturum, P. acidilactici (mostrado na fig. 3A).

10. Detecção de Single Cell

Prepara-se uma 1 mL E. estoque coli glicerol de 2 UFC / mL (CFU: unidade formadora de colônia) por diluição em série e confirmar concentração CFU por plaqueamento ⁵ Este estoque deve conter 0,2 uL ufc/100.. Armazenar a -80 ° C até à utilização.

1. Preparar 10 tubos de cultura contendo 2 mL de LB.
2. Inocular cada cultura com 100 uL de 2 estoque de glicerol UFC / mL e incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm. A utilização do stock de glicerol inteira (1 mL) deverá produzir 10 culturas.
3. UL colheita 300 de cada tubo de cultura inoculado com os seguintes tempos: 4, 8, 12, 16 e 24 h. Deixar a cultura restante de crescer durante 24 h.
4. Medir a OD ₆₀₀ e precipitar as células por centrifugação a 11.000 g durante 5 min.
5. Transfira os CEMs para novas tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e armazenar a -20 & dpor exemplo; C até à utilização.
   Nota: Como pode não haver OD detectável ₆₀₀ para amostras colhidas em tempo de pontos 4, 8 e 12, permitem que a cultura restante de crescer durante 24 h, a fim de identificar culturas contendo bactérias (determinado por medição da turbidez e OD). Apenas uma ou duas das 10 culturas podem conter E. coli após a inoculação e os tubos restantes não conterá quaisquer células.
6. Use as CEM recuperados a partir de culturas positivas (armazenada a -20 ° C) com os pontos temporais designados para preparar reacções de clivagem com RFD-EC1, e então analisar as misturas reaccionais utilizando electroforese em gel de dPAGE como descrito na Secção 8.

11. Resultados Conceito e Representante

O conceito de exploração um RNA-cleaving DNAzyme fluorescente (RFD) para a detecção de bactérias é ilustrado na fig. 1. O RFD cliva um ADN quimérico / substrato de RNA em um RNA isolado de ligação (azul R) flanqueado por dois nucleótidos marcadoscom um fluoróforo (F) e um supressor (Q), respectivamente. Como uma bactéria de interesse (tais como E. coli) cresce em meios de comunicação, que vai deixar para trás uma mistura em bruto extracelular (CEM). Este CEM como um todo é então usada em um experimento selecção in vitro para se obter um RFD que é responsiva especificamente ao CEM; presumivelmente o RFD interage com uma molécula específica (estrela púrpura) no CEM que é uma molécula de assinatura da bactéria. Quando o CEM é adicionado à solução de reacção contendo o RFD, desencadeia a actividade de RNA-cleaving do RFD. O evento de clivagem separa F a partir de Q, resultando em um sinal fluorescente que pode ser detectada quer utilizando um fluorímetro ou por electroforese em gel.

A validação experimental do conceito acima foi feito com o CEM a partir de E. coli (CEM-CE). Foram obtidos 3 moléculas RFD através selecção in vitro, ea uma mais eficiente foi designado como RFD-EC1 (Fig. 2A). ⁵ We testada a actividade de clivagem de RFD-EC1 (juntamente com uma sequência mutante chamado RFSS1) em resposta a CEM-CE. Ambos RFD-EC1 e RFSS1 foram preparados por ligação enzimática das porções DNAzyme ao substrato FS1 (todas as sequências são mostradas na fig. 2A). No experimento medições de fluorescência (Fig. 2B), CEM-CE foi incubada sozinho durante 5 min, seguido pela adição de RFD-EC1 ou RFSS1, e por incubação adicional durante 55 min mais. A intensidade de fluorescência da solução foi continuamente ler todos os minutos e os dados foram utilizados para calcular a fluorescência relativa (RF; calculado como a razão entre a intensidade de fluorescência no tempo t vs a intensidade de fluorescência em tempo 0). Os valores de Rf versus o tempo de incubação são traçados como mostra a fig. 2B. Verificou-se que RFD-EC1 produziu um elevado nível de sinal de fluorescência após a adição de CEM-CE; em contraste, RFSS1 não produzir um sinal forte fluorescência. Assim, o fu-produzindo fluorescêncianction de RFD-EC1, ao contatar CEM-CE é uma sequência específica.

A fim de verificar se os aumentos observados de fluorescência são devido à clivagem da ligação de ARN, analisou-se misturas de reacção por dPAGE. A clivagem do RFD-EC1 é esperado para gerar dois fragmentos de ADN, um 5 'do fragmento de retenção do fluoróforo e um 3' fragmento mantendo a quencher. Apenas não clivado RFD-EC1 (unclv) e 5 'do fragmento (CLV) poderia ser detectada por imagens de fluorescência. O resultado dPAGE mostrado na fig. 2C revela que a mistura de reacção de RFD-EC1 e CEM-CE mesmo produzido o produto de clivagem esperado, enquanto a mistura RFSS1/CEM-EC não o fez.

A especificidade do RFD-EC1 foi examinada usando CEM recolhidos a partir de várias outras bactérias gram negativas e gram-positivos e os dados são mostrados na fig. 3A. Apenas a amostra de contendo CEM-CE (azul curva) produziu um aumento na fluorescência. A falta de reactividade cruzada com CEMsa partir das outras bactérias indica que RFD-EC1 é altamente selectivo para E. coli.

Nós também examinou o tempo necessário para a cultura de uma única E. coli célula a fim de produzir CEM suficiente que pode induzir a clivagem do RFD-EC1. Para esta experiência, a E. coli amostra contendo definido CFU (unidades formadoras de colónias) foi diluída de forma adequada para alcançar a concentração de 1 UFC / mL. Isto foi seguido por mistura de 100 uL da amostra diluída com meio de crescimento bacteriano e de cultura-lo para 4, 8, 12, 16 e 24 h. CEM foram então recolhidos para cada ponto temporal e testado para induzir a actividade de clivagem de RFD-EC1. O resultado dPAGE mostrado na fig. 3B indica que um tempo de cultura de 12 h é necessário.

É importante notar que o aumento do sinal inicial pequeno observada em medições de fluorescência após a adição de RFSS1 sequência (como um controlo negativo) para CEM-CE (Fig. 2B; vermelho Curve) ou RFD-EC1 a outros CEM bacterianas (Fig. 3B; todas as curvas, excepto azul) é atribuída à fluorescência intrínseca do módulo FRQ (devido à têmpera incompleta de F por Q). Assim, espera-se que a adição de F e Q-rotulados sequências iria produzir um aumento inicial de fluorescência. No entanto, apenas misturas RFD-EC1/CEM-EC são capazes de produzir um alto nível de fluorescência ao longo do tempo.

Figura 1. Ilustração esquemática da fluorescente DNAzyme RNA-clivagem da sonda (RFD) que fluoresce Em contacto com a mistura em bruto extracelular (CEM), produzida por células bacterianas específicas de interesse. O RFD cliva um ADN quimérico / substrato de RNA em um RNA isolado de ligação (azul R) flanqueado por dois nucleótidos marcados com um fluoróforo (F) e um supressor (Q), respectivamente. Antes da reacção de clivagem, o nível de fluorescência do RFD é mínima, devido à proximidade estreitaimity de F e P. Após a clivagem, Q afasta F; como resultado, um sinal forte fluorescência é produzido.

Figura 2. A E. coli sensível RFD. (A) RFD-EC1 é a sonda DNAzyme que pode ser activado pela CEM-CE. RFSS1 é uma sequência codificada de RFD-EC1 usado como um controlo. RFD-EC1 e RFSS1 foram produzidos por ligação de FS1 com EC1 e SS1, respectivamente, na presença de LT1 como o modelo. F: fluoresceína modificado desoxitimidina. Q: DABCYL modificado desoxitimidina. R: ribonucleótido adenina. (B) de fluorescência de sinalização perfis de RFD-EC1 e RFSS1 na presença de CEM-CE. (C) Análise dPAGE das misturas de clivagem de reacção em B (tempo de reacção: 60 min). Na foto é uma imagem de fluorescência do gel dPAGE obtidos com pelo scanner Typhoon. Lane, NC: RFD-EC1 ou RFSS1 no tampão de reacção sozinho; Pista CEM-CE: RFD-EC1 ou RFSS1 no tampão de reacção contendo CEM-CE. Marcador: RFD-CE1 tratado com NaOH 0,25 N, um procedimento conhecido por causar clivagem completa de RNA. unclv: não clivado RFD-EC1. CLV: o fragmento de clivagem contendo o fluoróforo.

Figura 3. (A) de fluorescência de sinalização perfil de RFD-EC1 em CEM preparados a partir de várias células bacterianas. CE: Escherichia coli K12-; PP: Pseudomonas peli; BD: Brevundimonas diminuta; HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri; OG: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans; MO: Moraxella phenylpyruvica; AI: Acinetobacter lwoffi; SF: Serratia fonticola; BS: Bacillus subtilis, LM: Leuconostoc mesenteroides; LP: planturum Lactobacillus; PA: Pediococcus acidilactici; AO: Actinomyces orientalis. Cada amostra CEM foi incubada durante 5 min, seguido pela adição de RFD-EC1. (B) dPAGEanálise de misturas RFD-EC1/CEM-EC após uma reacção de 60 min. Pista NC1: RFD-EC1 no tampão de reacção sozinho. Lane, NC2: RFD-EC1 no tampão de reacção contendo CEM-BS (o CEM preparado a partir de Bacillus subtilis). As pistas marcadas com 4, 8, 12, 16 e 24: RFD-EC1 no tampão de reacção contendo CEM-CE tomadas a partir da cultura bacteriana contendo um único E. coli célula após um período de crescimento de 4, 8, 12, 16 e 24 h, respectivamente.

A maioria dos métodos de detecção de bactérias comuns hoje são ou lenta (microbiana clássico) ou tecnicamente exigentes (anticorpo, PCR). Assim, acreditamos que a próxima geração de ferramentas de detecção deve atender para velocidade e simplicidade. Para este fim, criámos um RNA-clivagem e fluorescência de sinalização DNAzyme que pode ser usado para desenvolver ensaios simples para relatar a presença de bactérias através da geração de um sinal de fluorescência. O destaque DNAzyme sonda, RFD-EC1, é ativado pela CEM produzido durante o crescimento de E. coli em meios de cultura. Uma vez que o nosso método utiliza bruto misturas extracelulares de uma bactéria como o alvo de detecção e ignora a extracção alvo trabalhoso e passos de amplificação, ele pode ser usado para definir-se muito simples, "mistura-e-ler" tipo de ensaios para a detecção de bactérias. A utilização da nossa DNAzyme não se restringe a método de detecção de fluorescência com base. Por exemplo, a detecção colorimétrica utilizando o mesmo sistema de ensaio c DNAzymeum ser concebido usando um método relatado anteriormente que explora a amplificação círculo rolante em conjunção com um pigmento orgânico. ³² Nós prever a utilização de DNAzymes para a detecção de bactérias como uma avenida atraente para gerar novos biossensores bacterianas com maior simplicidade operacional.

Não há conflitos de interesse declarados.

O financiamento para este trabalho foi fornecida pelas Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada (NSERC) eo Sentinela Rede papel bioativo.

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