Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).

Uitbraken gekoppeld aan door voedsel overgedragen en het ziekenhuis opgelopen pathogenen zijn goed voor miljoenen doden en ziekenhuisopnames als kolossale economische verliezen elk jaar. Preventie van dergelijke uitbraken en minimalisering van de impact van een voortdurende epidemie plaats een steeds toenemende vraag naar analysemethoden die nauwkeurig kan boosdoener ziekteverwekkers in een zo vroeg stadium. Hoewel er een groot scala van effectieve methoden voor het opsporen van ziekteverwekkers, kan geen van hen voldoet aan alle volgende vijf belangrijkste eisen opgenomen voor een ideale detectie methode: een hoge specificiteit (het opsporen van alleen de bacterie van belang), hoge gevoeligheid (voor het opsporen van zo laag als een levende bacteriële cel), korte time-to-resultaten (minuten tot uren), grote operationele eenvoud (geen behoefte aan lange bemonstering procedures en het gebruik van gespecialiseerde apparatuur), en kosteneffectiviteit. Bijvoorbeeld klassieke microbiologische methoden zijn uiterst specifiek, maar een lange tijd (days tot weken) om een definitief resultaat te verkrijgen. ^een PCR-en antilichaam-gebaseerde technieken bieden kortere wachttijden (uren tot dagen), maar ze vereisen het gebruik van dure reagentia en / of geavanceerde apparatuur. ^2-4 dus, is er nog een grote behoefte aan wetenschappelijk onderzoek naar de ontwikkeling van innovatieve bacteriële detectiemethoden die verbeterde eigenschappen in een of meer van de hiervoor genoemde eisen aan te bieden. Ons laboratorium is geïnteresseerd in het onderzoeken van de mogelijkheden van DNAzymes als een nieuwe klasse van moleculaire probes voor biosensing toepassingen, waaronder bacteriële detectie. ⁵

DNAzymes (ook bekend als deoxyribozymes of DNA-enzymen) zijn kunstmatige enkelstrengs DNA-moleculen met het vermogen van chemische reacties katalyseren. ^6-8 Deze moleculen kunnen worden geïsoleerd uit een groot willekeurige sequentie DNA pool (die maximaal 10 bevat ¹⁶ individuele reeksen) door een proces dat bekend staat als 'in vitro selectie "or "SELEX" (systematische ontwikkeling van liganden door exponentiële verrijking). ^9-16 Deze speciale DNA-moleculen zijn op grote schaal onderzocht in de afgelopen jaren als moleculaire tools voor biosensing toepassingen. ^6-8

Ons laboratorium heeft in vitro selectie procedures voor het isoleren van RNA-splitsende fluorescerende DNAzymes (RFD;. Fig. 1) en onderzocht het gebruik van RFDs als analytische instrumenten ^17-29 RFDs de splitsing van een DNA-RNA-chimere substraat katalyseren op een enkele ribonucleotide. verbinding (R) die wordt geflankeerd door een fluorofoor (F) en een quencher (Q). De nabijheid van F en Q maakt het niet-geknipte substraat minimale fluorescentie. De splitsing gebeurtenis leidt tot de scheiding van F en Q, die gepaard gaat met significante toename van de fluorescentie intensiteit.

Meer recent hebben we een methode ontwikkeld voor het isoleren van RFDs voor bacteriële detectie. ⁵ Deze speciale RFD's werden geïsoleerd op "oplichten "in aanwezigheid van het ruwe mengsel extracellulaire (CEM) liet een specifiek type bacteriën in de omgeving of in de media ze gekweekt (Fig. 1). Het gebruik van ruwe mengsel voorkomt de moeizame proces van zuivering en identificeren van een geschikt doel van microbe van belang biosensoren (die maanden of jaren duren). Het gebruik van extracellulaire doelen: de keuring procedure eenvoudig omdat er geen behoefte stappen intracellulaire doelen te verkrijgen.

Met deze werkwijze verkregen we een RFD dat het substraat splitst (FS1;. Fig. 2A) in de aanwezigheid van de CEM door E. coli (CEM-EG). ⁵ Dit E. coli-sensing RFD, genaamd RFD-EC1 (Fig. 2A), bleek strikt reageren op CEM-EG, maar reageert niet op CEM van een gastheer van andere bacteriën (afb. 3).

Hier hebben we PreseNT de belangrijkste experimentele procedures voor het opzetten van E. coli detectie assays met behulp van RFD-EC1 en representatieve resultaten.

1. Voorbereiding van chemische oplossingen

1. 0,5 M ethyleen diaminetetraacetic azijnzuur (EDTA): In een 2 liter (L) plastic beker, weegt 186,1 g EDTA (EM Science) en voeg 800 milliliter (ml) van geautoclaveerd gedeïoniseerd-gedestilleerd water (DDH ₂ O). Breng de pH op 8,0 met NaOH pellets (EM Science). Maak het uiteindelijke volume van 1 L met behulp van DDH ₂ O. De oplossing voor glazen flessen, autoclaaf en bewaren bij 4 ° C.
2. 10 x Tris-boraat EDTA (10 x TBE, 89 mM Tris, 89 mM boorzuur, 2 mM EDTA, pH 7,5): Weeg 432 g Tris-base (BioShop Canada) en 220 g boorzuur (BioShop Canada) en toevoegen elk 4 L kunststof beker. Meet 80 ml van 0,5 M EDTA (pH 8,0) en toe te voegen aan de beker. Voeg DDH ₂ O tot een uiteindelijk volume van 4 L. goed mengen van de oplossing met een magnetische roerstaaf tot componenten zijn volledig is opgelost. De oplossing voor glazen flessen, autoclaaf en bewaren bij 4 ° C.
3. 10% denaturerende polyacrylamide gel voorraad: Om een ​​4 L plastic beker, voeg 1681,7 g ureum (BioShop Canada), 400 ml van 10 × TBE, 1 L van 40% acrylamide / bisacrylamide (29:1) oplossing (BioShop Canada). Zet het volume op 4 L met DDH ₂ O. Los het ureum onder roeren. De oplossing tot 1 liter amberkleurige glazen flessen en bewaren bij 4 ° C. (Let op Acrylamide moet gehanteerd worden met handschoenen, masker, bril en labjas omdat het een neurotoxine voorafgaand aan polymerisatie).
4. 2 × gel laadbuffer (2 × GLB): Om een ​​200 ml bekerglas, voeg 44 g ureum, 8 g sucrose (BioShop Canada), 10 mg broomfenolblauw (BioShop Canada), 10 mg xylenecyanol FF (Sigma -Aldrich), 400 pi 10% natriumdodecylsulfaat (SDS; BioShop Canada), en 4 ml 10 x TBE. Stel het eindvolume 40 ml met DDH ₂ O en los van de vaste stoffen met milde verwarming (50 ° C) en roeren met een magnetische staaf. Breng 1 ml aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij 4 ° C. Gebaseerd op onzeervaring moet warmte 2 x GLB kort bij 90 ° C voor gebruik door 2x GLB stolt onder opslagomstandigheden.
5. 1 M Tris-HCl (pH 7,5): Weeg 12,1 g Tris-base in een 200 ml glazen beker. 60 ml van DDH ₂ O en los van de vaste stoffen door roeren met een magnetische roerder. PH op 7,5 met 1 M HCl (Sigma-Aldrich). Vul met water aan tot 100 ml met DDH ₂ O en over te dragen aan een glazen fles en autoclaaf. Bewaar bij 4 ° C.
6. 5 M NaCl: In glazen beker weegt 58,4 g NaCl (BioShop Canada) en los op met 150 ml van DDH ₂ O. Pas het volume aan tot 200 ml met DDH ₂ O. Breng de oplossing voor een glazen fles, autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
7. DNA elutiebuffer: In een bekerglas mix 2 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8 ml 5 M NaCl en 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Pas het volume aan tot 200 ml met DDH ₂ O. Autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
8. 2 × reactie buffer (2 x RB, 100 mM HEPES, 300 mM NaCl, 30 mM _MgCl2) een 50 mL Falconbuis (BD Falcon) toevoegen 1,2 g HEPES (BioShop Canada), 0,88 g NaCl en 0,30 g _MgCl2 • 6H ₂ O (EMD Chemicals) en 30 ml van DDH ₂ O. Meng door schudden mild tot componenten zijn volledig is opgelost. PH 7,5 door toevoeging van 10 N NaOH-oplossing en pas het eindvolume tot 50 ml met DDH ₂ O. Zuiveren behulp van een spuit aangedreven filter (0,22 pm, Millipore) en sla op 4 ° C.
9. Luria Bertani (LB) Broth: In een bekerglas gewicht 20,0 g LB poeder (Sigma-Aldrich) gevolgd door de toevoeging van een L DDH ₂ O. Grondig de oplossing te mengen met een magnetische roerstaaf, breng de oplossing een erlenmeyer. Autoclaaf de oplossing en bewaar bij kamertemperatuur.
10. 1,5% LB-agar: Weeg 1,5 g agar (BioShop Canada) in een kolf van 250 ml en voeg 100 ml vloeistof LB. Autoclaaf het mengsel en bewaar bij kamertemperatuur.
11. Agar plating: Melt de LB agar in een magnetron en laat de oplossing ~ 50 ° C. Giet de oplossing in petrischalen (Fisher Scientific) onder een vlam. In onze ervaring, kunnen 100 ml LB-agar opleveren 5-6 platen.

2. De bouw van RFD-EC1 en RFSS1 door Template gemedieerd enzymatische ligatie

RFD-EC1 (fig. 2A) is de aanbevolen DNAzyme. Het bestaat uit de katalytische sequentie EC1 en het substraat sequentie FS1 (aangegeven met zwarte en groene lijnen in Fig. 2A). RFSS1 (fig. 2A) is een gecodeerde versie van de RFD-EC1, waar de katalytische volgorde EC1 is gedeeltelijk geschud in SS1, maar de FS1 gedeelte blijft ongewijzigd. RFD-EC1 en RFSS1 werden door template gemedieerde enzymatische ligatie van het oligonucleotide FS1 met oligonucleotide EC1 of SS1 in aanwezigheid van LT1 de ligatie sjabloon (zie geplaatst box in Fig. 2A). De procedure voor het uitvoeren van ligatiereactie wordt hieronder gegeven.FS1 werd verkregen van Keck Oligo Synthese-voorzieningen aan de Yale University, ontschermd en gezuiverd door gel elektroforese volgens een vooraf vastgesteld protocol. ^17-24 EC1, SS1 en LT1 werden gekocht van Integrated DNA Technologies en gezuiverd door gel elektroforese.

1. Bereid een 100 uM stockoplossing van FS1, EC1, SS1 en LT1 met behulp van DDH ₂ O. Bewaar ze bij -20 ° C tot gebruik.
2. Overdracht 5 pi van de FS1 voorraad oplossing voor twee 1,5 pl microcentrifugebuizen gemarkeerd als Tube 1 en buis 2. Aan elke buis toe 38,5 pi DDH ₂ O en 5 pi 10 x T4 polynucleotide kinase (PNK) reactie buffer A (MBI Fermentas), 500 mM Tris-HCl (pH 7,6, 25 ° C) bevat, 100 mM _MgCl2, 50 mM DTT, 1,0 mM spermidine. Meng elke oplossing door pipetteren (pipetteer de oplossing op en neer een paar keer).
3. Voeg 1 ul van ATP (100 mM; MBI Fermentas) en meng door pipetteren.
4. Voeg 0,5 ul van T4 polynucleotide kinase (PNK; 10 eenheden / ul; MBI Fermentas) en meng door pipetteren. Incubeer de reactiemengsels bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Zorg ervoor dat de buizen te bedekken met aluminiumfolie te minimaliseren fotobleken van de fluorofoor.
5. Doof het reactiemengsel door verwarming bij 90 ° C gedurende 5 minuten. Koel de reactiemengsels bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
6. Voeg 5 ul van de EC1 en SS1 stockoplossing aan buis 1 en buis 2, respectievelijk.
7. Voeg 5 ul van de LT1 stockoplossing aan elke buis, mengen door pipetteren. Verwarm de reactiemengsels bij 90 ° C gedurende 1 minuut en afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
8. Voeg 118 ul van DDH ₂ O en 20 pi 10 x T4 DNA ligase buffer (MBI Fermentas), die 400 mM Tris-HCl (pH 7,8 bij 25 ° C), 100 mM _MgCl2, 100 mM DTT en 5 bevat mM ATP. Meng de oplossing door pipetteren.
9. Voeg 2 ul van T4 DNA-ligase (5 eenheden / ul; MBI Fermentas) en meng door pipetteren. Incubeer de reactiemengsels bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
10. Voeg 20 ul van 3 M NaOAc (pH 7,0) aan elke buis, vortex en spin neer. Voeg 500 ul koud 100% ethanol elke buis Meng door vortexen en zet de buizen -20 ° C diepvriezer gedurende 30 minuten.
11. Centrifugeer de mengsels bij 11.000 g gedurende 20 min bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge (Allegra X22-R, Beckman) en voorzichtig de supernatant verwijderd door het pipetteren.
12. Droog de DNA-pellet met een DNA concentrator (Savant DNA Speedvac Thermo Scientific) gedurende 10 minuten.
13. Resuspendeer DNA-pellets in 30 ul van 1 x gel laadbuffer (GLB), kort vortex en naar beneden draaien met een benchtop centrifuge (Minicentrifuge, VWR Scientific). De geligeerde DNA klaar voor het laden van 10% dPAGE gel.

3. Voorbereiding van 10% dPAGE Gel

De volgende stappen kort de inrichting van gelelektroforese en opstelling. Voor meer details over de apparatuur, instellingen en behandeling, verwijzen wij u to onze eerder gepubliceerde protocollen. ^30,31

1. Was en droog twee glazen platen, twee 0,75 mm spacers en een 16-well kam. Monteer glasplaten en afstandhouders met clips en leg horizontaal op een vlakke ondergrond met een getande glazen plaat naar boven.
2. Overdracht 40 ml 10% dPAGE mengsel in een 150 ml bekerglas. Voeg 40 ul van tetramethylethyleendiamine (TEMED; Bioshop Canada), 400 pl van 10% APS, en mengen door schudden met een pipet.
3. Giet het mengsel over de borden en steek direct de kam. Laat het mengsel polymeriseren 10 tot 20 min. Polymerisatie kan worden bevestigd door het controleren van de resterende gel mengsel in het bekerglas.
4. Eenmaal gepolymeriseerd, verwijder voorzichtig de kam en spoel de putten met DDH ₂ O om de resterende gel oplossing te verwijderen in de putten.
5. Monteer de platen op de gel-elektroforese apparaat met de ongekerfd rechthoekige plaat naar buiten gericht en plaats een metalen plaat achter de getande plaat. Het gebruik van de metalen platen helpt om oververhitting te voorkomen die kunnen barsten van de glasplaten.
6. Voeg 1 x TBE de bovenste en onderste kamers van de inrichting. Controleer de putjes gevuld met de buffer en de onderrand van de gel wordt ondergedompeld in de buffer.
7. Breng een 40 mA (of 750 V) de huidige en pre-run voor 10 tot 15 minuten.

4. Zuivering van geligeerde RFD-EC1 en RFSS1 met 10% dPAGE Gel

1. Na de stap van 3,7, spoel putten met 1 x TBE met behulp van een spuit en een naald.
2. Plaats het ligatiemengsel van RFD-EC1 en die van RFSS1 (van 2,13) ​​in 2 wells (een voor elke) met een pipet en gel loading uiteinden (DiaMed). Breng 40 mA (750 V) stroom totdat de onderste kleurstof (broomfenolblauw) ongeveer 5 cm boven de onderrand van de platen.
3. Verwijder de glazen platen uit de gel werking apparaat, liggen op een vlakke werktafel, en verwijder voorzichtig de afstandhouders.
4. Verwijder voorzichtig de bovenste glasplaten uit de gel enWikkel de gel met plastic folie (proberen te rimpels en vouwen van de wikkels op de gel te voorkomen).
5. De geligeerde producten kan worden gevisualiseerd door UV schaduw (260 nm) of transilluminatie (360 nm), die een zichtbare DNA band zal een enkele centimeters EC1 of SS1 (100 pmol van EC1 of SS1 worden gebruikt als een marker en geladen in een goed in de stap van 4.2). Markeer de gewenste DNA-banden met een marker.
6. Accijnzen van de DNA-band met steriele scheermesjes, snijd de gel in kleine stukjes en de overdracht in een verse 1,5 ml microcentrifugebuis.
7. Plet de gel stukken binnen het microcentrifugebuis met een steriele pipet (200 ul tip formaat).
8. Voeg 500 ul DNA elutiebuffer aan elke buis en bedek ze met aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming tegen licht. Vortex de monsters gedurende 10 minuten.
9. Centrifugeer de monsters bij 11.000 g gedurende 4 min bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge (Allegra X22-R, Beckman) Breng voorzichtig 350 pi van de supernatant een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuisje (indien nodig, een tweede elutie kan met 350 ul vers elutiebuffer nog 10 min).
10. Voeg 35 ul (0,1 x van het monstervolume) 3 M natriumacetaat (NaOAc, pH 7,0) aan elke buis, mengen door vortexen en spin neer. Voeg 900 uL van koude 100% ethanol aan elke buis. Meng elk monster met de hand-schudden van de buis voor een paar seconden. Plaats de buizen bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
11. Centrifugeer de monsters bij 11.000 g gedurende 20 min bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge en voorzichtig de supernatant verwijderd door het pipetteren.
12. Voeg 100 pi koude 70% ethanol en gebruiken zachtjes spoelen de gehele binnenwand van de buis. Re-centrifuge bij 11.000 g gedurende 7 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en pellet drogen de DNA concentrator 10 minuten.
13. Los het DNA pellets in 100 pl DDH ₂ O en vortex. Bepaal de DNA-concentratie op de UV-absorptie bij 260 nm. Store monsters bij -20° C tot gebruik.

5. Voorbereiding van de bacteriën

1. Het doel bacteriële stam E. coli K12 (MG1655) en relevante controle-stammen worden eerst uitgeplaat op LB agar platen uit glycerol voorraden. Onder een vlam of binnen een biologische veiligheidskast, drukt u op de bacteriële glycerol voorraad met een steriele pipet tip en zacht streep op de plaat oppervlak om beschadiging van de LB-agar.
2. Omgekeerde gestreepte platen en incuberen bij 37 ° C gedurende 14 uur. Na de incubatie, verzegelen de gehele omtrek van de platen met Parafilm (Pechiney Plastic Packaging) en bewaar bij 4 ° C. Deze platen kunnen worden opgeslagen maximaal 4 weken.

6. Voorbereiding van Ruwe extracellulaire mengsels (CEMS)

1. Breng 2 ml van LB in steriele 14 ml cultuur buizen (BD Falcon) met een pipet pistool (Corning).
2. Met behulp van een steriele pipet tip, kies een enkele kolonie uit een agarplaat bereid in de stap van 5.2 en plaats deze in acCULTUUR buis. Plaats buizen in een incubator (New Brunswick Scientific) op 37 ° C en schudden bij 250 rpm voor 14 uur.
3. 1% re-inoculatie cultuur: Breng 2 ml van de verse LB in 14 ml cultuur buizen en spike met 20 ul van bacteriële culturen bereid in stap 6.2. Incubeer de buizen bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm tot elke bacteriële oplossing bereikt een OD ₆₀₀ (optische dichtheid gemeten bij 600 nm) van ongeveer 1. Om OD ₆₀₀ te meten, breng 1 ml van elke cultuur op een wegwerp kuvet en meet de absorptie bij 600 nm met een UV-spectrofotometer (Genesys UV 10, Thermo Scientific).
4. Breng 1 ml van elke kweek een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuisje en pellet cellen door centrifugeren bij 11.000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Breng de heldere supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en bewaar bij -20 ° C als niet onmiddellijk wordt gebruikt.

7. Detectie met behulp van fluorescentie Spectrofotometer

1. Zet fluorescentie spectrofotometer (Cary Eclipse, Varian Inc) en het opzetten van data-acquisitie parameters met excitatie bij 488 nm en emissie bij 520 nm. Metingen kan iedere minuut gedurende 1 uur.
2. Was 3 kristal cuvetten (Varian Cary) met DDH ₂ O, gevolgd door 100% ethanol. Droog de cuvetten door het knipperen van stikstofgas. Label cuvetten C1 (controle 1), C2 (controle 2) en T (test).
3. Overdracht 24 pl van DDH ₂ O naar C1 en 24 ul van de CEM-EG tot en met C2 en T. 25 ui van 2 × RB Voeg toe aan elke cuvet en plaats ze in de fluorescentie spectrofotometer. Beginnen met het verzamelen fluorescentie gegevens voor de eerste 5 minuten.
4. Voeg 1 ul van RFSS1 (van 5 pM voorraadoplossing) en C2 een pi-RFD EC1 (van 5 pM voorraadoplossing) T en C1. Meng elke oplossing door pipetteren. Dit moet zorgvuldig worden ingesteld zodat de fluorescentie scherm niet onderbroken. Laat de reactie blijven voor de rest van de 1 h acquisitietijd.
5. Besparende gegevens in Excel-formaat, de gegevens overzetten naar een pc en te verwerken tot een grafische afbeelding te maken.

8. Detectie van gelelektroforese

Dezelfde reactie mengsels in stap 7.4 kan worden gebruikt voor analyse door gel elektroforese alternatief nieuwe reacties kunnen eveneens worden bereid en geïncubeerd in 1,5 ml reactievaatjes. In beide gevallen:

1. Quench reacties (na 1 uur) door toevoeging van 5 ul 3 M NaOAc en 125 ul 100% ethanol. Meng elke oplossing door vortexen en plaats de buizen in -20 ° C vriezer gedurende 1 uur.
2. Centrifugeer de reactiemengsels bij 11.000 g gedurende 20 min bij 4 ° C en voorzichtig de supernatant verwijderd door het pipetteren.
3. Droog de pellets de DNA concentrator 10 minuten.
4. Resuspendeer pellets in 20 ul van 1 × GLB door kort vortexen. Spin down buizen heel kort met een benchtop centrifuge (Minicentrifuge, VWR Scientific). Deze monsters worden gelezeny voor het laden in een dPAGE gel.
5. Bereid een 10% dPAGE gel zoals beschreven in 3,1-3,7. Laad de reactie monsters (van stap 8.4) in de putjes met een pipet en gel laden tips (DiaMed). Breng 40 mA (750 V) stroom totdat de onderste kleurstof (broomfenolblauw) ongeveer 5 cm boven de onderrand van de platen.
6. Verwijder de glazen platen en grondig wassen met water uit de kraan op een gel stukken te verwijderen. Veeg platen met een kimwipe (Kimberly-Clark Professional).
7. Scan de gelplaat fluorescentie met een Typhoon Scanner (Typhoon 9200, Variable-modus, GE Healthcare). Analyseer de gegevens met behulp van ImageQuant software (Molecular Dynamics).

9. Detectie Specificiteit

1. Voor het testen bacteriële specificiteit dezelfde procedures als hierboven beschreven voor het kweken E. coli kan bereiden zijn CEM en uitvoeren van een splitsingsreactie assay uitgevoerd voor een aantal verschillende bacteriestammen zoals B. subtilis, P. peli, Y. ruckeri, L. planturum, P. acidilactici (zie Fig. 3A).

10. Single Cell Detectie

Bereid een 1 ml E. coli glycerol voorraad van 2 CFU / ml (CFU: kolonievormende eenheid) door seriële verdunning en bevestig CFU concentratie door plating ⁵ Deze voorraad moet 0,2 kve/100 ul bevatten.. Bewaren bij -80 ° C tot gebruik.

1. Doe in 10 cultuur buizen met 2 ml van LB.
2. Geënt elke cultuur met 100 pi 2 CFU / ml glycerol en incuberen bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm. Het gebruik van het gehele glycerol (1 ml) moet opleveren 10 culturen.
3. Oogst 300 pi van elke geënte buis op de volgende tijdstippen: 4, 8, 12, 16 en 24 uur. Laat de rest van de cultuur om te groeien gedurende 24 uur.
4. Meet de OD ₆₀₀ en neerslaan van de cellen door centrifugeren bij 11.000 g gedurende 5 minuten.
5. Breng de CEM in de frisse 1,5 ml reactievaatjes en bij -20 & dbijvoorbeeld, C tot gebruik.
   Opmerking: Aangezien er geen detecteerbare OD ₆₀₀ voor monsters geoogst tijdstippen 4, 8 en 12, zodat de resterende cultuur groeien gedurende 24 uur om culturen met bacteriën (bepaald door troebelheid en OD gemeten) identificeren. Slechts een of twee van de 10 kweken kan E. coli na enten en de overige buizen bevat geen cellen.
6. Gebruik de CEM hersteld van positieve kweken (bewaard bij -20 ° C) op de aangegeven tijdstippen op decollete reacties te bereiden met RFD-EC1, en vervolgens analyseren de reactie mengsels met behulp van dPAGE gel-elektroforese, zoals beschreven in hoofdstuk 8.

11. Concept en representatieve resultaten

Het begrip benutten een RNA-splitsende fluorescerende DNAzyme (RFD) voor bacteriële detectie is weergegeven in Fig. 1. De RFD splitst een chimère DNA / RNA-substraat op een eenzame RNA-koppeling (blauw R) geflankeerd door het label twee nucleotidenmet een fluorofoor (F) en een quencher (Q), respectievelijk. Als een bacterie van belang (bijvoorbeeld E. coli) groeit in media, zal achterlaten ruwe extracellulaire mengsel (CEM). Dit CEM geheel wordt in een in vitro proef selectie een RFD dat reageert het bijzonder de CEM verkrijgen, vermoedelijk de RFD elkaar met een specifiek molecuul (paars ster) in de CEM die een handtekening molecule van de bacterie. Wanneer de CEM wordt toegevoegd aan het reactiemengsel bevattende oplossing RFD activeert het RNA-splitsende werking van de RFD. De splitsing event scheidt F van Q, waardoor een fluorescent signaal dat kan worden gedetecteerd met een fluorimeter of door gelelektroforese.

De experimentele validatie van het bovenstaande concept werd gedaan met de CEM van E. coli (CEM-EG). We 3 RFD moleculen verkregen via in vitro selectie, en het meest efficiënt is aangewezen als RFD-EC1 (fig. 2A). ⁵ We getest de splitsing activiteit van RFD-EC1 (samen met een mutant volgorde genoemd RFSS1) als reactie op CEM-EG. Zowel RFD-EC1 en RFSS1 werden bereid door enzymatische ligatie van de DNAzyme delen op het substraat FS1 (alle sequenties zijn weergegeven in Fig. 2A). In de fluorescentiemeting experiment (Fig. 2B) werd CEM-EG alleen gedurende 5 min, gevolgd door de toevoeging van RFD-EC1 of RFSS1 en door verdere incubatie gedurende 55 min. De fluorescentie-intensiteit van de oplossing werd continu gelezen per minuut en de gegevens werden gebruikt om relatieve fluorescentie berekenen (RF, berekend als de verhouding van de fluorescentie intensiteit op tijdstip t tegen de fluorescentie-intensiteit op tijdstip 0). De RF waarden tegen de incubatietijd uitgezet als Fig. 2B. Het bleek dat RFD-EC1 een hoog fluorescentiesignaal na toevoeging van CEM-EG geproduceerd, in schril contrast RFSS1 niet tot een sterke fluorescentie signaal. Zo is het fluorescentie-producerende function van RFD-EC1 op contact op te nemen CEM-EC is sequentie-specifiek.

Om na te gaan dat de waargenomen fluorescentie verhogingen als gevolg van de splitsing van de RNA-koppeling, we reactiemengsels geanalyseerd door dPAGE. Splitsing van RFD-EC1 verwachting twee DNA-fragmenten, 5 'fragment behoud van de fluorofoor en een 3'fragment behoud van de quencher genereren. Alleen ongesplitste RFD-EC1 (unclv) en 5 'fragment (CLV) kunnen worden gedetecteerd door fluorescentie beeldvorming. Het resultaat dPAGE Fig. 2C toont dat het reactiemengsel van RFD-EC1 en CEM-EG wel het verwachte gekliefd product verkregen, terwijl de RFSS1/CEM-EC mengsel niet.

De specificiteit van RFD-EC1 werd onderzocht met behulp CEM verzameld verschillende andere gram negatieve en Gram-positieve bacteriën en de gegevens weergegeven in Fig. 3A. Alleen het monster met CEM-EG (blauwe curve) die een toename van de fluorescentie. Het gebrek aan cross-reactiviteit met CEMvan de andere bacteriën geeft aan dat RFD-EC1 is zeer selectief voor E. coli.

We hebben ook gekeken naar de tijd die nodig is voor het kweken van een enkele E. coli cellen om voldoende CEM dat de splitsing van RFD-EC1 kunnen induceren produceren. Voor dit experiment werd een E. coli monster met gedefinieerd CFU (kolonievormende eenheden) voldoende verdund tot een concentratie van 1 CFU / ml bereikt. Dit werd gevolgd door menging 100 ul van het verdunde monster bacteriële groei media gekweekt het 4, 8, 12, 16 en 24 uur. CEM's werden vervolgens verzameld voor elk meetpunt en getest voor het induceren van de splitsing activiteit van RFD-EC1. Het resultaat dPAGE Fig. 3B geeft aan dat een kweken tijd van 12 uur vereist.

Het is belangrijk op te merken dat de eerste kleine signaal stijging in fluorescentie metingen na de toevoeging van RFSS1 reeks (als een negatieve controle) om CEM-EG (Fig. 2B; rode curve) of RFD-EC1 andere bacteriële CEM (Fig. 3B alle curven behalve blauw) wordt toegeschreven aan de intrinsieke fluorescentie van de FRQ module (door onvolledige afkoeling van F door Q). Derhalve wordt verwacht dat de toevoeging van F-en Q-gelabelde sequenties zou een eerste fluorescentie verhoging produceren. Slechts RFD-EC1/CEM-EC mengsels zijn in staat om een ​​hoge fluorescentie tijd.

Figuur 1. Schematische weergave van het RNA-splitsende fluorescerende DNAzyme (RFD) sonde die fluoresceert bij contact met de ruwe extracellulaire mengsel (CEM), geproduceerd door specifieke bacteriële cellen van belang. De RFD splitst een chimeer DNA / RNA substraat een enkele binding RNA (blauw R) geflankeerd door twee nucleotiden gelabeld met een fluorofoor (F) en een quencher (Q), respectievelijk. Voor de splitsingsreactie de fluorescentie niveau van de RFD is minimaal door de nauwe proximity F en Q. bij klieving, Q afwijkt F, als gevolg een sterke fluorescentie signaal wordt geproduceerd.

Figuur 2. De E. coli-sensing RFD. (A) RFD-EC1 is de DNAzyme sonde die kan worden geactiveerd door CEM-EG. RFSS1 is een gecodeerde opeenvolging van RFD-EC1 gebruikt als controle. RFD-EC1 en RFSS1 geproduceerd door ligatie met FS1 EC1 en SS1 respectievelijk in aanwezigheid van LT1 als de template. F: fluoresceïne-gemodificeerde deoxythymidine. Q: Dabcyl-gemodificeerde deoxythymidine. R: adenine ribonucleotide. (B) Fluorescentie signaal profielen RFD-EC1 en RFSS1 in aanwezigheid van CEM-EC. (C) dPAGE analyse van de splitsingsreactie mengsels B (reactietijd 60 min). Afgebeeld is een fluorescentie beeld van de dPAGE gel verkregen met door Typhoon scanner. Lane NC: RFD-EC1 of RFSS1 in de reactie buffer alleen; Lane CEM-EC: RFD-EC1 of RFSS1 in de reactie buffer met CEM-EG. Marker: CE1 RFD-behandeld met 0,25 N NaOH, bekende procedure volledige splitsing van RNA te veroorzaken. unclv: ongesplitste RFD-EC1. CLV: de splitsing fragment met de fluorofoor.

Figuur 3. (A) Fluorescentie signalering profiel van RFD-EC1 in CEM bereid uit verschillende bacteriële cellen. EC: Escherichia coli-K12; PP: Pseudomonas PELI; BD: Brevundimonas diminuta; HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri; OG: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans; MO: Moraxella osloensis; AI: Acinetobacter lwoffi; SF: Serratia fonticola; BS: Bacillus subtilis, LM: Leuconostoc mesenteroides, LP: Lactobacillus planturum; PA: Pediococcus acidilactici; AO: Actinomyces orientalis. Elk CEM monster werd geïncubeerd gedurende 5 min gevolgd door de toevoeging van RFD-EC1. (B) dPAGEanalyse van RFD-EC1/CEM-EC mengsels na 60 minuten reactie. Lane NC1: RFD-EC1 in de reactie buffer alleen. Lane NC2: RFD-EC1 de reactiebuffer die CEM-BS (de CEM bereid uit Bacillus subtilis). De lanen gemerkt met 4, 8, 12, 16 en 24: RFD-EC1 de reactiebuffer die CEM-EG uit de bacteriecultuur met een E. coli cellen na een groeiperiode van 4, 8, 12, 16 en 24 uur, resp.

Het merendeel van de voorkomende bacteriële detectiemethoden vandaag de dag zijn of langzaam (klassieke microbiële) of technisch niet te veeleisend (antilichaam, PCR). Zo zijn wij van mening dat de volgende generatie van de detectie-instrumenten moet rekening houden met de richting van snelheid en eenvoud. Daartoe hebben we een RNA-splitsende en fluorescentie-signalering DNAzyme kan worden gebruikt om eenvoudige assays te ontwikkelen voor de aanwezigheid van bacteriën melden via het genereren van een fluorescent signaal. De functionaliteit DNAzyme sonde, RFD-EC1, wordt geactiveerd door de CEM geproduceerd tijdens de groei van E. coli in cultuur media. Sinds onze methode maakt gebruik van ruwe extracellulaire mengsels van een bacterie als het doel van opsporing en omzeilt de moeizame doel extractie en versterking stappen, het kan worden gebruikt voor het opzetten heel eenvoudig, "mix-and-lezen" type van testen voor bacteriële detectie. Het gebruik van de DNAzyme is niet beperkt tot fluorescentie gebaseerde detectiemethode. Bijvoorbeeld, colorimetrische detectie met behulp van dezelfde DNAzyme systeem test ceen ontworpen worden met een eerder gerapporteerde methode rollende cirkel amplificatie benut in combinatie met een organische kleurstof. ³² Wij voorzien het gebruik van DNAzymes voor bacteriële detectie als een aantrekkelijk middel is om nieuwe bacteriële biosensoren met meer bedieningsgemak genereren.

Geen belangenconflicten verklaard.

De financiering voor dit werk werd verstrekt door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de Sentinel Bioactieve Paper Network.

1. Zourob, M., Elwary, S., & Truner, A., (eds.). Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems., Springer, New York, (2008).
2. Call, D.R. Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays. Crit. Rev. Microbiol. 31 (2), 91-99 (2005).
3. Lazcka, O., Del Campo, F.J., & Muñoz, F.X. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1205-1217 (2007).
4. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-254 (2010).
5. Ali, M.M., et al. Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (16), 3751-3754 (2011).
6. Navani, N.K. & Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 272-281 (2006).
7. Liu, J., Cao, Z., & Lu, Y. Functional Nucleic Acid Sensors. Chem. Rev. 109 (5), 1948-1998 (2009).
8. Li, Y. & Lu, Y., (eds.). Functional Nucleic Acids for Analytical Applications. Springer, New York, (2009).
9. Tuerk, C. & Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
10. Ellington, A.D. & Szostak, J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
11. Joyce, G.F. Forty Years of In Vitro Evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (34), 6420-6436 (2007).
12. Breaker, R.R. & Joyce, G.F. A DNA enzyme that cleaves RNA. Chem. Biol. 1 (4), 223-229 (1994).
13. Cuenoud, B. & Szostak, J.W. A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity. Nature. 375 (6532), 611-614 (1995).
14. Chinnapen, D.J. & Sen, D. A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 65-69 (2004).
15. Schlosser, K. & Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16 (3), 311-322 (2009).
16. Silverman, S.K. DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (40), 7180-7201 (2010).
17. Mei, S.H., et al. An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling. J. Am. Chem. Soc. 125 (2), 412-420 (2003).
18. Liu, Z., et al. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences. J. Am. Chem. Soc. 125 (25), 7539-7545 (2003).
19. Kandadai, S.A. & Li, Y. Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7164-7175 (2005).
20. Rupcich, N., et al. Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes. J. Am. Chem. Soc. 128 (3), 780-790 (2005).
21. Shen, Y., Brennan, J.D., & Li, Y. Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme. Biochemistry. 44 (36), 12066-12076 (2005).
22. Chiuman, W. & Li, Y. Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores. J. Mol. Biol. 357 (3), 748-754 (2006).
23. Chiuman, W. & Li, Y. Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction. Chem. Biol. 13 (10), 1061-1069 (2006).
24. Shen, Y., et al. Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure. Chem BioChem. 7 (9), 1343-1348 (2006).
25. Ali, M.M., Kandadai, S.A., & Li, Y. Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3. Can. J. Chem. 85 (4), 261-273 (2007).
26. Chiuman, W. & Li, Y. Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. Nucleic Acids Res. 35 (2), 401-405 (2007).
27. Chiuman, W. & Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design. PLoS ONE. 2 (11), e1224 (2007).
28. Shen, Y., et al. Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing. Anal. Chem. 79 (9), 3494-3503 (2007).
29. Kandadai, S.A., et al. Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5. Biochemistry. 48 (31), 7383-7391 (2009).
30. Zhao, W., Brook, M.A., & Li, Y. Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification. Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).
31. Navani, N.K., Mok, W.K., & Li, Y. In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications. Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).
32. Ali, M.M. & Li, Y. Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (19), 3512-3515 (2009).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.