Isolering og dyrkning af Rotte Embryonale Neurale Celler: En hurtig protokol

1. Poly-D-Lysin (PDL): Fremstilling

1. Tilsæt 5 ml sterilt _ddH2O til 5 mg PDL til opnåelse af en stamopløsning af 1 mg / ml.
2. Bland stamopløsning ved pipettering flere gange.
3. Anvendes straks eller opbevar Poly-D-lysinopløsningen ved 2-8 ° C.

2. Poly-D-Lysin (PDL): Coating plast Cell dyrkningsskåle

1. Fortynd PDL stamopløsningen med sterilt _ddH2O til en slutkoncentration på 10 ug / ml.
2. Pipetten tilstrækkelig opløsning til en 60 mm skål til at dække kultur overfladeareal (3 ml af en 60 mm skål).
3. Rock forsigtigt for at sikre en ensartet belægning af kulturen overfladen.
4. Inkuber coatede plader ved stuetemperatur (RT) natten over.
5. På den næste dag, den dag dissektion normalt, skal du fjerne Poly-D-lysinopløsningen ved aspiration og vaskes hurtigt med 3 ml sterilt DdH ₂ O. Gentag dette trin. Efter den anden vask, fjerne vand fuldstændigt ved aspiration.
6. Pladerne kan opbevares ved 4 ° C i op til tre uger.

3. Poly-D-Lysin (PDL) og laminin: Fremstilling og belægning af glas med to kamre Slides

1. Blanding PDL (1 mg / ml) og laminin (1 mg / ml) stamopløsninger i sterilt _ddH2O til den endelige koncentration på 10 og 5 ug / ml.
2. Pipetten tilstrækkelig opløsning til brønde i en glas med to kamre glider til at dække kulturen overfladeareal (1 ml til hver brønd af en 2 godt glas to kammer objektglas).
3. Rock forsigtigt for at sikre en ensartet belægning af kulturen overfladen.
4. Inkuber coatede plader ved stuetemperatur natten over.
5. På den næste dag, skal du fjerne Poly-D-lysin-Laminin coatingopløsning via aspiration og vaskes hurtigt to gange med 1 ml sterilt DdH ₂ O. Efter den anden vask, fjerne vand fuldstændigt ved aspiration.
6. Kammer objektglas kan opbevares ved 4 ° C i op til tre uger.

Bemærk: Enhver glaskammer slide kan belægges following. denne protokol. Vi bruger ofte de to-kammer dias, fordi hver slide giver kontrol-test eksperimentel indstilling (f.eks ubehandlet versus behandlet, utransficerede versus transfekteres).

4. Neuronal Dissektion og Kultur

1. Opvarme de følgende reagenser i et 37 ° C vandbad:
   • TrypLE Express på sin oprindelige 100 ml flaske.
   • Neurobasal/B27 komplet medium (se tabel I). Den opvarmede volumen afhænger af antallet af retter til at være belagt (f.eks 30 ml for ti 60 mm guldbelagte retter).
2. Tilsæt 3 ml kold Hibernate E opløsning til fire 60 mm dyrkningsskåle og 13 ml til en 15 ml BD Falcon høj klarhed polypropylen konisk rør.
3. Tilsættes 25-30 ml kold dissektionsmedium (se tabel II, Dr. Olimpia Meucci, personlig kommunikation) til hver af tre 100 mm dyrkningsskåle. Disse plader, der indeholder en stor mængde af medium, vil blive anvendt til at vaske embryoner umiddelbart efterfjernelse fra fostervand habitatområderne (trin 4.7 og 4.8).
4. Afliv en E17 timet gravide rotter ved CO ₂ i overensstemmelse med Public Health Services Policy på human måde og brugen af forsøgsdyr og under en institutionelt godkendt pasning af dyr og bruge protokol.
5. Sprøjt maven med 70% EtOH og skære medialt gennem hud og muskler med en saks udsætte livmoderen og embryoner.
6. Fjern alle fostre og placere dem i en steril 100-mm-skål, som indeholder et overskud af kold dissektionsmedium (25-30 ml, se trin 4.3).
7. Skær embryoner ved hjælp af en lille saks fra fosterhinden og placere dem i den anden 100-mm-skål med koldt dissektionsmedium.
8. Vask embryoer ved stuetemperatur ved forsigtigt at vippe 100 mm skål i 5-10 sekunder. Derefter overfører den skyllede embryoner til den tredje 100 mm skaal indeholdende dissekere medium. To vaske i overskydende medium er sædvanligvis tilstrækkelige til at fjerne alle spor af blod. Hvis andetstedsvendigt, vaskes en gang med en ny 100 mm skål indeholdende 25-30 ml kold dissektionsmedium.
9. Anvendelse af et stereomikroskop og buet pincet, hver rotte foster hjerne ekstrakt ved at trække huden og kraniet. Anbring hele hjernen i et af de 60 mm skåle (typisk med ikke mere end 5 hjerner pr skål) med koldt Hibernate E. holde disse plader på is.
10. Tag én skål på et tidspunkt og under et dissektionsmikroskop, hemisfærerne adskille og isolere hjernebark fjerne midterhjernen og meninges.
11. Valgfrit: afskårne hoveder langs midterlinjen, udtrække hippocampi, og følg nedenstående procedure for at isolere hippocampusneuroner.
12. Samle alle de dissekerede cortex i et 15 ml klart konisk rør indeholdende 13 ml kold Hibernate E. Lad hjernebark på is, indtil alle dissektioner er afsluttet. På grund af deres lille størrelse kan dissekeres hippocampi opsamles i en 1,5 ml Eppendorf-rør i stedet for en 15-ml rør. Hvis det ønskes, på dette trin cortices ellerhippocampi kan placeres i en cryotube hætteglas indeholdende 1 ml Hibernate E + 2% B27 + gentamicin (50 ug / ml) + Fungizone (250 ng / ml) i forholdet 2-4 cortex eller 2-4 hippocampi hvert hætteglas. Hjernevæv kan opbevares ved 4 ° C i mørke i op til en uge (senere tid har ikke testet endnu). Efter behov kan fine tænger til at overføre hjernevæv til et 15 ml rør indeholdende Hibernate E og derefter følge protokollen nedenfor for at isolere neuroner.
13. Overførsel af røret til en vævskultur hætte. Tillade cortex til sedimentere til bunden af ​​røret og derefter forsigtigt fjern supernatanten.
14. Tilsættes 13 ml frisk Hibernate E til 15 ml konisk rør, kan cortex sig på bunden af ​​røret og fjern supernatanten. Gentag dette trin 2 gange, og efter den sidste vask, fjern omhyggeligt alle medier.
15. Enzymatisk fordøje hjernebark ved at tilsætte 1-2 ml (afhængigt af antallet af cortex, bruger mindre for hippocampi isolation) af varme TrypLE Express. Forsegle hætten af ​​røret med parafilm og flyder i røret i et 37 ° C vandbad i 10 minutter.
16. Sprøjt røret med 70% ethanol, før du åbner låget og tilsæt 10 ml Hibernate E. Lad cortex at afvikle i bunden af ​​røret og fjern supernatanten. Gentag dette trin tre gange for at vaske ud TrypLE Express. I sidste trin, skal du omhyggeligt fjerne alle medier.
17. Forsigtigt tritureres (4-5 gange) af cortex i 2 ml Neurobasal/B27 komplet medium ved anvendelse af en flammepoleret Pasteur glas (ca. 1 mm i diameter). Vær omhyggelig med at undgå bobler.
18. Gentag 4-5 gange med en steril glas pasteurpipette mindre diameter (dvs. en pipette ca 1/2-3/4 mm i diameter). Brug ikke en Pasteur-pipette mindre end dette, eller det vil ødelægge cellerne.
19. Tillad resterende stykker af væv (generelt meget få, om nogen), at bosætte sig.
20. Overfører den øverste enkelt cellesuspension til en ny 15-ml rør, efterladende afregnet stykker væv. Furligere fortyndes cellesuspensionen op til 10-12 ml med Neurobasal/B27 komplet medium.
21. Bland godt og fortyndes cellerne til tælling ved tilsætning af 10 pi af cellesuspensionen til 490 pi 50x Counting opløsning (se tabel III) i et 1,5 ml Eppendorf-rør.
22. Plade celler på PDL-overtrukne plader ved densitet på 5,0 x 10 ⁴ / cm ^2. Hvis nucleofection skal udføres, anbefales udpladning af cellerne ved en højere koncentration (8-10 x 10 ⁴ / cm ^2).
23. Normalt vi dissekere 9-10 fostre pr eksperiment, som cirka 13 x 10 ⁶ neuroner er afledt fra hver E17 foster. Hvis flere fostre der er behov for, sørge for, at hele proceduren ikke vare mere end to timer.
24. Hvis det ønskes, 24 timer efter isolering, kan 10 uM cytosin-β-D-arabinofuranosid (AraC) tilsættes til hver skål, for at forhindre glial proliferation. Dog er dette trin ikke nødvendigt, da Neurobasal/B27 mediet hæmmer glial proliferation, Ifølge producentens anbefalinger (Invitrogen / Gibco).
25. Neuroner kan anvendes til eksperimenter efter 4-5 dage in vitro, selv om det nøjagtige tidspunkt, afhænger af den ønskede differentiering fase. Vi dyrkede neuroner i op til 4 uger uden en betydelig nedgang i overlevelse (fig. 1).
26. For forlænget dyrkning erstatte dyrkningsmediet hver uge med frisk fremstillet Neurobasal/B27 komplet medium.

5. Repræsentative resultater

Neuroner dyrket på glaskammer objektglas kan udsættes for immunocytokemi. Figur 1 viser et typisk billede af en cortical neuron fastgjort efter fem dage i kultur og immunolabeled med anti-MAP-2-antistof til at vise neuronale processer.

Figur 2 viser et repræsentativt billede af en rotte hippocampale neuroner efter 3 uger i kultur. Den neuronal morfologi i en fuldt differentieret celle er fremhævet med MAP-2 immunolabeling (MAP-2 neuronal markør, muse monoklonalt antistof klon AP-20, Gene Tex, Irvine, CA) efter en standard procedure som tidligere beskrevet ^en. De billeder blev visualiseret med Nikon Eclipse E400 oprejst fluorescensmikroskop udstyret med EXI aqua kamera (Qimaging), motoriseret Z-aksen, og SlideBook5 køb / dekonvolvering software (Intelligent Imaging Innovations, Inc., Denver, CO). En serie af tre-dimensionale billeder af hver enkelt billede blev deconvoluted et todimensionalt billede og løst ved at justere signal cut-off på næsten maksimal intensitet for at øge opløsningen.

Figur 3 viser renheden af neuronale kulturer. Proteinlysater blev opnået fra DIV7 rotte neuronale kulturer (CTX) og fra et tilfælde af humant glioblastom (GBM). Som forventet neuronale lysatet er stærkt positive for den neuronale protein MAP-2 og negativ for astrocytisk markør GFAP, medens GBM proteinet lysat er negativ feller MAP-2 og positiv for GFAP.

Selv i vores protokol, som vi har brugt Hibernate E i flere år som dissekere og skylning medium, vi for nylig har udforsket en ekstra og meget praktisk brug af det at bevare hjernens væv til videre brug. Figur 4 illustrerer nogle dage i vitro 5 (DIV5) dyrkning af rotte corticale neuroner isoleret fra cortices holdes ved 4 ° C i en uge i dvale E + B27 efter deres oprindelige dissektion af embryoer. Neuroner blev udpladet på et glas med to kamre objektglas overtrukket med PDL og laminin som tidligere beskrevet. Den opnåede billeddata blev deconvoluted anvendelse SlideBook5 akkvisitions / dekonvolution software som beskrevet ovenfor (figur 2).

Figur 1. Repræsentativt billede af en cortical neuron nucleofected med pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) og immunolabeled med MAP-2 Antistof, med rødt. Oprindelig forstørrelse 100x.

Figur 2. Repræsentativt billede, der viser MAP-2 immunolabeling i rødt af hippocampale neuroner efter 3 uger i kultur. DAPI-farvning, i blåt viser cellulær kerner. Oprindelig forstørrelse 40x.

Figur 3. Western blot, der viser renheden af neuronale cellekulturer. 30 ug af rotte neuronale og human GBM proteinlysater blev separeret ved elektroforese og underkastet Western blot-analyse efter standardprocedurer ^1. Anti-MAP-2 var et kanin polyklonalt fra Cell Signaling (Danvers, MA), anti-GFAP-antistoffet var et monoklonalt muse fra Chemicon (Millipore, Billerica, MA), og muse-monoklonalt anti-Grb2-antistof var fra BD Transduction Laboratories ( Sparks, MD). Grb2 blev anvendt som en belastning kontrol.
Figur 4. Repræsentative billeder af dage in vitro 5 (DIV5) rotte corticale neuroner opnået fra cortices efterladt i dvale E + B27 ved 4 ° C i en uge efter dissektion. A) fasekontrast af neuroner dyrket på et glas med to kamre objektglas. Oprindelig forstørrelse 20X. B) Immunofluorescens viste ekspression af MAP-2 i neuronale processer, i grønt, kulturen var negativ for astrocytisk markør GFAP. DAPI-farvning, i blå angiver cellulære kerner. Oprindelig forstørrelse 40x.

Fremgangsmåden dissektion og kultur af rotte hippocampale og corticale neuroner beskrevet her tillader udførelse af eksperimenter med næsten rene neuronale kulturer dyrket i et kemisk defineret medium (figur 3). Selv protokoller for dyrkning af næsten rene neuroner i serum-frie medier er tidligere blevet beskrevet ^2,3,4, der er vigtige ændringer i vores metode. Forskellig fra traditionelle protokoller (dvs. Banker et al.) ^5, har vi erstattet trypsin med TrypLE Express, en mere blid dissociation enzym. Vi har også udeladt to trin, som potentielt påvirker integriteten af ​​neuronale celler: hakning af cortex eller hippocampusen før enzymatisk fordøjelse og med DNase. Også dissektion af embryoner i dvale E (trin 4.2) bidraget til at bevare levedygtige og sunde celler. Dvale E er et næringsmedium anvendes til opretholdelse af neurale celler eller væv i omgivende kuldioxid (Invitrogen, Life Technologies, Grand Islog, NY). Oprindeligt formuleret til afsendelse isolerede områder af hjernen (hippocampus, striatum og cortex), kan Hibernate E medium, der anvendes til at holde hjernen levedygtige under isolering af neurale væv eller for at holde neuroner raske under mikroskopi, elektrofysiologi eller flowcytometri. Faktisk Figur 4 viser et repræsentativt billede af rotte corticale neuroner dyrket i 5 dage på glas to kammer objektglas. Forud for behandling blev cortex holdt ved 4 ° C i dvale E + B27 i mørke i en uge efter dissektion fra E17 embryoer. Interessant neuroner isoleret fra væv opbevaret ved 4 ° C i nogle få dage var morfologisk sammenlignelige med dem, der blev isoleret på samme dag som embryo dissektion. Under muligheden for at isolere neuroner på forskellige tidspunkter efter dissektion af embryoer kan være ekstremt nyttigt, når de planlægger eksperimenter, og derfor i at gøre en fuld udnyttelse af den tid-gravide dyr.

Det skal mentioned, at vores protokol fungerer effektivt på embryoner fra E13 til E17, men det er aldrig blevet testet for nyfødte eller voksne gnavere. Det er også fungerede godt til isolering og dyrkning af humane føtale neuroner (upublicerede data).

Celler isoleret med den her beskrevne fremgangsmåde kan udplades i vævskulturskåle til eksperimenter, der kræver høstning et stort antal celler for RNA / DNA eller protein ekstraktion. Eksempler indbefatter behandling af neuroner med nogle forbindelser eller peptider, såsom i vores arbejde på HIV-Tat protein ^1. Vækstfaktor-medierede signaleringsveje kan også undersøges eller RNA kan oprenses for genekspression eller miRNA profilering arrays ^6.

Desuden nucleofection af neuroner inden udpladning tilvejebringer et værktøj til at undersøge molekyler eller vækstbetingelser, der påvirker neuronal differentiering ^1. Andre anvendelsesområder omfatter transfektion af differentierede neuroner ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ^1. Medens effektiviteten af ​​transfektion er ganske lav i forhold til nucleofection, er egnet til meget følsomme assays såsom luciferase reporter assay eller Elektrofysiologiske undersøgelser. Desuden kan neuroner dyrket på glas kammeret objektglas underkastes immuncytokemi (fig. 1 og 4B) ^1. Endelig, vi med succes fulgt denne protokol for at dissociere neurale stamceller fra mus embryoner ^7, med en ændring i det sidste trin, hvor isolerede neurale stamceller dyrkes i et defineret medium som tidligere beskrevet ^7,8. Samlet set enkel fremgangsmåde har en række anvendelser og let tilvejebringer neuroner undersøgelser, der ikke kræver glia at understøtte neuronale kulturer. Imidlertid kan glia co-kultur eller glial-afledte konditionerede medium tilsættes til disse neuronale kulturer for at undersøge mekanismerne synapsedannelse induceret af gliaceller ^9, såsom undersøgelser beskrevet af Pfrieger og BaRres ^10.