ميكروفلويديك الخلاطات لدراسة طي البروتين

Waldauer, S. A., Wu, L., Yao, S., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding. J. Vis. Exp. (62), e3976, doi:10.3791/3976 (2012).

العملية التي يتم من خلالها طيات البروتين في التشكل الأصلي هو ذات أهمية كبيرة لعلم الأحياء والصحة البشرية حتى الآن لا تزال غير مفهومة تماما. وأحد أسباب ذلك هو أن للطي يتم خلال مجموعة واسعة من الجداول الزمنية، من النانو ثانية إلى ثانية أو أكثر، اعتمادا على بروتين ^1. وقد سمح التقليدية توقف تدفق خلاطات قياس حركية قابلة للطي ابتداء من الساعة حوالي 1 مللي. وقد وضعنا مؤخرا خالط ميكروفلويديك أن يخفف ممسخ ~ 100 أضعاف في ميكروثانية 8 ~ ^2. وخلافا للخلاط توقفت عن التدفق، وهذا خلاط يعمل في نظام تدفق الصفحي في الاضطرابات التي لا تحدث. لعدم وجود اضطراب يسمح محاكاة رقمية دقيقة لجميع التدفقات داخل خلاط مع اتفاق ممتاز لهذه التجربة ^3-4.

ويتم تحقيق تدفق رقائقي للأرقام رينولدز إعادة ≤ 100. لالمحاليل المائية، وهذا يتطلب هندستها نطاق ميكرون. نستخدم الركيزة الصلبة، مثل السيليكون أو سيلييه تنصهركاليفورنيا، إلى جعل قنوات 5-10 ميكرون واسعة وعميقة 10 ميكرومتر (انظر الشكل 1). أصغر الأبعاد، عند مدخل المنطقة الاختلاط، وبناء على امر من 1 ميكرومتر في الحجم. وختم رقاقة مع كوب رقيق أو تنصهر السيليكا ساترة للوصول البصرية. نموذجي مجموع معدلات تدفق الخطية هي ~ 1 م / ث، وإعادة الرضوخ ~ 10، ولكن استهلاك البروتين هو فقط ~ 0.5 NL / ثانية أو 1.8 ميكروليتر / ساعة. تركيز بروتين يعتمد على طريقة الكشف: للحصول على مضان التربتوفان تركيز نموذجي هو 100 ميكرون (للفترة من 1 بروتين / الحزب) والحنق تركيز نموذجي هو ~ 100 نانومتر.

وبدأت عملية قابلة للطي من قبل التخفيف السريع للممسخ في الفترة من 6 إلى 0،06 م هيدروكلوريد الجوانيدين M. البروتين في ممسخ ارتفاع تدفقات أسفل القناة المركزية ويتحقق في أي من الجانبين في المنطقة العازلة دون خلط بواسطة ممسخ تتحرك ~ 100 مرات أسرع (انظر الشكل 2). هذه الهندسة يسبب انقباض السريع لتدفق بروتين في ضيقطائرة ~ 100 نانومتر واسعة. انتشار الجزيئات ممسخ ضوء سريع جدا، في حين نشر جزيئات البروتين الثقيلة أبطأ بكثير، نشرها أقل من 1 ميكرومتر في 1 مللي ثانية. الفرق في نشر المستمر للممسخ ونتائج البروتين في تخفيف سريع للممسخ من تيار البروتين، والحد من تركيز الفعال للممسخ حول بروتين. الطائرة بروتين يتدفق بمعدل ثابت باستمرار على قناة المراقبة ومضان من البروتين خلال للطي يمكن ملاحظتها باستخدام مجهر المسح مبائر ^5.

1. تصنيع رقائق خلط ميكروفلويديك

ويبين الشكل 3 خطوات التصنيع الأساسية.

1. تنظيف 4 بوصة (100 ملم) رقائق السيليكا تنصهر مع حل سمكة البيرانا الطازجة (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O _2): أ) الحرارة وحامض الكبريتيك إلى 130 درجة مئوية ثم صب في بيروكسيد. نلاحظ أن خشونة السطح، والتسطيح للرقائق السيليكا تنصهر المستخدمة تلعب دورا هاما للخطوة الربط النهائي. ثانيا) تزج رقائق لا يقل عن 30 دقيقة. ج) لمدة 5 دقائق يشطف بالماء والجافة. تطبيق البولي سيليكون (بولي) طلاء، ~ 1 ميكرون سميكة في عمق كل يقصد ميكرون 10 من القنوات ميكروفلويديك النهائي، وذلك باستخدام مادة كيميائية ضغط منخفض بخار ترسب (LPCVD) فرن.
2. تنظيف رقائق وقناع باستخدام بروتوكول سمكة البيرانا في الخطوة 1.1. تنظيف قناع بنفس الطريقة، ثم شطف مع الميثانول، والأسيتون والأيزوبروبانول وضربة الجافة على الفور. يذوى رقائق على طبق ساخن في 150 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ~ (استخدام خيمة رقائق الألومنيوم للحفاظ على الجسيمات بعيدا) أو في فرن 120 درجة مئوية لمدة لا تقل 120 دقيقة (يفضل أن يكون ذلك بين عشية وضحاها). لزيادة التصاق مقاومة للضوء، فضح فورا رقائق الحارة لبخار HMDS لمدة 5 دقائق. معطف تدور رقائق مع نانومتر ~ 900 طبقة سميكة من AZ5214 مقاومة للضوء وتخبز لينة عند 90 درجة مئوية مباشرة على موقد لمدة 1 دقيقة أو في فرن على 110 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الشكل 3، الخطوة 1).
3. محاذاة قناع وجعل الاتصال الثابت وفراغ. تعرض للأشعة فوق البنفسجية لعدة ثوان (مجموع الطاقة: ~ 103 ميغا جول / سم ²⁾ (الشكل 3، الخطوة 2). تطوير AZ400K مع المطور، مخففة بالماء 04:01 DI ل50 ثانية ~ (حتى يتم تطويره بالكامل مقاومة للضوء)، في حين اثارة بلطف. التشطيف مع الماء لمدة 2 دقيقة. تفقد الميزات مع مجهر (الشكل 3، الخطوة 3). إذا يتم حل سوء الميزات، تجريد مقاومة للضوء والبدء من جديد من 1.2. من الصعب خبز 115 درجة مئوية مباشرة على موقد لمدة 2دقيقة.
4. رقائق Descum مع آشر أو O ₂ البلازما لمدة 2.5 دقيقة في 100 قوة الترددات اللاسلكية دبليو. باستخدام عميق على رد الفعل ايون مطبوع (DRIE)، حفر طبقة البولي سيليكون على طول الطريق من خلال لالسيليكا تنصهر أدناه. تجريد مقاومة للضوء المتبقية مع PRS2000 مقاومة متجرد في 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. شطف وتجفيف. قياس عمق حفر للتأكد من كل وسيلة من خلال طلاء بولي (الشكل 3، الخطوة 4).
5. باستخدام DRIE أكسيد قادر على مثل مطبوع الرابطة الوطنية للديمقراطية-6000 ULVAC، السيليكا تنصهر فيها حفر على عمق 10 ~ ميكرون في سمك ميكرون للطلاء بولي (الشكل 3، الخطوة 5). وسوف ترتديه هذه طلاء بولي بعيدا أثناء الحفر، وبالتالي قد يكون من الضروري للاطمئنان على سلامة طلاء دوريا أثناء عملية الحفر. إذا المناطق ملامح عمدا من سطح رقاقة أصبحت تجردت من طلاء بولي واقية أثناء الحفر، والسطح وعلى الأرجح أن تصبح حرض ولن تكون مناسبة للارتباطفي الخطوات النهائية للإنتاج. في هذه الحالة رقاقة على الأرجح لم تعد قابلة للحياة. تنظيف مع آشر مصفوفة لمدة 4 دقائق، و 100 قوة الترددات اللاسلكية دبليو. تجريد البولي سيليكون مع مطبوع ₂ XeF (الشكل 3، الخطوة 6). قد يكون من الضروري تكرار الخطوة 1.4 وهذه الخطوة عدة مرات لإزالة كافة الطلاء مقاومة للضوء وبولي.
6. تدور رقائق مع معطف جديد ~ طبقة ميكرون 1 من مقاومة للضوء لحماية القنوات خلال معالجة لاحقة. حفر ثقوب الدخول والخروج في كل رقاقة تستخدم جهاز كمبيوتر تسيطر الماس ذات الرؤوس الحفر أو يدويا مع المنظف (الشكل 3، الخطوة 7). إذا باستخدام الحفر، تركيب رقاقة (ميزة جانبية لأسفل) على طبق من زجاج الأضاحي باستخدام أكوا بوند 55، مع الحرص على الحفاظ على بوندر خال من الفقاعات. تبريد التدريبات مع محلول التنظيف الدقيقة 90. هذا يبقي قطع صغيرة من الزجاج من الالتصاق على القنوات التي تسد ثم رقاقة أثناء الاستخدام.
7. شطف الرقاقة بالماء DI باستخدام حقنة لحقن ثالعاطر في كل حفرة. نقع في الماء والصابون لمدة ساعة. إزالة مقاومة للضوء وبوند أكوا مع عام 2000 استراتيجية الحد من الفقر في 60 درجة مئوية لعدة ساعات حتى سطح نظيف. رقاقة شطف بالماء DI والماء الدافئ والصابون. شطف كل ثقب مرة أخرى مع حقنة، وتجنب ملامح محفورا. رقاقة جافة مع النيتروجين وفي فرن فراغ تعيين إلى 120 درجة مئوية. فحص الثقوب لضمان خلوها من حصى وتكرار تنظيف الخطوات حسب الضرورة. قياس عمق قنوات مع إما التعريف سطح البصرية أو الميكانيكي (الشكل 3، الخطوة 8).
8. نظيفة رقائق وعدد مساو من 170 ميكرون سميكة غطاء السيليكا تنصهر مع نظارات 1) سمكة البيرانا حل (1-2 ساعات وفقا للإجراء في 1.1)، 2) RCA 2 (05:01:01 DI: حمض الهيدروكلوريك: H ₂ 0 ₂ ) حل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة 75 مئوية، 3) 1 RCA حل (05:01:01 DI: NH ₄ OH: H ₂ 0 ₂₎ لمدة 22 دقائق في 75C). التشطيف مع الماء DI لمدة 5 دقائق بين كل حل.
9. ملامح مكان رقاقة جانب واحد حتى على أعلىكومة من مناديل غرف الأبحاث 3-4 وضعت على رأس السطح شقة الثابت، مثل جزء صغير من الزجاج. تجفيف رقاقة تماما مع غاز النيتروجين لمدة لا تقل مدة 5 دقائق. كرر مع غطاء زجاجي. تلتقط غطاء زجاجي على حافة وعكس هذا أن أسفل الوجه الذي عقد في الجانب المصقول على رقاقة ومحاذاة الحواف المسطحة. إسقاط بعناية غطاء زجاجي على الرقاقة والسماح لها لتسوية. دفع فقط أفقيا لضبط المحاذاة. دفع إلى أسفل مع إصبع واحد في وسط رقاقة. وينبغي للمرء أن يرى جبهة الترابط تبدأ تشع إلى الخارج. إذا لزم الأمر، وتطبيق ضغط إضافي إلى وظائف أخرى في جميع أنحاء رقاقة لتعزيز الروابط الأمامية (الشكل 3، الخطوة 9).
10. وضع رقائق مختوم في فرن درجة حرارة عالية لرفع مجموعة من درجة حرارة الغرفة إلى 800 درجة مئوية أكثر من 3 ساعات، ثم 800-1100 درجة مئوية خلال ساعة أخرى 1.2. عقد في 1100 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، ثم الطريق المنحدر إلى أسفل إلى درجة حرارة الغرفة أكثر من ساعة أخرى 1.5.
11. شهد الزهر مع التكعيب رقاقة إلى أناndividual رقائق (الشكل 3، الخطوة 10).
12. بروتوكول يصف تلفيق من القنوات في الركيزة السيليكا تنصهر فيها غير عادي الى حد ما وهو أمر ضروري للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية. ولكن يمكن أيضا هذا البروتوكول يمكن تكييفها لالركيزة السيليكون الذي يتطلب خطوة فقط النقش واحد ^2. ويمكن المستعبدين كوب (ولكن ليس السيليكا تنصهر) غطاء زجاجي على الرقاقة باستخدام الربط انوديك.

2. تصاعد وتحميل رقائق

1. يمكن جعل متعددة لعقد رقاقة خلط والحلول من البلاستيك، مثل يكسان أو زجاجي، أو الألومنيوم عن التحكم في درجة الحرارة (انظر الشكل 4). إذا باستخدام الألومنيوم، ينبغي المغلفة الخزانات حل مع parylene للحيلولة دون تفكك الألومنيوم من قبل حلول الملح في الخزانات. يمكن التحكم في درجة حرارة متعددة كامل والحلول ورقاقة مع الأجهزة الحرارية التي شنت على الجانبين، وعلى وحدة تحكم إلكتروني.
2. تزاوج شريحة لمانيأضعاف بحلول صغير طوقية والذي عقد في مكان مع الاحتفاظ حلقة التي تسمح برؤية واضحة البصري للمركز للرقاقة. الأخاديد يا الدائري يجب أن يكون أقل عمقا من مستوى جيد لضمان التزاوج دون تطبيق الكثير من الضغط على رقاقة، وينبغي أن أي، 002 يا الدائري يكون 0،025 "عميق، وعندما يتم تركيب الشريحة، إضافة إلى حلول للمستودعات ومركز الجانب ، مع الحرص على الإفراج عن أي فقاعات محاصرين في قاع الآبار.
3. وذلك لأن وحدات التخزين المستخدمة في هذا الخلاط صغيرة جدا، يمكن التحكم في تدفق مع الضغط الجوي تطبق فوق آبار حل. ويبين الشكل 4 مشعب الضغط تزاوج إلى أعلى متعددة رقاقة بواسطة طوقية. يتم توصيل متعددة الضغط على محولات ضغط الكمبيوتر التي تسيطر عليها التي يمكن أن الحفاظ على الضغوط من PSI 2-80 ~. وقد تم تصميم هذه الرقاقة أن الضغوط على قدم المساواة على القنوات الوسط والجانب تنتج ~ 100 أضعاف النسبة في معدلات تدفق الخطية. في 20 PSI، فإن معدل تدفق الخطي في القناة هو خروج ~ 1 م/ ق.
4. وضع متعددة على مجهر مقلوب ودراسة خلط المنطقة مع العدسة أو إخراج الكاميرا. والمصباح الكهربائي وهاج وضعت على رأس مشعب توفير ما يكفي من الضوء. استخدام مؤشر أو صبغ عالية من حل الانكسار (أي 6 هيدروكلوريد الجوانيدين م) في قناة مركز لعرض من الطائرة.
5. في الضغط على قدم المساواة على القنوات الوسط والجانب، وسوف تكون الطائرة من الصعب أن نرى بالعين بحيث تبدأ مع الجانب الضغط على قناة 0 المبادرة وزيادة ببطء إلى الضغط على قدم المساواة. إذا تم انسداد قناة واحدة جانب، سيتم دفع نفاثة ضد أحد الجدران من قناة خروج. إذا كانت تسد مرئي يظهر، قد يتم طردهم من قبل تطبيق ضغط أو فراغ للقناة الخروج مع حقنة.
6. إذا البروتين أو المواد العضوية الأخرى يسد الرقاقة، ويمكن تنظيفها عن طريق نقع في حل Pirhana بين عشية وضحاها.

3. جمع البيانات

يوضح الشكل 5 الأساسية تصميم أداة بصرية.

1. جلب شعاع ليزر ذي مسارات متوازية إلى مجهر البحث في الصف باستخدام مرآة مزدوج اللون سواء داخل أو خارج المجهر. محاذاة الليزر بحيث يمكن أن ينظر إلى التركيز في العدسة أو الكاميرا نوعا ما بالقرب من منطقة الخلط.
2. ويتم جمع مضان من البروتين في خلاط من قبل الهدف وإرسالها عبر المرآة مزدوج اللون، وركزت من خلال عدسة لثقب الدبوس وتصوير في عداد الفوتون. مسح الرقاقة باستخدام ماسح ضوئي كهرضغطية في x و y إلى صورة المنطقة خلط (نموذجي حجم الخطوة هو 2 ميكرون). اختيار موقف من الطائرات النفاثة والمسح الضوئي في X و Z للعثور على التركيز في وسط قناة عموديا. عمق ميدان المجهر هو أقل بكثير من عمق القناة ومعدل التدفق غير موحدة في القناة إلا في حدود 1 ميكرون من الجدران. ولذلك يتم تحديد القرار الزمني للمضان الملحوظة في المقام الأول عن طريق حجم بقعة مبائر.
3. تفحص أفقيا داخل القناة خروج (نموذجي الخطوة قإيزي هو 0.2 ميكرون في جميع أنحاء الطائرة، 2 ميكرومتر على طول الطائرة) في 100 ميكرون الزيادات على طول الطائرة، لمراقبة موقف ~ مللي 1 في (انظر الشكل 6). تحرك في المرحلة المجهر من قبل 80-90 ميكرون على طول الطائرة للقبض على أوقات لاحقة.
4. بدلا من ذلك، يمكن الكشف عن الضوء بواسطة جهاز لاتفاقية مكافحة التصحر بعد المرآة مزدوج اللون باستخدام عدسة لتركيز الضوء على فتحة المدخل. منذ جمع البيانات أبطأ من أجل مكافحة الفوتون (1 ثانية لكل موقف)، يتم تصويرها عادة الطائرة الأولى مع العداد الفوتون ومن ثم يتم قياس نقاط على طول الطائرة مع مقياس الطيف (انظر الشكل 7).
5. ويتم تحليل البيانات من عداد الفوتون عن طريق جمع 3-5 بكسل حول الطائرة في كل موقف لخلق مؤامرة من شدة مقابل المسافة. ويحسب الوقت من مسافة باستخدام سرعة حسابها استنادا إلى الضغوط (انظر الشكل 8).
6. ويمكن تحليل بيانات من مقياس الطيف زوجين من الطرق. لالحنق، channeيمكن لكل ليرة سورية وصفت بأنها "الجهات المانحة" و "متقبل" وتتلخص ونسبة القرب E = أنا _A / (I _D + I _D) المحسوبة. (انظر الشكل 9) بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ واحدة تجزئ القيمة للنظر في مكونات الطيفي مستقل في مقابل الزمن، مثل التحول الذي طرأ على طيف الانبعاث التربتوفان كما طيات البروتين.
7. ويمكن تحويل المسافة داخل القناة الخروج إلى وقت باستخدام معدل تدفق ثابت العزم من الضغوط التي مورست على قنوات جانبية. داخل ميكرومتر 2 الأول للقناة الخروج، ومعدل تدفق للطائرة البروتين يسرع 100X ~ ويجب أن تحسب العصر في تلك المنطقة مع تحليل العناصر المحددة ليبسط (إنتاج مرات المرسومة في الشكل 8). هذا التسارع ينتج إزاحة ميكرو ثانية 1-2 ~ بعد أن تصبح سرعة ثابتة وعادة ما يمكن تجاهلها في قياس حركية أبطأ بكثير من الخلط.

4. ممثل النتائج

ويبين الشكل 6 مؤامرة كفاف من كثافة في المنطقة خلط تقاس عداد الفوتون. وينبغي أن الخلفية في القناة خارج الخروج من الطائرة أن تكون قريبة من الكلمة ضجيج كاشف ويتم طرح عادة لا. ويجوز للخلفية ارتفاع تشير محاذاة الفقراء أو أن البروتين ما زال مصرا على الجدران للقناة. وكانت طائرة التي تبدو متلوى أو ملتوية، وخاصة بالقرب من منطقة الخلط، ويشير إلى وجود حفر الفقراء من الفتحات.

ويبين الشكل 7 مرة تحل الأطياف من البروتين بروتين A-ملزم أسيل-أنزيم (ACBP) المسمى مع اليكسا 488 و 647 اليكسا. وقد تم طرح هذه البيانات الخلفية لإزالة التهمة مظلمة وإشارة ليزر. لقد التقطت إشارة الخلفية مع مركز الضغط قناة تعيين إلى 0 PSI.

يمكن قياس زمن الخلط عن طريق قياس رد الفعل السريع هذا هو أسرع بكثير من خلط مثل التبريد التربتوفان ب مضانذ KI أو انهيار الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد، وصفت مع الحنق والأصباغ، عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم. لأن طائرة أصغر من قرار بصري من المجهر، وهناك انخفاض كثافة كبيرة في المنطقة كما خلط الأشكال النفاثة. ويمكن إزالة هذا الرد عن طريق أداة قياس التحكم في الظروف التي لا تغير حل. ويبين الشكل 8 نسبة خلط (إلى 400 ملم KI)، وعدم الخلط بين تجارب N-أسيتيل التربتوفان مضان أميد. خط يبين تركيز توقع من KI من المحاكاة COMSOL. في زمن الخلط، كما يقاس الوقت للتركيز على خفض 80٪، هو 8 ميكرو ثانية.

منذ تم جمع البيانات في 100 ميكرون الزيادات على طول القناة 500 ميكرون الخروج الطويل، لا بد من لصق البيانات معا من وجهات نظر متعددة. هناك إزاحة صغير في بعض الأحيان في إشارة بين وجهات النظر هذه، على الأرجح بسبب التغيرات الصغيرة في التركيز كما يتم نقل رقاقة من المرحلة المجهر. عن طريق تحريك المرحلة 80 أو 90ميكرومتر لكل رأي، ويمكن التخلص من هذه التعويضات من خلال دراسة البيانات المتداخلة. وعادة ما يتم جمع البيانات مع معدلات تدفق ما لا يقل عن اثنين ويتم الجمع بين البيانات للتأكد من أي إشارة التغييرات هي نتيجة للتغيرات الطيفية حقيقي في البروتين، وبدلا من التأثيرات البصرية أو تدفق. ويبين الشكل 9 الحنق تغيرات في بروتين ACBP بعد تخفيف من ممسخ في الفترة من 6 إلى M هذه البيانات 0،06 م. لا يحتاج الى تجربة مراقبة منذ الحنق هو بالفعل نسبة وتتم إزالة بالفعل استجابة الصك. القفزة السريعة بالقرب T = 0 يمثل تغييرا سريعا في إشارة الحنق في الوقت الاختلاط.

الشكل 1. تخطيط من منطقة الخلط تقاس المجهر الإلكتروني.

الشكل 2. تخطيطي من الهيدروديناميكية خلط لدراسة طي البروتين. هذا البروتين،الذائبة في ممسخ ارتفاع تتكشف فيه، يتدفق إلى أسفل قناة مركز تجاه المنطقة الاختلاط، حيث يقابل العازلة التي تتدفق ~ 100 مرة أسرع. تدفق رقائقي يفرض على تيار البروتين في طائرة ضيقة من الجزيئات التي يمكن نشرها بسرعة ممسخ. كما الطائرة يتدفق أسفل قناة الخروج، يمكن ملاحظة هذا البروتين مع ارتفاع القرار المكانية والوقت باستخدام مجهر متحد البؤر.

الشكل 3. تنصهر تلفيق السيليكا. 1) تبدأ العملية مع 500 ميكرون سميك لامع للغاية الركيزة السيليكا تنصهر فيها (أ) مع طبقة من البولي سيليكون (بولي) تترسب على الأسطح العلوية والسفلية (ب) و تدور المغلفة بطبقة من مقاومة للضوء (ج). 2) والضوئية الرئيسية (ه) يتم جلب مادبا يتعرض س اللاصقة الصلبة مع رقاقة ومقاومة للضوء وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية (د). 3) يتم وضع رقاقة في حمام المطور ويتكشف في نمط مقاومة للضوء. 4) يتم وضع رقاقة في DRIE ومحفورا الميزات في طلاء بولي أعلى. ثم تتم إزالة مقاوم الضوء. 5) وبولي يعمل ثم كقناع عندما يتم وضع رقاقة في مطبوع وأكسيد وحفرت ملامح 10-40 ميكرون إلى الركيزة السيليكا تنصهر فيها. 6) ثم تتم إزالة طلاء بولي في مطبوع ₂ XeF. 7) والمستعبدين ورقاقة لوحة من الزجاج الأضاحي مع تسرب الحرارة تنشيط (ز)، ملامح الجانب السلبي، ومثقاب الماس (و) من خلال التدريبات abrasively-الثقوب من المؤخر. 8) والتعريف السطحية (ح) ثم يقيس مباشرة أعماق ميزة محفورا. والمستعبدين مباشرة 9) وميكرون 170 سميك ساترة السيليكا تنصهر رقاقة على السطح العلوي من رقاقة. 10) ومكعبات الرقاقة إلى رقائق ميكروفلويديك الفردية.

3976/3976fig4.jpg "/>
الشكل 4. مشعب خلاط. يتم تأمين ميكروفلويديك رقاقة إلى حل متعدد الجوانب مع غطاء الالومنيوم تشكيله وأربعة طوقية تحت الخزانات 200 ~ ميكرولتر. يتم تشكيله حفرة واسعة من خلال مركز المتعددة مباشرة فوق منطقة خلط للرقاقة ميكروفلويديك الملصقة، مما يتيح زيادة الأشعة فوق البنفسجية من الفرار دون، ارتداد مبعثر منع أي مضان لصناعة السيارات متعددة من نفسها والسماح لإضاءة مباشرة من الشريحة قبل العين أو كاميرا للمحاذاة. الاختام مشعب الهواء كل واحد من هذه الخزانات التي يمكن السيطرة عليها ضغط الهواء في كل مربع عن طريق السيطرة على ضغط خارجي.

الشكل 5. تخطيطي من مجهر متحد البؤر البصرية.

الشكل 6. مؤامرة كونتور من التربتوفانمضان في الخلاط ميكروفلويديك. يقع في المنطقة خلط في ميكرومتر ~ 90 على المحور ص.

الشكل 7. وقت أطياف الفلورية تعتمد جمعها داخل خلاط. المستطيلات الخضراء والحمراء تظهر موجات تسمى القنوات المانحة ومتقبل، على التوالي.

الرقم 8. وقت الخلط تقاس تبريد مضان من التربتوفان بواسطة يوديد البوتاسيوم (نقطة ومحور اليمين) وتحسب من خلال تحليل العناصر المحدودة (خط ومحور اليسار).

الشكل 9. الحنق قياس التغيرات خلال للطي من ACBP بروتين. الارتفاع السريع قرب ر = 0 يمثل مرحلة الانفجار في الوقت خلط وزيادة ابطأ يمثل accumula تدريجينشوئها من هيكل كما طيات البروتين. وتم نقل البيانات على اثنين من معدلات تدفق مختلفة، وغطى، مما يؤدي إلى كثافات مختلفة من القياسات في أوقات مختلفة.

كان سريعا خلط هدف التنمية للحقل من طي البروتين لسنوات عديدة بسبب منذ فترة طويلة من المسلم به أن العمليات الجزيئية من الجزيئات الحيوية تحدث على مدى فترات زمنية تتراوح ما بين picoseconds إلى ثواني. التقليدية توقف تدفق خلاطات لها أوقات ميتة من مرض التصلب العصبي المتعدد 1-5 والتي تقتصر في المقام الأول من قبل الاضطرابات. وقد وضعت المضطربة خلاطات التدفق المستمر مع أوقات اختلاط 30-300 ميكرو ثانية على مدى السنوات ال 15 الماضية من قبل عدد قليل من الجماعات لكن عموما تتطلب معدلات تدفق عالية لتحقيق هذه الأوقات خلط وبالتالي استخدام الكثير من عينة ^6-8.

هذا البروتوكول يصف استخدام رقائق خلط ميكروفلويديك لتحقيق تخفيف السريع في تدفق رقائقي النظام. هناك مزايا عدة للعمل ضمن هذا النظام، ولكن واحد أساسي هو القدرة على محاكاة عملية خلط كامل مع دقة عالية مما يسمح احد لتعديل استجابة الاختلاط. T-خلاطات التي وضعتها مجموعات أخرى مع GEOM بسيطوقد أثبتت etries مرات خلط 100-200 ميكرو ثانية التي كانت تقتصر في المقام الأول عن طريق حجم قنوات ^9-10. عن طريق التوسع في حجم القنوات إلى فارس 10 ميكرومتر تقليل الوقت الاختلاط إلى ميكروثانية 10 ~ ^11. وأظهرت ياو وBakajin أن تغييرات صغيرة في الهندسة يمكن أن تؤدي إلى تحسينات كبيرة في زمن الخلط ^4. ومع ذلك، أظهرت أن العمل الذي تسارع من الخلط يمكن أن يؤدي أيضا إلى تباطؤ مراحل كذلك. تصميم المستخدمة في هذا العمل ^12-13 هو حل وسط بين اثنين من افضل التصاميم في إشارة ⁴ إلى التقليل من أبطأ الاضمحلال الأسي في تركيز ممسخ وايضا لجعل هذه الميزة أكثر استنساخه في النقش DRIE.

كان هناك بعض الجدل في مجال ultrarapid خلط حول تعريف الوقت الاختلاط. من المهم أن ندرك الفرق بين "زمن الخلط" و "الوقت الميت". ويعرف في الوقت الميت في خلاط المضطرب كما في المرة خلالها measuremenلا يمكن أن يتم تي ويمكن في الواقع أن تكون أطول بكثير من الوقت الذي خلط الفعلية. وعادة ما يتم تحديد ذلك عن طريق جعل قياسات عدة من رد فعل النظام ثنائي الجزيء الزائفة والعشرين (مثل التبريد ومضان التربتوفان بواسطة bromosuccinate N) بتركيزات مختلفة. يتم تركيبها في يضمحل المرصودة الأسي أن تتلاقى في قيمة واحدة يفترض أن تكون = 0 ر ق والوقت بين تلك النقطة والنقطة الأولى هي قياس الوقت الميت. لخلاطات تدفق الصفحي، يمكن إجراء قياسات أثناء عملية الخلط لذلك ليس هناك وقت ميت، سوى وقت الخلط. الوقت هو مجرد خلط الوقت على الجمع بين نوعين من الحلول حتى يتم التوصل إلى توحيد كاف. حددناها سابقا في الوقت الخلط إلى أن يكون الوقت 90/10، والوقت للتركيز ممسخ أن ينخفض ​​من 90٪ إلى 10٪ من قيمة غير مخلوط. ومع ذلك، فإن شكل المنحنى خلط غير متماثل تماما مع الذيل من الاضمحلال وجود عنصر صغير الأسي. وعلاوة على ذلك، طي البروتين لديهغاية غير الخطية والاعتماد على تركيز ممسخ بحيث قابلة للطي يمكن أن تبدأ في كثير من الأحيان حتى لو يتم تقليل فقط ممسخ من قبل اثنين من أمثالها. ولذلك قمنا في الآونة الأخيرة تعريف زمن الخلط والوقت للحد من تركيز ممسخ بنسبة 80٪. يمكن بالتأكيد أن تستخدم تعريفات أخرى تبعا لاحتياجات التجربة.

وكشف استخدام هذا الخلاط لدراسة طي البروتين على الدوام نتائج مذهلة. للطي من ج السيتوكروم وapomyoglobin منذ فترة طويلة ان يكون درس خطوات للطي متعددة والنتائج في وقت مبكر مع خلاطات التدفق المستمر وأظهرت انهيار تحدث على مقياس الوقت ~ 100 ميكرو ثانية ^10،14-15. وأظهرت قياسات لدينا مع هذا الخلاط أن يكون هناك ما لا يقل عن 2 خطوات على هذا الجدول الزمني، وهو، على الأرجح بسرعة كبيرة غير محددة، وانهيار (مقاسا التحول مضان الطيفي التربتوفان) في وقت خلط خالط تليها مرحلة أبطأ (كما هو الحال تقاس التبريد من الانبعاثات التربتوفان الكل) أن من المرجح أن FIRST تشكيل هيكل الأصلي ^5. وقد لاحظنا أيضا عملية ميكروثانية 50 في نطاق B1 من L بروتين، قلب التفسير التقليدي أن هذا البروتين هو مجلد ^2-13 دولة.

ومن مزايا هذا الخلاط السريع هو أنه لا يمكن سبر للطي من البروتينات أسرع للطي والتي عادة ما كانت قابلة للقياس فقط من الصكوك T-الوثب النانوسيكند. T-القفز عادة ما يتطلب مراقبة للطي / تتكشف الاسترخاء بالقرب من درجة حرارة انصهار من البروتين، وبالتالي لم يتبع للطي من مجموع السكان. مع هذا الخلاط لقد ألقينا نظرة على للطي من قامع-γ (λ ^6-86) مع كل من اجمالى انبعاثات التربتوفان والتحول الطيفية ولقد وجدت أدلة على أن بروتين لا يوجد لديه حاجز للطي في ظل ظروف قابلة للطي القوية التي لم تكن في متناول تي السابقة -القفز قياسات ^12. أخيرا لقد قمنا بقياس قابلة للطي من خوذة villin HP-35، واحدة من رانه أسرع المجلدات تقاس بعد، ووجدت أن نسبة قابلة للطي قياس بعد خلط ~ 5 مرات أبطأ من قياس T-القفزة في ظل نفس الظروف ^16. هذا يشير إلى أن حركية قابلة للطي تعتمد على ظروف الانطلاق، في انقلاب افتراض رئيسي في هذا المجال.

ليس لدينا ما يكشف.

ويدعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم FIBR (جبهة الخلاص الوطني EF-0623664) وIDBR (جبهة الخلاص الوطني DBI-0754570). وأيد هذا العمل جزئيا بتمويل من المنحة الوطنية للعلوم FIBR 0623664 مؤسسة تدار من قبل مركز بيوفوتونيك، وجبهة الخلاص الوطني للعلوم والتكنولوجيا المركز، الذي تديره جامعة كاليفورنيا في ديفيز، في إطار اتفاق التعاون PHY 0120999. البحوث من ليزا لابيدوس، دكتوراه معتمد في جزء من جائزة الوظيفي في واجهة العلم من صندوق مرحبا بوروز.

1. Eaton, W.A., et al. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
2. Hertzog, D.E., et al. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
3. Hertzog, D.E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., & Santiago, J.G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
4. Yao, S. & Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
5. Lapidus, L.J., et al. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
6. Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L.A., & Matthews, C.R.A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
7. Chan, C.-K., et al. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
8. Shastry, M.C.R., Luck, S.D., & Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
9. Pollack, L., et al. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
10. Takahashi, S., et al. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
11. Knight, J.B., Vishwanath, A., Brody, J.P., & Austin, R.H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
12. DeCamp, S.J., Naganathan, A.N., Waldauer, S.A., Bakajin, O., & Lapidus, L.J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
13. Waldauer, S.A., et al. Ruggedness in the folding landscape of protein L. Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).
14. Shastry, M.C.R. & Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
15. Uzawa, T., et al. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
16. Zhu, L., et al. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.