Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

Waldauer, S. A., Wu, L., Yao, S., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding. J. Vis. Exp. (62), e3976, doi:10.3791/3976 (2012).

Kendi doğal yapısındaki bir proteini kıvrımlar biyoloji ve insan sağlığı hala henüz tam olarak anlaşılamamıştır oldukça alakalı olan süreçtir. Bunun bir nedeni, bu katlama protein ¹ bağlı olarak, nanosaniye ile saniye ya da daha fazla, süresini çok geniş bir aralık içinde yer alan bir. Konvansiyonel durdu-akış mikserler katlama kinetik ölçümü yaklaşık 1 ms başlayan sağladı. Biz son zamanlarda ~ 8 μs ² denaturant ~ 100 kat sulandırır bir mikroakışkan karıştırıcı geliştirdik. Durmuş bir akış mikser aksine, bu mikser türbülans oluşmaz hangi laminer akış rejimi çalışır. Türbülans olmaması ^3-4 deneme için mükemmel bir anlaşma ile mikser içindeki tüm akımları hassas sayısal simülasyonu sağlar.

Laminar akış ≤ 100 Re Reynolds sayıları için elde edilir. Sulu çözelti, bu mikron ölçeğinde geometri gerektirir. Bu tür silikon veya erimiş silikonlu yağla olarak, sert bir yüzey kullanımıca, (Bakınız Şekil 1) kanalları 5-10 mikron genişliğinde ve 10 mikron derin yapmak. Küçük boyutları, karıştırma bölgeye girişinde, boyutu 1 mikron mertebesinde vardır. Çip optik erişim için ince bir cam veya silika coverslip ile örtülmüştür. Tipik toplam doğrusal akım hızları ~ 1 m / s, akma Re ~ 10, fakat protein tüketimi sadece 0.5 ~ nL / s veya 1.8 uL / saat. Protein konsantrasyonu tespit yöntemi bağlıdır: triptofan floresans için tipik derişim 100 uM (1 Trp / protein) ve tipik konsantrasyonu ~ 100 nM'dirki FRET için.

Katlama işlemi 6 M 0.06 M guanidin hidroklorür denaturant hızlı seyreltme tarafından başlatılır. Yüksek denaturant bulunan protein merkezi bir kanal aşağı akar ve denaturant (bkz. Şekil 2) ~ 100 kat daha hızlı hareket ettirmeden tampon ile karıştırma bölgede iki tarafında karşılanmaktadır. Bu dar bir geometri içine proteini akışının hızlı daralma nedenjet ~ 100 nm çapında. Ağır protein moleküllerinin difüzyon çok yavaş 1 ms difüzyon az 1 mikron iken ışık denaturant moleküllerin difüzyon, çok hızlıdır. Proteini yaklaşık denaturant etkili konsantrasyonu azaltarak denaturant ve protein akışından denaturant hızlı dilüsyonu proteini sonuçların sabit bir difüzyon farkı,. Protein jet bir tarama mikroskobu konfokal ⁵ kullanılarak tespit edilebilir katlama sırasında protein gözlem kanalı ve floresans aşağı doğru sabit bir hızda hareket eder.

1. Mikroakışkan Karıştırma Chips Fabrikasyon

Şekil 3, temel imalat aşamalarını göstermektedir.

1. Taze Piranha çözüm (: H ₂ O ₂ 03:01 H ₂ SO _4): 4 inç (100 mm) silika gofret temizleyin i) Isı sülfürik asit 130 ° C sonra peroksit dökün. Yüzey pürüzlülüğü ve erimiş silika gofret düzlüğü son yapıştırma adım için önemli bir rol oynayabilir kullanılan unutmayın. ii) en azından 30 dakika süreyle gofret bırakın. iii) su ve kuru ile 5 dakika için durulanır. Bir polysilicon (poli) kaplama tatbik, bir düşük basınç kimyasal buhar çöktürme (LPCVD) fırını kullanılarak, son mikroakışkan kanalların her amaçlanan 10 um kalınlığında derinliği başına ~ 1 um,.
2. Adım 1.1 Piranha protokolünü kullanarak gofret ve maske temizleyin. Maske aynı şekilde temizleyin, sonra aseton, metanol ve izopropanol ile yıkayınız ve hemen kuru bir darbe. 15 sıcak bir plaka üzerinde gofret kurutmak0 ° C'de ~ 10 dakika (uzağa parçacık tutmak için bir alüminyum folyo çadırı kullanmak) ya da en azından 120 dakika (tercihen bir gece boyunca) için bir 120 ° C fırın içinde. Fotorezist tutunmasının arttırılması için, hemen 5 dakika HMDS buharı sıcak gofret maruz bırakmaktadır. ° C sıcaklıkta 1 dakika için bir ocak gözünde veya 30 dakika (Şekil 3, Adım 1) için 110 ° C fırında 90 AZ5214 ışığa ve yumuşak fırında bir ~ 900 nm kalınlığında bir tabaka ile Spin kat gofret.
3. Maske hizalayın ve sabit ve vakum temas. (Şekil 3, adım 2): Birkaç saniye (~ 103 mJ / cm ² toplam enerji) için UV ışığına maruz bırakmayın. Yavaşça karıştırılırken ~ 50 saniye DI su ile 4:1 oranında seyreltilir AZ400K geliştirici, (ışığa tam olarak gelişinceye kadar) ile geliştirin. 2 dakika su ile durulayın. Mikroskopla özellikleri (Şekil 3, adım 3) kontrol edin. Özellikleri zayıf biçimde çözülmüş ise, ışığa şerit ve 1.2 'den tekrar başlayın. Sabit fırında 115 ° C, doğrudan 2 için bir ocak gözündedakika.
4. 100 W RF güç az 2.5 dakika Asher veya O ₂ plazma ile Descum gofret. Derin reaktif iyon yakıcısı (Drie), aşağıda silika kadar etch polisilikon tabaka her şekilde kullanma. 10 dakika boyunca 75 ° C'de sıyırma karşı PRS2000 ile kalan ışığa şerit. Durulayın ve kurulayın. Bu poli kaplama (Şekil 3, adım 4) tüm yol boyunca sağlamak için rölyef derinliği ölçün.
5. Böyle bir ULVAC NLD-6000 etcher, poli kaplama (Şekil 3, adım 5) arasında mikron kalınlığında başına ~ 10 um arasında bir derinliğe kadar aşındırma erimiş silis gibi bir oksit yeteneğine Drie kullanılması. Bu poli kaplama dağlama sırasında aşınmış olacak, böylece yakma işlemi sırasında periyodik olarak kaplama bütünlüğünü kontrol etmek için gerekli olabilir. Gofret yüzey kasıtlı özelliksiz bölgeleri dağlama sırasında koruyucu poli kaplamanın çıplak elimden haline gelmiştir ise, yüzey büyük olasılıkla çekirdeksiz haline gelmiştir ve artık yapıştırma için uygun olacaktırÜretim nihai adımda. Bu durumda gofret büyük olasılıkla artık geçerli olduğunu. 4 dakika, 100 W RF güç için Matrix Asher ile temizleyin. Bir XeF ₂ yakıcısı (Şekil 3, 6. adım) ile polisilikon soyun. Bu ışığa ve poli kaplamalar her kaldırma adım 1.4 ve bu adım birkaç kez tekrar için gerekli olabilir.
6. Daha sonraki işleme sırasında kanalları korumak için ışığa yeni bir ~ 1 um ile kaplama tabakasının gofret dönerler. Bir Kumlama (Şekil 3, adım 7) ile elmas uçlu matkap veya manuel olarak kontrol edilen bir bilgisayar kullanıyorsanız, her çip giriş ve çıkış delikleri açılır. Bir matkap kullanıyorsanız, kabarcıkların Bonder ücretsiz tutmaya özen göstererek, Aqua Bond 55 kullanarak bir kurbanlık cam levha üzerine gofret (özelliği tarafı aşağı) monte edin. Mikro-90 temizleme solüsyonu ile matkap soğutulur. Bu da kullanım sırasında çip tıkayabilir kanalları yapışmasını küçük cam bit tutar.
7. W enjekte etmek için bir şırınga kullanarak DI suyla durulayın gofretHer deliğin içine ater. Bir saat için sabunlu suyla yıkayınız. Yüzey temiz olana kadar birkaç saat süreyle 60 ° C'de PRS 2000 ile ve ışığa Aqua Bond çıkarın. DI su ve ılık sabunlu su ile gofret durulayın. Kazınmış özellikler kaçınarak, bir şırınga ile yine her delik durulayın. Nitrojen ve bir vakum fırını içinde kuru gofret 120 ° C'ye ayarlanır Onlar kum serbest olmasını sağlamak ve gerekli adımları temizlik tekrarlamak delikleri inceleyin. Ya bir optik veya mekanik yüzey profilci (Şekil 3, adım 8) ile kanal derinliğini ölçün.
8. Temiz gofret ve 1 ile eşit sayıda 170 mikron kalınlığında erimiş silis cam kapak) Piranha çözeltisi (1-2 saat içinde 1.1 prosedüre göre), 2) RCA 2 (05:01:01 DI: HCl: H ₂ 0 ₂ 75 ° C'de 10 dakika süreyle) çözeltisi, 3) RCA 1 solüsyonu (05:01:01 DI: 75C azından 22 dakika için 0 ₂ H _2)): NH ₄ OH. Her çözüm arasında 5 dakika DI su ile durulayın.
9. Yeri bir gofret özellikleri üstüne kadar yanBöyle bir cam küçük bölmesine kadar sert bir düz yüzey üstüne yerleştirilir 3-4 temiz mendil, bir yığın. En az 5 dakika süreyle azot gazı ile iyice gofret kurutun. Cam ile tekrarlayın. Kenarından cam kapak Pick up ve cilalı yüzü aşağı gofret üzerinde düzenlenen ve düz kenarlarını olduğu gibi ters çevirin. Dikkatle gofret üzerine kapak cam okulu bırakmaya ve yerleşmesine izin. Hizalama ayarlamak için yatay sadece iteleme. Gofret ortasına bir parmak aşağı doğru itin. Tek bir bağ ön dışarıya doğru yayılmayı başlar görmelisiniz. Gerekirse, yapıştırma ön (Şekil 3, adım 9) ilerlemek için gofret çevresindeki diğer pozisyonlar için ek basınç uygulayın.
10. ° C başka bir 1,2 saat üstü 1100 - 800'de, sonra oda sıcaklığında ° C 3 saat içinde 800 rampalanacaktır ayarlanmış yüksek sıcaklıkta fırında mühürlü gofret yerleştirin. 2 saat boyunca 1100 ° C sıcaklıkta tutmak, ve daha sonra başka bir 1.5 saat boyunca oda sıcaklığına kadar rampa.
11. Bir gofret dicing ile Zar i içine gördümndividual yongaları (Şekil 3, adım 10).
12. Protokolü UV tespiti için gerekli olan oldukça sıradışı silika substrat kanalları fabrikasyon açıklar. Ancak bu protokolü, sadece tek bir aşındırma adım ² gerektiren bir silikon substrat için adapte edilebilir. Bir bardak (ama kaynaşmış silika) cam kapak anodik bağlama kullanarak gofret bağlı olabilecek.

2. Cips Montaj ve Yükleme

1. Karıştırma yongası ve çözümleri tutun manifoldu gibi Lexan veya pleksiglas veya sıcaklık kontrolü için alüminyum (bkz. Şekil 4) gibi, plastikten yapılmış olabilir. Alüminyum kullanılıyorsa, çözelti rezervuarlar içerisinde rezervuar tuz çözeltileri ile alüminyum çözünme önlemek için parylene ile kaplanmış edilmelidir. Termik cihazlar taraf ve elektronik bir kontrol üzerine monte edilmiş olan tüm manifoldu, çözeltiler ve yonga sıcaklığı kontrol edilebilir.
2. Çip mani için şeklindeki biro-ringler küçük bir çip merkezinde net bir görüş sağlayan optik tespit bileziği ile yerinde tutulur tarafından kat. O-ring oluklar çip çok fazla baskı uygulamadan iyi bir çiftleşme sağlamak için standart daha sığ olmalı, yani bir 002 o-ring olmalıdır 0.025 "derin. Çip monte sonra, orta ve yan rezervuarları çözümler ekleyin , kuyu dibinde tuzak varsa kabarcıkları serbest bırakmak için özen.
3. Bu mikser kullanılan hacimleri çok küçük olduğundan, akış çözümü kuyuları üzerinde uygulanan hava basıncı ile kontrol edilebilir. Şekil 4 o-ring tarafından çip manifoldu üst evlendirilen basınç manifoldu gösterir. Basınç manifoldu ~ 2-80 PSI basıncı koruyabilirsiniz bilgisayar kontrollü basınç dönüştürücüler bağlı. Çip merkezi ve yan kanallar üzerinde eşit basınçlar lineer akım hızlarında ~ 100 kat oranı üretmek böyle tasarlanmıştır. 20 PSI anda, çıkış kanal lineer debi ~ 1 m/ S.
4. Inverted mikroskopta manifoldu yerleştirin ve mercek veya kamera çıkışı ile bölge karıştırma inceleyin. Manifoldu üzerine yerleştirilen bir akkor feneri yeterli ışık sağlayacaktır. Jet görmek için merkez kanaldaki kırılma çözümün bir boya veya yüksek indeksi (yani 6 M guanidin hidroklorür) kullanın.
5. Merkezi ve yan kanallar eşit basınçta, jet gözle görmek kadar 0 PSI yan kanal basıncı ile başlar ve yavaş yavaş eşit basınç artırmak için zor olacaktır. Bir yan kanal tıkanmış edilirse, jet çıkış kanalının duvarlardan biri doğru itilen edilecektir. Görünür bir takunya görünürse, bir şırınga ile çıkış kanalına basınç veya vakum uygulanarak yerinden olabilir.
6. Protein veya diğer organik materyal çip takunya, bu gecede Pirhana suda bekletip, yıkanabilir.

3. Bilgi toplama

Şekil 5, temel optik araç düzenini gösterir.

1. Mikroskop dışında, içerde veya sadece bir dikroik ayna kullanarak bir araştırma dereceli mikroskop içine bir paralel lazer ışını getirin. Odak biraz karıştırma bölgesi yakınında mercek veya kamera görülebilir ki lazer hizalama.
2. Mikserde proteini floresans amacı ile toplanmış ve dikroik ayna yoluyla gönderilen bir iğne deliği için bir mercek tarafından odaklanmakta ve bir foton sayacı üzerinde görüntülenmektedir. Görüntü karıştırma bölgesi (tipik adım büyüklüğü 2 mm olan) x ve y bir piezoelektrik tarayıcı kullanarak çip tarayın. Dikey olarak kanalının ortasına odak bulmak için x ve z jet ve tarama bir konumda seçebilir. Mikroskobun alan derinliği kanal derinliği çok daha azdır ve debi duvarların 1 mikron içinde dışında kanal eşit olarak dağılmıştır. Bu nedenle, gözlenen floresans zamansal çözünürlüğü esas konfokal leke boyutuna göre belirlenir.
3. Çıkış kanalı (tipik adım s içinde yatay taramaize jet üzerinden 0.2 mikron olan, ~ 1 ms başına pozisyon için gözlemleyerek jet boyunca 100 mikron artışlarla, içinde jet boyunca 2 mikron) (bkz. Şekil 6). İlerleyen zamanlarda yakalamak için jet boyunca 80-90 mikron tarafından mikroskop sahne taşıyın.
4. Alternatif olarak, ışık giriş açıklığının üzerine ışık odaklanmak için bir mercek kullanarak dikroik aynadan sonra bir tayfçeker ve CCD ile tespit edilebilir. Veri toplama foton sayacı (pozisyon başına 1 saniye) göre daha yavaş olduğu için, tipik olarak, jet foton sayacı ile birinci görüntülendi ve daha sonra jet boyunca noktalar (bakınız Şekil 7) spektrograf ile ölçülür.
5. Foton sayacı Veri yoğunluğu vs mesafe bir arsa oluşturmak için her pozisyonda jet yaklaşık 3-5 piksel toplayarak analiz edilir. Zaman uygulanan baskılar (bkz. Şekil 8) göre hesaplanan hız kullanarak mesafe hesaplanır.
6. Spektrograf veri yollarını bir çift analiz edilebilir. Için, channe FRET"donör" ve "alıcı" olarak belirlenmiş ls her toplanır ve yakınlık oranı E = _{I, A} / (I _D + I _D) hesaplanır (bkz. Şekil 9). edilebilir Alternatif olarak, tek bir değer ayrışımı böyle bir protein kıvrımlar gibi triptofan emisyon spektrumunda vardiya olarak zaman vs bağımsız spektral bileşenleri, bakmak için yapılabilir.
7. Çıkış kanalının içinde mesafe uygulanan basınç tarafı kanallar kararlı sabit akış oranı kullanılarak zaman dönüştürülebilir. Çıkış kanalının ilk 2 mikron içinde, protein jet akış hızı ~ 100x hızlandırır ve bu bölgede kez (Şekil 8 kez çizilen üreten) akıcılık sonlu elemanlar analizi ile hesaplanması gerekir. Hız sabit olur ve genellikle karıştırma çok daha yavaş kinetik ölçüm göz ardı edilebilir sonra bu ivme bir ~ 1-2 ms'den ofset üretir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 6 foton sayacı ile ölçüldü karıştırma bölgede yoğunluğun bir kontur şemasını göstermektedir. Jet çıkış dışında kanalda arka detektörün gürültü tabanına yakın olması gerekir ve tipik olarak çıkarılır değildir. Daha yüksek bir arka plan düşük uyum gösterebilir veya protein kanalın duvarına yapışmasını olduğu. Özellikle karıştırma bölgesi yakınında, bükülmüş veya eğri görünür bir jet, nozul kötü bir etch gösterir.

Şekil 7 kez Alexa 488 ve Alexa 647 etiketli protein açil-koenzim A-bağlayıcı protein (ACBP) den spektrumları çözümlenir gösterir. Bu veriler, arka plan koyu şarj ve lazer sinyali kaldırmak için alınmış olur. Arka sinyal 0 PSI ayarlanmış merkez kanal basıncı ile çekilmiştir.

Karıştırma süresi gibi Trp floresans b olarak karıştırılması çok daha hızlı bir hızlı tepki ölçerek ölçülebiliry KI ya etiketli, tek damarlı bir DNA çökmesi, NaCl ilavesi ile, boyalar FRET. Jet mikroskop optik çözünürlük daha az olduğu için, jet formları gibi karıştırma bölgesinde geniş bir yoğunlukta damla vardır. Bu cihaz, herhangi bir yanıt çözelti koşulları değişim. Şekil 8 karışım oranı (400 mM içine Kİ) ve N-asetil triptofan amid floresans olmayan karıştırma deney gösterir ki içinde bir kontrol ölçümü yaparak kaldırılabilir. Çizgi Comsol simülasyonlar KI tahmin konsantrasyonu gösterir. Karıştırma süresi,% 80 azaltmak için konsantrasyonu için zaman olarak ölçülen, 8 μs olup.

Veri 500 mikron uzunluğunda çıkış kanalı boyunca 100 mikron aralıklarla toplanan bu yana, veri birden çok kez bir araya yapıştırılan gerekir. Çip mikroskop aşaması tarafından taşınır gibi odak küçük değişiklikler nedeniyle muhtemelen bu görünümler arasında sinyal zaman zaman küçük uzaklıklar vardır. Sahne hareket ettirerek 80 veya 90görünümü başına um, bu uzaklıklar örtüşen veriler incelenerek ortadan kaldırılabilir. Tipik olarak yerine optik veya akış etkileri daha proteini gerçek spektroskopik değişiklikleri, bağlı olan en az iki veri akışı hızları ile toplanır ve verilerin herhangi bir değişiklik sinyali teyit etmek için birleştirilmektedir. Şekil 9 ile seyreltildikten sonra protein ACBP değişiklik gösterir FRET FRET yana 6 M 0,06 M. Bu verilere denaturant bir kontrol deneyi gerekmez zaten bir oranı ve alet tepkisi zaten kaldırılır. T = 0 civarındaki hızlı atlama karıştırma süre içinde sinyal FRET hızlı bir değişimi temsil eder.

Şekil 1. Elektron mikroskobu ile ölçülen karıştırma bölgenin Düzeni.

Şekil 2. Protein katlanması incelemek için karıştırma hidrodinamik şematik. Protein,Açıklamaları yüksek denaturant çözülür, bu tampon ~ 100 kat daha hızlı akan uygun karıştırma bölgeye yönelik merkez kanal aşağı akar. Laminar akış denaturant molekülleri hızla yayılabilir hangi dar bir jet içine protein akışı zorlar. Jet çıkış kanalı aşağı akarken, protein konfokal mikroskop kullanarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlük ile görülebilir.

Şekil 3. Silika fabrikasyon. 1) proses, üst ve alt yüzeyler üzerinde biriken polysilicon bir tabaka (poli) ile birlikte bir çok cilalı 500 mikron kalınlığında erimiş silis substrat (a) ile başlar (b) ve ışığa (c) bir tabaka ile kaplanır spin. 2) Bir photomask (e) Int getirilir gofret ve heba olan o sert kontakt UV ışık (d) maruz kalmaktadır. 3) gofret geliştirici banyosuna yerleştirilir ve desen fotorezist ortaya çıkmaktadır. 4) gofret bir Drie yerleştirilir ve özellikleri iyi poli kaplama kazınmış edilir. Işığa daha sonra çıkartılır. Erimiş silis substrata 40 mikron - 5) daha sonra poli gofret bir oksit etcher yerleştirilir ve özellikleri 10 kazınmış olan bir maske olarak hareket eder. 6) daha sonra bir poli kaplama XeF ₂ etcher kaldırılır. 7) gofret bir ısı ile aktive mastik (g), aşağı özellikleri yan, ve arkasından-deliklerden bir elmas matkap ucu (f) abrasively matkap ile bir kurbanlık cam plaka yapıştırılır. 8) A yüzeyi profilci (h) daha sonra doğrudan kabartma özelliği, derinlikleri ölçer. 9) bir 170 mikron kalınlığında erimiş silis coverslip gofret doğrudan levhanın üst yüzeyi üzerine yapıştırılır. 10) gofret bireysel mikroakışkan çipleri içine doğranmış edilir.

3976/3976fig4.jpg "/>
Şekil 4. Karıştırıcı manifoldu. Mikroakışkan-çip işlenmiş alüminyum kaplamasını ve ~ 200 ul rezervuar altında dört o-ringler çözüm manifoldu sabitlenir. Büyük bir delik aşırı UV ışık manifoldu kendisinden gerisaçılımı, engelleyici herhangi bir oto-floresans olmadan kaçmak için izin ve göz tarafından çip direkt aydınlatma sağlayan, doğrudan yapıştırılmış mikroakışkan-çip karıştırma bölgenin üstüne manifoldu merkezi aracılığıyla işlenmiştir uyum için veya kamera. Her hava basıncı harici bir basınç kontrol kutusu vasıtası ile kontrol edilebilir hava manifoldu conta gibi rezervuar her.

Şekil 5. Optik konfokal mikroskop şematik.

Şekil 6. Triptofan Kontur arsamikroakışkan mikserde floresans. Karıştırma bölgenin y ekseni üzerinde ~ 90 mikron bulunmaktadır.

Şekil 7. Mikser içinde toplanan Zamana bağlı floresan spektrumları. Yeşil ve kırmızı dikdörtgenler sırasıyla donör ve alıcı kanal olarak belirlenen dalga boylarını göstermektedir.

Şekil 8. Potasyum iyodür (puan ve sağ eksen) tarafından triptofan floresans ile ölçülür ve sonlu elemanlar analizi (hat ve sol eksen) tarafından hesaplanan Karıştırma zamanı.

Şekil 9. Proteini ACBP bir katlama sırasında ölçülür değişiklikler FRET. T = 0 civarındaki hızlı yükselişi karıştırma süresi içinde bir patlama aşamasında temsil eder ve yavaş yükseliş kademeli bir birikimi temsilprotein kıvrımlar gibi yapı NEONA. Veriler iki farklı akış hızlarında çekilen ve farklı zamanlarda ölçümler farklı yoğunlukları yol overlaid edildi.

Uzun biyomoleküllerin moleküler süreçlerin, piko saniye kadar zaman ölçeğindeki meydana geldiği kabul edilmiştir, çünkü Hızlı karıştırma yıllarca protein katlanması alan için bir gelişme hedefi olmuştur. Konvansiyonel durdu-akış karıştırıcılar başta türbülans ile sınırlıdır 1-5 ms ölü zamanları vardır. 30-300 ms'den karıştırma süreleri ile Çalkantılı sürekli akış mikserler gruba az sayıda son 15 yılda geliştirilen ancak genellikle bu karıştırma süreleri elde etmek için yüksek debi gerektiren ve bu nedenle örnek ^6-8 çok kullanmaya başlamıştır.

Bu protokol laminer akış rejimindeki hızlı seyreltme ulaşmak için mikroakışkan karıştırma fiş kullanımı anlatılmaktadır. Orada bu rejim içinde çalışan birden çok avantajı vardır, ancak birincil bir bir karıştırma yanıt değiştirmenize olanak veren yüksek hassasiyet ile tüm karıştırma işlemi taklit yeteneğidir. Basit geom ile diğer gruplar tarafından geliştirilen T-mikserleretries öncelikle kanal ^9-10 büyüklüğü ile sınırlı kaldı 100-200 ms'den karıştırma kez gösterilmiştir. 10 mikron Knight kanallarının boyutunu ölçekleme By ~ 10 ms'dan ¹¹ karıştırma süresi azalır. Yao ve Bakajin geometri küçük değişiklikler karıştırma süresi ⁴ önemli gelişmelere yol açabileceğini gösterdi. Bununla birlikte, bu çalışma karıştırma olduğu ivme zamanda da yavaş fazlar yol açabilir gösterdi. Bu çalışmada ^12-13 kullanılan tasarım denaturant konsantrasyon yavaş üstel çürüme en aza indirmek ve aynı zamanda Drie aşındırma bir özelliği daha tekrarlanabilir yapmak için referans ^4'te iki iyi tasarımları arasında bir uzlaşmadır.

Karıştırma süresi tanımı içinde karıştırılması ultrahızlı bireylerde alanında bazı tartışmalara olmuştur. Bu "karıştırma süresi" ve "ölü zaman" arasındaki farkı fark etmek önemlidir. Ölü zaman zarfında bir ÖLÇME süre olarak çalkantılı bir mikser tanımlanırt yapılamaz ve aslında gerçek karıştırma süreden önemli ölçüde daha uzun olabilir. Bu, tipik olarak, çeşitli konsantrasyonlarda bir sahte-birinci dereceden iki moleküllü reaksiyonu (örneğin, N bromosuccinate tarafından triptofan floresans soğutmadan gibi) çeşitli ölçümler yapmak tarafından belirlenir. Gözlenen üstel çürükleri t = 0 s olarak kabul tek bir değerde yakınsama takılan ve bu noktadan ve ilk ölçülen nokta arasındaki zaman ölü bir zamanı vardır. Herhangi bir ölü zaman, sadece bir karıştırma süresi olacak şekilde laminar akış karıştırıcılar için ölçüm karıştırma işlemi sırasında yapılabilir. Karıştırma süresi gerçekte yeterli homojenlik elde edilene kadar iki çözüm birleştirme zamanı. Biz daha önce 90/10, karıştırılmamış değerinin% 10 ila% 90 azaltmak için denaturant konsantrasyonu için zaman olması karıştırma süresi belirledik. Bununla birlikte, karıştırma eğrisi şekil küçük üstel bileşenine sahip çürüme kuyruk ile mükemmel simetrik değildir. Ayrıca, protein katlanması, bir vardenaturant konsantrasyonu üzerindeki yüksek doğrusal-olmayan bir bağımlılığının katlama genellikle denaturant sadece iki misli azalır bile başlaması böylece. Bu nedenle son zamanlarda% 80 oranında denaturant konsantrasyonunu azaltmak için zaman olarak karıştırma süresi belirledik. Kuşkusuz, diğer tanımları deney gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir.

Protein katlanması incelemek için bu mikser kullanımı sürekli şaşırtıcı sonuçlar ortaya koymuştur. Uzun sürekli akış mikserler ile çoklu katlama adımları ve erken sonuçlar almaya çalışılmıştır sitokrom c ve apomyoglobin katlanması ~ 100 s ölçeğinde ^10,14-15 oluşmasına çöküşü gösterdi. Bu mikser ile yaptığımız ölçümler (olarak daha yavaş bir faz takip Mikserin karıştırma süre içinde, çok hızlı, muhtemelen spesifik olmayan, çökmek (as Trp floresans spektral vardiya ile ölçülen) bu ölçeğinde en az 2 adım olacaksa gösterdi ) toplam Trp emisyon soğutma ile ölçülen olasılıkla fdoğal yapısı ⁵ IRST oluşumu. Ayrıca, bu proteinin, bir 2-klasörün ¹³ durumu olduğu geleneksel yorumlama iptali için, protein, L B1 alanı içinde bir 50 μs işlemi araştırmacılar tarafından gözlenmiştir.

Bu hızlı bir mikser bir avantajı, genellikle sadece nanosaniye T-atlama araçlar ile ölçülebilir olmuştur hızlı katlama proteinlerin katlama yoklamak olmasıdır. T-atlama genellikle katlama / protein erime sıcaklığına yakın rahatlama açılması ve bu nedenle bütün nüfusun katlanması aşağıdaki asla gözlem gerektirir. Bu mikser ile biz Trp toplam emisyon ve spektral vardiya her ikisi ile γ-repressör katlama (λ ^6-86) baktım ve protein önceki T tarafından erişilebilir olmadığını güçlü katlama koşullarda katlama için hiçbir engel olmadığını kanıtlar buldular ölçümleri ^12-atlamak. Son olarak, bir t villin başlık HP-35 ile katlama ölçülenO hızlı klasörleri henüz ölçülür ve karıştırma sonra ölçülen katlama oranı aynı şartlar altında ¹⁶ T-atlama ile ölçülen daha ~ 5 kat daha yavaş olduğunu buldu. Bu katlanma kinetikleri alanda büyük bir varsayımı devrilmesiydi başlangıç ​​şartlarına bağlı olduğunu göstermektedir.

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı fibr (NSF EF-0.623.664) ve IDBR (NSF DBI-0.754.570) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma kısmen Kooperatif Anlaşması PHY 0120999 altında Kaliforniya Üniversitesi, Davis tarafından yönetilen Biophotonics, bir NSF Bilim ve Teknoloji Merkezi Merkezi tarafından yönetilen Ulusal Bilim Vakfı fibr Hibe 0623664, fon tarafından desteklenmiştir. Lisa Lapidus, doktora ve araştırma Burroughs Hoşgeldiniz Fonundan Bilimsel Arayüz bir Kariyer Ödülü kısmen desteklenmektedir.

1. Eaton, W.A., et al. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
2. Hertzog, D.E., et al. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
3. Hertzog, D.E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., & Santiago, J.G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
4. Yao, S. & Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
5. Lapidus, L.J., et al. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
6. Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L.A., & Matthews, C.R.A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
7. Chan, C.-K., et al. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
8. Shastry, M.C.R., Luck, S.D., & Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
9. Pollack, L., et al. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
10. Takahashi, S., et al. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
11. Knight, J.B., Vishwanath, A., Brody, J.P., & Austin, R.H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
12. DeCamp, S.J., Naganathan, A.N., Waldauer, S.A., Bakajin, O., & Lapidus, L.J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
13. Waldauer, S.A., et al. Ruggedness in the folding landscape of protein L. Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).
14. Shastry, M.C.R. & Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
15. Uzawa, T., et al. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
16. Zhu, L., et al. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.