ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

1. ההכנות שקדמו electroporation

1. להגביר את ה-DNA על ידי electroporation הכנה מקסי (בפריים זה או Qiagen). הריכוז של ה-DNA צריך להיות מינימום של 1 מ"ג / מ"ל ​​לספיגה יעילה.
2. הסרה של 495 μL של ה-DNA ומערבבים עם μl 5 של גרין מהיר 0.01% ב 1 X PBS (פוספט שנאגרו מלוחים) בצינור microcentrifuge.

2. העוברית קציר

1. להקים הזדווגויות זמן קבועים של CD-1 בעכברים (הרלן). יש לבדוק את הימצאותם של אטמי בנרתיק ורואים את התאריך תוסף הנרתיק הוא ציין כיום העוברית (E) 0.5. עוברים יהיה לקצור 11 ימים לאחר חזותי תקע (E11.5).
2. מניחים כלים סטריליים באתנול 70%. פנקו את הזרימה למינרית מכסה המנוע עם האור האולטרה סגול של לפחות שעה אחת לפני השימוש. מכסה המנוע ריסוס, מגש לנתח, וגם לנתח היקף עם אתנול 70%. חום לפני 1 X PBS על 37 ° C.
3. על E11.5 להרדים את הנקבה על פי התנאים שאושרו על ידי מכוןועדת לאומיים לטיפול ושימוש בעלי חיים (ICCUA). מניחים במגש לנתח בשכונה זרימה למינרית. לרסס את הבטן של הנקבה עם אתנול 70%.
4. פתח את חלל הצפק ולהצמיד את הקירות למגש לנתח. להוציא את קרני הרחם כך שהיא נשענת בתוך חלל הצפק.
5. בזהירות לחתוך לפתוח את הקיר של קרן הרחם. בעזרת כף 20 מ"מ (כלים מדעיים פיין) בעדינות כדי להוציא את העובר בתוך שק החלמון מן השליה. עוברים מקום לתוך צלחת 100 מ"מ רקמת התרבות prefilled עם 10 מ"ל של סטרילית 1 X PBS שהיה שחומם מראש ב 2.2.
6. חזור על הפעולה עבור כל עוברי הנוכחי.

3. Electroporation של עוברים E11.5 (איור 1)

1. בעזרת כף 20 מ"מ, להעביר את העובר הראשון מנה 100 מ"מ חדש prefilled עם 10 מ"ל של 1XPBS סטריליים שהיה שחומם מראש ל 37 ° C.
2. השתמש מלקחיים 11 ס"מ עם קצה 0.05 0.02 מ"מ x (כלים מדעיים פיין) בזהירות מחדשלהעביר וזורקים שק החלמון.
3. עובר קבוצה, כך בצד הגב שלה פונה כלפי מעלה, כך שהוא דומה הקריקטורה באיור 1 א. השתמש 7 אלקטרודה מ"מ משוטים (הרווארד Apparatus) בעדינות כדי להחזיק את העובר. האלקטרודות יש למקם בכל צד של הצינור העצבי ברמה של החדר למוח האחורי 4. החדר נראה לעין בלתי מזוינת, אך באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה יכול להקל על מיקום ההנעה מדויקת. המיקום של המשוטים הוא קריטי בקביעת האזור שמקבל את ה-DNA electroporated. אם השפה התחתונה rhombic (LRL) למוח האחורי של העוברית הגב הוא הרצוי, משוטים חייב להיות מקום כזה שהם ישירות לאגף את החלק הרחב ביותר של פתיחת החדר 4.
4. השתמש מזרק 1 סמ"ק להכין את ה-DNA פלסמיד מעורבב עם ירוק מהיר 0.01%. 500 μL של התערובת צריך להיות מספיק electroporation של לפחות 8-10 עוברים (ראה 3.5).
5. בעדינות לנקב OV roofplateerlying החדר 4 עם מחט טוברקולין 25 גרם 5/8 מצורף מזרק 1 סמ"ק להזריק את התערובת-DNA צבע לתוך החדר. זריקות מוצלחות מתאפיינות תערובת ה-DNA צבע מילוי המערכת חדרית שלמה (איור 1 ג). כמות תערובת ה-DNA צבע מוזרק בדרך כלל הוא פחות מ 50 μL. הסכומים המדויקים משתנים בין העוברים כמו חלק תערובת נוטה לדלוף לתוך החדר של PBS המקיף את העובר. אמצעי חלופי של מתן תערובת ה-DNA צבע תהיה דרך גישה למערכת חדרית ידי ניקוב וילונות שמעל המוח התיכון. שוב, זריקות מוצלחות מתאפיינות תערובת ה-DNA צבע מילוי המערכת החדר כולו.
6. לספק חמש פולסים מרובעים באמצעות גנרטור חשמלי הדופק (BTX) ו -7 אלקטרודה משוטים מ"מ. כל פעימה הוא 50 V לאורך 5 ms לכל הדופק עם 500 מילישניות בין הדופק בכל. רקמת הקרוב האלקטרודה במטען חיובי תאפשר טאקה את הפלסמיד.

4. תרבות של עוברים

1. בשכונה זרימה למינרית, למלא את בארות החיצוניים של מנה של 12 גם בתרבות עם 2 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת השלימו עם סרום 10% שור עוברית, 5% סוסים סרום, גלוטמין 1%, 1% פניצילין / סטרפטומיצין שהיה שחומם מראש עד 37 ° C. התנאים תרבות הותאמו מ דה דייגו ועמיתיו. ¹⁵
2. ב זרימה למינרית מכסה המנוע עוברים שלוחץ הבטן (מתחת ללב) עם מלקחיים ולהסיר החלק האחורי של העובר. מניחים את החלק הקדמי לאחת הבארות המלאים של מנה של 12 גם בתרבות.
3. חזור על הפעולה עבור כל העוברים. למלא רק את בארות החיצוניים של הצלחת 12-היטב כדי למנוע זיהום של תרבויות.
4. תרבות עוברים ב 37 ° C חממה עם 5% CO _2. ביטוי של הפלסמיד electroporated יש הנצפה בתוך 24 שעות.
5. צריך עוד פעמים תרבות להיות הרצוי, למלא את הבארות מתוך צלחת 12 חדש היטב עם 2 מ"ל שלהתקשורת המשמשים 4.1. בעזרת כף להעביר את העוברים עיקור היטב בצלחת החדש. מניחים בחזרה 37 ° C חממה. תרבות של עד 48 שעות אפשרי.
6. כאשר זמן תרבות הרצוי הוא הגיע, לתקן עוברים לניתוח (ראה להלן).

5. אופן ההכנה של עוברים לניתוח

1. יש לשטוף עוברים 1 X PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור.
2. תקן עוברים לניתוח paraformaldehyde 2% (PFA) ב 1XPBS עבור 2 שעות 4 ° C.
3. יש לשטוף עוברים 1 X PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור.
4. לאזן עוברים סוכרוז 30% ב 1 X PBS לילה ב 4 ° C.
5. שבץ עוברים בטמפרטורה אופטימלית מתחם (אוקטובר) חיתוך באמצעות אמבט קרח יבש / אתנול. עוברים ניתן לאחסן ב -20 ° C.
6. סעיף עוברים על cryostat (לייקה) ל -30 חלקים מיקרומטר ו הר בשקופיות (VWR, Superfrost פלוס). חנות ב -20 ° C.

6. Immunohistochemistry ניתוח

1. אימונוהיסטוכימיה בוצע כמתואר ^16. דילולים נוגדנים ראשוניים המשמשים במחקר זה כוללים ארנב α-GFP (Invitrogen) 1:2500, עכבר α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100, ארנב α-Ngn1 (ג'יין ג'ונסון) 1:5000, ארנב α-Ptf1a (ג'יין ג'ונסון ) 1:2500, ארנב Math1 (ג'יין ג'ונסון) 1:100. דגירה שטוח שקופיות, לצד הדגימה על מגש מכתים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. שקופיות נותחו על מיקרוסקופ מתחם (אולימפוס BX51).

7. נציג תוצאות

סכמטית באיור 1 א 'מתאר את הניסוי electroporation. 1B איור מראה נוף sagittal העובר E11.5 לפני מניפולציה. העובר גם לאחר הזרקה של החטיבה פלסמיד המכיל :: GFP בירוק מהיר 0.01% מוצגת באיור 1 ג ו העובר שאינו מקובע נציג מציג GFP חד צדדיתביטוי התרבות למוח האחורי הגב 24 שעות הבאה מוצג איור 1D. היקף בתחום LRL כי הוא electroporated בהצלחה הוא משתנה נראה תלויה מאוד המיקום של האלקטרודות. במחקרים שלנו נמצא כי 52 מתוך 65 (80%) של עוברי electroporated בהצלחה לידי ביטוי ה-GFP. רקמת נחשב להיות electroporated בהצלחה אם זה היה חיובי GFP באזורים מקומיים על כמה סעיפים לאחר ניתוח קיבוע immunohistochemical (ראה להלן). העוברים שלא הצליחו לענות על הקריטריונים דורגו כמו ניסיונות לא מוצלחים ב electroporation.

הערכה נוספת של יעילות electroporation ניתן לוודא על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה נגד ה-GFP על חלקים רוחביים של עוברי electroporated ברמה של החדר 4. תרשים 2 מציג חלקים סדרתיים נציג מעובר הצגת חד צדדיתה-GFP. איור 2 א הביטוי מראה סכימטי אידיאלית כי זה ממחיש את הצד השמאלי של העובר היה לכיוון האלקטרודה החיובית. חלקים רוחביים (ברמות המיוצגים על ידי קריקטורה אמצע איור 2 א) לחשוף את הביטוי GFP מקומי אך ורק בצד שמאל של רקמת למוח האחורי (איורים 2 ג ו 2 ד). אזור electroporated של LRL לא להאריך את ציר כולו הקדמי, האחורי של הצינור העצבי כמו בחינת סעיפים 300 מיקרומטר מקורי או יותר לזה שמוצג באיור 2 ג אין אקספרס GFP (איור 2 ב).

השירות של assay זה מניפולציה של ביטוי גנים תלוי ביציבות של תחומים ביטוי חלבונים אנדוגניים. LRL התאפיינה כבעל תחומים אב ייחודיים המאופיינים ביטוי ההפרש של גורמי תעתוק proneural (נבדקה ב ^1).תת קבוצה של גורמים אלה (Mash1, Math1, Ngn1, ו Ptf1a) נבחרו לניתוח בשל ו המוצע / או תפקידים שאפיינו במפרט של תת עצביים precerebellar ב LRL, נושא למחקרים עתידיים ^16-18. כל ארבעה חלבונים יש תחומים הביטוי האופייניות ביותר ב למוח האחורי הזנב ב E11.5 ^16-18. הבחנו כי עוברים שהונחו תרבויות הצליחו להגדיל את שטחו וגם לא ליזום הייצור של האפיתל מקלעת דמית העין ו invagination של אירועים, LRL ו roofplate מורפולוגיים המתרחשים בין E11.5 ו E12.5 ^5. בהתבסס על תצפיות אלה נקבע כי התפתחות תקינה של עוברים אלה הופסק או עוכב גסה ואת השליטה להשוות את העוברים בתרבית צריך להיות עוברים שאין להם תרבות ב E11.5.

על מנת להבטיח כי תרבות electroporation לא להפריע רמות של חלבונים אנדוגניים, ניתחנו ארבעה חלבונים שונים על ידי immunohistochemistry (IHC) ב -34 עוברים שונים שהיו electroporated ותרבותיים אז עבור שעות לפחות 24. לוח מראה את מספר העוברים ניתוח לכל הסמן כל אחוז העוברים ניתחו כי שמר על רמות חלבון נורמלי. איור 3 מציג נציג IHC נתונים מ 2 חלבונים ניתחו, Mash1 (איורים 3 א ו 3 ב) ו Math1 (איורים 3C ו 3D). הבחנו כי רוב העוברים שמר רמות נורמליות של electroporation הביטוי הבא ותרבות (איורים 3 ב ו 3D) לעומת העוברים הבקרה E11.5 (איורים 3 א ו 3 ג). חשוב לציין, תחומים הביטוי האופייני של חלבונים אלה לא היו מוטרדים.

באיור 1. Electroporation העוברים על E11.5. () סכמטי של הelectroporation דואר הניסוי. העובר E11.5 מופרד ביטוי פלסמיד בירוק מהיר 0.01% מוזרק לתוך החדר הרביעי. העובר הוא מוקף מכן על ידי משוטים האלקטרודה נתון 50 V הדופק לפני שיוצבו בתרבות (ב ') צפו sagittal העובר E11.5 לפני ההזרקה. (ג) העובר באותו E11.5 בעקבות הזרקת פלסמיד בירוק מהיר 0.01%. (ד) ביטוי למוח האחורי חד צדדי של ה-GFP שנצפתה העובר E11.5 לאחר 24 שעות של תרבות. MB-המוח התיכון, 4V-4 החדר.

איור 2. הביטוי של ה-GFP של רקמות Electroporated. (א ') קריקטורה משמאל מתאר את המיקום של אלקטרודות סביב העובר E11.5. הקריקטורה מתארת ​​את ספיגת התיכון ולהביא לידי ביטוי את ה-GFP קידוד פלסמיד בצד השמאלי של העובר. בקריקטורה מימין הוא סכימטי של סעיף רוחבי האידיאלי לקחת את העובר על levels כונה על ידי קווים שחורים הקריקטורה התיכון. (ב-D) אימונוהיסטוכימיה של ה-GFP על חלקים רוחביים באמצעות העובר E11.5 electroporated לאחר 24 שעות של תרבות. החיצים מצביעים על (RP) roofplate אשר מלכודות נוגדנים משני. תמונות נלקחים בהגדלה 10X. הרמות היחסיות של הסעיפים המוצגים מתוארים על ידי הקווים האופקיים באמצעות קריקטורה התיכון (). MB-המוח התיכון, 4V-4 החדר אני, RP-roofplate.

איור 3. ביטוי של חלבונים אנדוגניים השפה Rhombic תחתון אימונוהיסטוכימיה עבור Mash1 (A ו-B) או Math1 (C ו-D) השוואת חלקים רוחביים של עוברי E11.5 שלא היו מתורבת (C) עם העוברים שהיו electroporated עם החטיבה.: : GFP ותרבותיים עבור שעה 24 (B ו-D). תמונות שצולמו בהגדלה של 10X.

לוח ט אחוז העוברים Electroporated ותרבותיים תמך רגיל Proneural גורם שעתוק דומיינים ב LRL.

בטכניקה electroporation במבחנה הציג במחקר זה היא מתודולוגיה חדשנית יכול להיות מנוצל ביעילות לתמרן ביטוי גנים העוברים מתחת לגיל 12 ימים של הריון. המיקום של העוברים לתוך תרבות מאפשרת ביטוי של גן הציג עוקף הקטלניות נצפתה כאשר עוברים electroporated מותר להישאר in vivo. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים עובריים אבות שהיו נגישים בעבר עבור electroporation מבוססי מחקרים.

הטכניקה electroporation הביא ביטוי יעיל של הגן לראשונה ב 80% עוברים את ניתוח. צפו באיור 2 מידת רקמת electroporated הוא מקומי לאזורים נפרדים. על מנת ממוקדת באזור למוח האחורי במיוחד electroporation האלקטרודות יש הניח בזהירות כמו מושל זה את המיקום שלffected רקמות. אם השפה התחתונה של rhombic למוח האחורי עובריים הגב הוא הרצוי, משוטים חייב להיות מקום כזה שהם ישירות לאגף את החלק הרחב ביותר של פתיחת החדר 4. אם הביטוי החד צדדית בצד אחד של הצינור העצבי הוא הרצוי ואז העובר צריך להיות ממוקם בין אלקטרודות כאלה ציר הצינור העצבי מקבילה במשוטים. הטיה של העובר יכול לגרום מיקוד לא תקין ו / או ביטוי בין שתי המדינות. לצורך מיטוב כדי להשיג יעילות טובה יותר electroporation אפשר לשנות את מתח electroporation שכן הדבר עלול להגדיל את חלקם של התאים ספיגת ה-DNA electroporated. אפשר גם להמשיך לרכז את מניות ה-DNA. כמו בצינור העצבי יכול להכיל נפח קטן של נוזל, דגימות מרוכזים יותר יש להגדיל את כמות הפלסמיד מוחדר לתאים על electroporation. לבסוף, אפשר לשנות את הקוטר של המשוטים. אם רוצים למקד קטןד באזור מקומי יותר זה יכול להיות הטוב ביותר כדי להקטין את גודל ההנעה.

חיוני השירות של טכניקה זו על ביטוי גנים מניפולציה למוח האחורי הוא השמירה של הגן הנורמלי וביטוי דפוסי חלבון לאחר electroporation והתרבות של עוברים. כפי שתועד באיור 3 ו לוח, רגילים proneural גורם שעתוק רמות ודפוסי נשמרות גם 83% עוברים ניתחו הביע Mash1, 86% הביעו Math1, ו 100% הביעו Ptf1a. רמות Ngn1 לא כמו שמר וחסונה (71%) כמו גורמי תעתוק אחרים ושם ישקלו לו ויעריכו. אמנם יתכן כי זה גורם שעתוק מסוים מושפעת לרעה בהליך electroporation ותרבות אנו מאמינים כי קיים הסבר חלופי. הוכח כי Ngn1 ביטוי למוח האחורי הגב פוחתת עם הזמן, עם רמות נעלמים ביום העוברי (ה ') 12.5 ^16. בהתחשב בכך עמ 'ercentage של עוברים המבטאים Ngn1 נמוך יותר מאשר אלו שמירה על ביטוי נורמלי של חלבונים אחרים שהוערכו (83% ומעלה) אפשר כי לפחות חלק של 30% עוברים, כי הם ביטוי חסר של Ngn1 הגב התקדמו ב תוכנית התפתחותי נורמלי, כיבוי Ngn1 ביטוי 24 שעות לאחר הקציר ב E11.5 והשמה בתרבות. הדבר מצביע על השינויים המולקולריים המתרחשים למוח האחורי הגבי בין E11.5 ו E12.5 עלול לגרום בחלק של עוברים, אך עושה זאת על מסגרת הזמן אסינכרוני או מאוחרת. ממצא זה ראוי לניתוח נוסף במחקרים עתידיים, אך לא לצמצם את ההתלהבות assay זה. האפשרות עוברים אולי עובר שינויים מולקולריים המתרחשים במהלך התפתחות נורמלית צריך גם להודיע ​​כמה תוצאות של מחקרים העושים שימוש בטכניקה זו מפורשים.

וריאציות על electroporation אופטימיזציה ותנאי תרבות מוצגים ההוא מחקר אפשריים. נמצא כי 50 V נתן ספיגת החזקה של הגן electroporated עם הפרעה מינימלית על שלמות רקמות. מתח עבור electroporations אפשר לשנות כדי לכוונן את assay לצרכים הנסיין של הפרט. התנאים היו אופטימיזציה תרבות בעוברים שהונחו ישירות על הצלחת 12 גם בתרבות המדיה (כמתואר לעיל). טכניקה זו ניתן לשנות על ידי הצבת את העובר על גבי הממברנה (שחקן המשנה), אשר מכניסים את התקשורת של צלחת של 12 באר. במהלך אופטימיזציה של טכניקת culturing וריאציה זה היה ניסיון אבל זה לא נראה להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניסוי או על ביטוי גנים electroporated או שימור של דפוסי ביטוי גנים רגילים.

מחקר זה התמקד עוברים culturing למשך 24 שעות. עוברים כבר בתרבית עד 48 שעות עם התקשורת להשתנות ב 24 שעות. נמצא כי על שלמות רקמות ירד עם רבפעמים אה דגירה אלא ביטוי של GFP electroporated ניתן היה לזהות. על פי דגירה ארוכה יותר (HR בעבר 48) זה יכול להיות שינוי תנאי הכרחי תרבות צפויה להיות נושא חקירות עתידיות.

במהלך אופטימיזציה של תרבות assay נמצא כי השמירה על ביטוי גנים אנדוגניים שיפור עוברי כי היה חשיפה גדולה יותר של הצינור העצבי לסביבה התקשורת. במחקרים אלה זה הושג על ידי ניקור של roofplate החדר 4 ^ה ורקמות הסרת מיותר בחלק הזנב של העובר ערב ההנפקה בתרבות. מחקרים עתידיים תחקור אם בצינור העצבי microdissected יכול להיות מתורבת בהצלחה בתנאים אלה.

מחקר זה התמקד electroporation העוברים על 11.5 ימים של הריון (E11.5). הכיוון העתידי יהיה לייעל טכניקה בשלבים מוקדמים של פיתוח. השתמשנו בטכניקה זו בעובריםשנקטפו על E10.5 ואם אנחנו עדיין לא מצטברים לנתח מספר גדול של עוברים ראינו הצלחה מציגה את ה-GFP ו culturing העוברים. יותר מחקר נוסף עומק יהיה צורך לומר בוודאות כי טכניקה המשמשת במחקר זה יכול להיות מיושם על עוברים צעירים. זה יכול להיות אפשרי electroporate עוברים מתחת לגיל E10.5 אבל זה לא היה ניסיון.

יישום פונקציונלי של טכניקה זו יכולה להיות overexpress או להפיל את הפונקציה של הגנים כדי לבדוק אם מוצרי חלבון שלהם הם קריטיים לייצור תת עצביים שונים LRL. בניסויים עתידיים בעזרת טכניקה זו יתמקד כניסתה של גורמי תעתוק proneural לשנות את גורלם של subypes עצביים שונים ידועים להיות מיוצר מ LRL ב E11.5. הטכניקה יכולה גם להיות מותאם למקד לאזורים neuroepithelial אחרים באופן פעיל בייצור נוירונים ב E11.5.