En électroporation in vitro de la lèvre inférieure rhombique d'embryons de souris Midgestation

1. La préparation avant l'électroporation

1. Amplifier l'ADN pour l'électroporation par une préparation maxi (Prime-It ou Qiagen). La concentration de l'ADN doit être au minimum de 1 mg / mL pour une absorption efficace.
2. Retirer 495 uL d'ADN et mélanger avec 5 pi de Green Fast 0,01% dans du 1 x PBS (tampon phosphate salin) dans un microtube.

2. Récolte embryonnaire

1. Établir accouplements chronométrés de souris CD-1 (Harlan). Vérifier la présence de bouchons vaginaux et considérer la date un bouchon vaginal est observé comme le jour embryonnaire (E) 0,5. Les embryons seront récoltés 11 jours après la visualisation fiche (E11.5).
2. Placez les outils stérilisés dans de l'éthanol 70%. Traiter une hotte à écoulement laminaire avec une lumière UV pendant au moins une heure avant l'utilisation. Capote de roof, bac de dissection, et la dissection étendue à l'éthanol 70%. Pré-chauffer 1 X PBS à 37 ° C.
3. Sur E11.5 euthanasier la femelle à des conditions agréées par l'InstitutComité ional pour le soin et l'utilisation des animaux (ICCUA). Placer le plateau de dissection dans la hotte à flux laminaire. Vaporiser vers le bas de l'abdomen de la femelle avec de l'éthanol 70%.
4. Ouvrez la cavité péritonéale et épinglez les murs sur le plateau de dissection. Tirez sur les cornes utérines afin qu'il repose dans la cavité péritonéale.
5. Découper soigneusement la paroi de la corne utérine. Utilisez une cuillère 20 mm (Beaux-outils scientifiques) pour enlever délicatement l'embryon dans le sac vitellin loin de la barrière placentaire. Embryons déposer dans un plat de 100 mm de culture de tissus pré-remplie avec 10 ml de PBS stérile 1 X qui a été préchauffé à la section 2.2.
6. Répétez l'opération pour tous les embryons présents.

3. Électroporation d'embryons E11.5 (Figure 1)

1. Avec une cuillère 20 mm, transfert de l'embryon d'abord à un nouveau 100 mm plat pré-remplie avec 10 ml de 1XPBS stériles qui a été préchauffé à 37 ° C.
2. Utilisez une pince 11 cm avec une pointe de 0,05 x mm 0,02 (Beaux-outils scientifiques) à réexaminer avec soindéplacer et jeter le sac vitellin.
3. Embryon position de telle sorte que sa face dorsale est tournée vers le haut afin qu'il ressemble à la bande dessinée dans la figure 1A. Utilisez 7 palettes d'électrodes mm (Harvard Apparatus) pour tenir doucement l'embryon. Les électrodes doivent être positionnés de chaque côté du tube neural au niveau du ventricule rhombencéphale quatrième. Le ventricule est visible à l'œil nu mais en utilisant un microscope à dissection peut faciliter le placement pagaie précis. Positionnement des palettes est essentiel pour déterminer la région qui reçoit l'ADN électroporé. Si la lèvre inférieure rhombique (LRL) du cerveau postérieur dorsal embryonnaire est souhaitée, pagaies doivent être lieu de telle sorte qu'ils sont directement flanquant la partie la plus large de l'ouverture du quatrième ventricule.
4. Utilisez une seringue de 1 cc de dresser l'ADN plasmidique mélangé avec Green Fast 0,01%. 500 ul du mélange doit être suffisante pour l'électroporation d'au moins 8-10 embryons (voir 3.5).
5. Délicatement percer la ov roofplateerlying quatrième ventricule avec une aiguille tuberculine 25G 5/8 fixée à la seringue 1 cc et injecter le mélange d'ADN-colorant dans le ventricule. Injections retenus sont caractérisés par le mélange d'ADN-colorant de remplissage du système ventriculaire ensemble (figure 1C). La quantité d'ADN de colorant mélange généralement injecté est inférieure à 50 pL. Montants exactes sont variables entre les embryons en tant que partie du mélange a tendance à s'écouler du ventricule dans le PBS entourant l'embryon. Un autre moyen de fournir le mélange d'ADN de colorant serait en accédant au système ventriculaire par ponction du voile recouvrant le mésencéphale. À nouveau, les injections sont retenus caractérisé par le mélange d'ADN-colorant de remplissage du système ventriculaire ensemble.
6. Donner cinq impulsions carrées en utilisant un générateur d'impulsions électriques (BTX) et 7 palettes d'électrodes mm. Chaque impulsion est de 50 V durable 5 ms par impulsion avec 500 ms entre chaque impulsion. Le tissu le plus proche de l'électrode chargée positivement sera alors take le plasmide.

4. Culture des embryons

1. Dans une hotte à flux laminaire, remplir les puits extérieurs d'une boîte de culture de 12 puits avec 2 ml de DMEM/F12 des milieux supplémentés avec 10% de sérum de veau foetal, 5% de sérum équin, de la glutamine à 1%, 1% de pénicilline / streptomycine qui a été préchauffé à 37 ° C. Les conditions de culture ont été adaptés à partir de Diego et ses collègues ^15.
2. Dans les embryons de flux laminaire hotte à pincée section médiane (ci-dessous du cœur) avec une pince et retirer la partie postérieure de l'embryon. Placer la partie antérieure dans l'une des puits rempli de la boîte de culture à 12 puits.
3. Répétez l'opération pour tous les embryons. Remplissez seulement les puits extérieurs de la plaque à 12 puits pour éviter la contamination des cultures.
4. Culture d'embryons dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2. Expression du plasmide électroporé devrait être observable dans les 24 heures.
5. Si plus temps de culture désirer, remplir les puits sur un nouveau plateau 12 et avec 2 ml deles médias utilisés dans 4.1. Avec une cuillère stérilisée transférer les embryons à un puits dans la nouvelle plaque. Remettre dans l'incubateur à 37 ° C. Culture pour un maximum de 48 heures est possible.
6. Lorsque le temps de culture désirée est atteinte, fixer des embryons pour l'analyse (voir ci-dessous).

5. Préparation d'embryons pour l'analyse

1. Rincer embryons en 1 X PBS à 4 ° C pendant cinq minutes. Répéter.
2. Fixer embryons pour l'analyse de paraformaldéhyde 2% (PFA) dans 1XPBS pendant 2 heures à 4 ° C.
3. Rincer embryons en 1 X PBS à 4 ° C pendant cinq minutes. Répéter.
4. Equilibrer embryons de saccharose à 30% en 1 X PBS pendant une nuit à 4 ° C.
5. Intégrer les embryons in Température de coupe optimale (PTOM) composé en utilisant un sèche glace / éthanol bain. Les embryons peuvent être conservés à -20 ° C.
6. Section embryons sur un cryostat (Leica) dans 30 sections um et monter sur des lames (VWR, Superfrost Plus). Conserver à -20 ° C.

6. ImmuAnalyse nohistochemistry

1. L'immunohistochimie a été réalisée comme décrit dans ^16. Dilutions d'anticorps primaires utilisés pour cette étude comprennent lapin α-GFP (Invitrogen) 1:2500; souris α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; lapin α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000, lapin α-Ptf1a (Jane Johnson ) 1:2500; lapin Math1 (Jane Johnson) 1:100. Incuber diapositive côté plat spécimen, sur un plateau de coloration à 4 ° C pendant la nuit.
2. Les lames ont été analysées sur un microscope composé (Olympus BX51).

7. Les résultats représentatifs

Un schéma de la figure 1A représente l'expérience d'électroporation. Figure 1B montre une vue sagittale d'un embryon E11.5 avant la manipulation. Le même embryon après injection de l'ACG plasmide contenant :: GFP dans Green Fast 0,01% est illustré à la figure 1C et un embryon présentant représentant non fixée GFP unilatéraleexpression dans le rhombencéphale culture de 24 h dorsale suivante est affichée dans la figure 1D. L'étendue de la zone de la LRL qui est avec succès par électroporation est variable et semble être très dépendante sur le positionnement des électrodes. Dans nos études, il a été constaté que 52 des 65 (80%) des embryons électroporées exprimé avec succès la GFP. Le tissu a été réputé être avec succès par électroporation si elle a été positive pour la GFP dans des régions localisées sur plusieurs sections après la fixation et l'analyse immunohistochimique (voir ci-dessous). Les embryons qui ne répondaient pas aux critères ont été marqués ce que les tentatives infructueuses de l'électroporation.

Une évaluation plus poussée de l'efficacité d'électroporation peut être déterminée en effectuant immunohistochimie contre la GFP sur des coupes transversales d'embryons électroporées au niveau du quatrième ventricule. La figure 2 montre représentatives des coupes sériées de l'embryon affichage unilatéraleExpression de la GFP. La figure 2A montre un schéma idéalisé qui illustre que le côté gauche de l'embryon était vers l'électrode positive. Les sections transversales (à des niveaux représentés par le dessin animé milieu de la figure 2A) révèlent expression de la GFP localisée exclusivement sur ​​le côté gauche du tissu du cerveau postérieur (Figures 2C et 2D). La zone de l'électroporation LRL ne s'étend pas l'ensemble axe antéro-postérieur du tube neural que l'examen des articles 300 um rostrales ou supérieure à celle montrée à la figure 2C ne expriment la GFP (figure 2B).

L'utilité de cet essai pour la manipulation de l'expression génique est dépendante de la stabilité des domaines d'expression pour les protéines endogènes. Le LRL a été caractérisé comme possédant domaines progénitrices unique caractérisé par l'expression différentielle des facteurs de transcription proneural (revue dans ^1).Un sous-ensemble de ces facteurs (Mash1, Math1, Ngn1, et Ptf1a) ont été choisis pour l'analyse en raison de leur projet et / ou des rôles caractérisés dans la spécification des sous-types de neurones précérébelleux dans le LRL, un objet d'études futures ^16-18. Tous les quatre protéines ont des domaines d'expression très caractéristiques dans le cerveau postérieur caudale à E11.5 ^16-18. Nous avons observé que les embryons qui ont été placés cultures n'a pas augmenté en taille et en a également omis de lancer la production de l'épithélium du plexus choroïde et l'invagination des LRL et roofplate, des événements morphologiques qui se produisent entre E11.5 E12.5 et ^5. Sur la base de ces observations, il a été déterminé que le développement normal de ces embryons a été interrompue ou retardée grossièrement et le contrôle comparable pour les embryons cultivés devrait être embryons incultes à E11.5.

Pour veiller à ce que la culture et l'électroporation ne pas déranger les niveaux de protéines endogènes, nous avons analysé quatre protéines différentes par immunohistochemistry (IHC) dans 34 embryons différents qui ont été électroporés puis cultivées pendant au moins 24 heures. Le tableau I montre le nombre d'embryons analysés pour chaque marqueur et le pourcentage des embryons analysés qui ont conservé des taux de protéines normales. La figure 3 montre les données représentant IHC de deux des protéines analysées, Mash1 (figures 3A et 3B) et Math1 (figures 3C et 3D). Nous avons observé que la majorité des embryons conservés des niveaux normaux d'expression à la suite d'électroporation et la culture (figures 3B et 3D) par rapport aux embryons de contrôle à E11.5 (figures 3A et 3C). Fait important, les domaines d'expression caractéristiques de ces protéines ne sont pas perturbés.

Figure 1. Électroporation d'embryons à E11.5. (A) Schéma d'eexpérience électroporation e. Un embryon E11.5 est isolé et le plasmide d'expression dans le vert rapide 0,01% est injecté dans le quatrième ventricule. L'embryon est ensuite flanqué par des palettes d'électrodes et soumis à une impulsion de 50 V avant d'être placé dans la culture (B) Coupe sagittale d'un embryon E11.5 avant l'injection. (C) Le même embryon E11.5 suite à l'injection de plasmide dans Green Fast 0,01%. (D) l'expression unilatérale de la GFP rhombencéphale observée dans l'embryon E11.5 après 24 h de la culture. mb-mésencéphale; 4v-quatrième ventricule.

Figure 2. Expression de la GFP dans les tissus électroporé. (A) La bande dessinée sur la gauche représente le placement des électrodes autour d'un embryon E11.5. Moyen dessin représente l'absorption et l'expression de plasmide codant la GFP sur le côté gauche de l'embryon. Caricature sur le droit est schématique d'une section transversale prise à travers idéalisée de l'embryon à lES NIVEAUX notée par des lignes noires dans la bande dessinée du milieu. (B-D) immunohistochimie pour la GFP sur des coupes transversales à travers un embryon électroporé E11.5 après 24 h de la culture. Les flèches indiquent la roofplate (rp) qui piège l'anticorps secondaire. Les images sont prises à un grossissement de 10X. Les niveaux relatifs des sections indiquées sont représentés par les lignes horizontales par le biais du dessin animé du milieu dans (A). mb-mésencéphale; l 4v-quatrième ventricule; rp-roofplate.

Figure 3. Expression de protéines endogènes dans la lèvre inférieure rhombique immunohistochimie pour Mash1 (A et B) ou Math1 (C et D) en comparant des coupes transversales d'embryons E11.5 qui n'étaient pas cultivées (A, C) avec des embryons qui ont été électroporés avec l'ACG.: : GFP et cultivé pendant 24 heures (B et D). Images prises à un grossissement de 10X.

Tableau I. Pourcentage d'embryons et d'élevage de soutènement électroporées normales Proneural Domaines facteur de transcription dans le LRL.

La technique d'électroporation in vitro dans présentés dans cette étude est une nouvelle méthodologie qui peut être efficacement utilisée pour manipuler l'expression des gènes dans les embryons de moins de 12 jours de gestation. Placement des embryons dans la culture permet l'expression du gène introduit et contourne la létalité observée lorsque les embryons électroporées sont autorisés à rester in vivo. Cette technique permet pour la manipulation de l'expression des gènes dans les progéniteurs embryonnaires qui étaient auparavant inaccessibles pour l'électroporation études basées sur.

La technique d'électroporation conduit à une expression efficace du gène introduit dans 80% des embryons analysés. Comme l'a observé dans la figure 2 dans la mesure du tissu électroporé est localisée dans les régions discrètes. Afin de cibler spécifiquement une région du cerveau postérieur notamment pour l'électroporation des électrodes doit être soigneusement placés mesure où il régit l'emplacement d'unffected tissu. Si la lèvre inférieure en losange du cerveau postérieur dorsal embryonnaire est souhaitée, pagaies doivent être lieu de telle sorte qu'ils sont directement flanquant la partie la plus large de l'ouverture du quatrième ventricule. Si expression unilatérale d'un côté du tube neural est désiré, puis l'embryon a besoin d'être positionné entre les électrodes de telle sorte que l'axe du tube neural est parallèle aux palettes. Le basculement de l'embryon peut se traduire par un ciblage inapproprié et / ou l'expression bilatérale. En optimisant pour atteindre une meilleure efficacité d'électroporation on pourrait faire varier la tension d'électroporation, car cela pourrait augmenter la proportion de cellules que l'absorption de l'ADN électroporé. On pourrait aussi concentrer davantage les stocks d'ADN. Comme le tube neural ne peut accueillir qu'un petit volume de liquide, les échantillons plus concentrés devrait augmenter la quantité de plasmide introduit dans les cellules lors de l'électroporation. Enfin, on pourrait modifier le diamètre des pales. Si l'on veut cibler un plus petit unerégion d plus localisée il pourrait être préférable de réduire la taille pagaie.

Critique de l'utilité de cette technique dans la manipulation de l'expression des gènes du cerveau postérieur est le maintien de gène normal et les modes d'expression de protéines à la suite d'électroporation et la culture d'embryons. Comme indiqué dans la figure 3 et tableau I, normales proneural niveaux de facteurs de transcription et les modèles sont bien conservés 83% des embryons analysés exprimé Mash1, 86% ont exprimé Math1, et 100% ont exprimé Ptf1a. Les niveaux de Ngn1 n'ont pas été aussi forte retenu (71%) que les autres facteurs de transcription dosés. Bien qu'il soit possible que ce facteur de transcription particulier est affecté par la procédure d'électroporation et la culture nous croyons qu'il ya une autre explication. Il a été montré que l'expression Ngn1 dans le cerveau postérieur dorsal diminue au fil du temps, avec des niveaux de disparition par jour embryonnaire (E) 12.5 ^16. Étant donné que la pourcentage d'embryons exprimant Ngn1 est inférieur à ceux en conservant l'expression normale pour les autres protéines évalués (83% ou plus), il est possible qu'au moins une partie des 30% des embryons qui sont déficientes dans l'expression de Ngn1 dorsales ont progressé dans le normale programme de développement, d'éteindre l'expression Ngn1 24 h après la récolte à E11.5 et le placement dans la culture. Ceci suggère que les changements moléculaires qui se produisent dans le cerveau postérieur dorsal entre E11.5 E12.5 et pourrait se produire dans une partie des embryons, mais le fait sur un laps de temps asynchrone ou différée. Cette constatation mérite une analyse plus loin dans les études futures, mais ne diminue pas l'enthousiasme pour ce dosage. La possibilité que les embryons pourraient subir des changements moléculaires qui se produisent pendant le développement normal devrait également informer comment les résultats des études utilisant cette technique sont interprétés.

Variations à l'électroporation optimisé et les conditions de culture présentée dans eest l'étude sont possibles. Il a été constaté que 50 V a donné une absorption robuste du gène électroporé avec une perturbation minimale de l'intégrité des tissus. La tension pour les électroporations peuvent être modifiés afin d'affiner cette analyse aux besoins de l'expérimentateur individu. Les conditions de culture ont été optimisés sur les embryons qui ont été placés directement dans la culture des médias (décrit ci-dessus) dans une plaque à 12 puits. Cette technique peut être modifié en plaçant l'embryon sur une membrane (Costar) qui est placé dans les médias d'une plaque de 12 puits. Lors de l'optimisation de la technique de culture de cette variation a été tentée, mais il ne semble pas affecter de manière significative les résultats expérimentaux, soit dans l'expression des gènes électroporé ou le maintien de l'expression des gènes normaux.

Cette étude a porté sur les embryons en culture pendant 24 heures. Les embryons ont été cultivés pendant jusqu'à 48 heures avec les médias en cours de modification à 24 h. Il a été constaté que l'intégrité du tissu diminué à longtemps d'incubation Er, cependant, l'expression de la GFP électroporé n'a pu être détectée. Pour des temps d'incubation plus longues (au cours des 48 heures), il pourrait être nécessaire, modifiez les conditions de culture et sera probablement l'objet d'enquêtes futures.

Lors de l'optimisation de la culture du dosage il a été constaté que la rétention d'expression du gène endogène améliorée dans les embryons qui ont une plus grande exposition du tube neural à l'environnement médiatique. Dans ces études, cela a été réalisé par ponction de la roofplate ventricule 4 ^e et de prélèvement de tissu étrangers dans la partie caudale de l'embryon avant son placement dans la culture. De futures études vérifier si microdisséquées du tube neural peuvent être cultivées avec succès dans ces conditions.

Cette étude a porté sur l'électroporation d'embryons à 11,5 jours de gestation (E11.5). Une orientation future serait d'optimiser la technique pour les stades de développement précoces. Nous avons utilisé cette technique sur les embryonsrécoltés à E10.5 et alors que nous avons encore d'accumuler et d'analyser un nombre important d'embryons, nous avons vu le succès dans l'introduction de la GFP et la culture des embryons. Une étude plus approfondie serait en outre nécessaire de dire avec certitude que la technique utilisée dans cette étude pourrait être appliquée aux jeunes embryons. Il pourrait être possible de électroporer embryons de moins de E10.5 mais il n'a pas été tenté.

Une application fonctionnelle de cette technique pourrait être à surexprimer ou renverser la fonction des gènes à étudier si leurs produits protéiques sont essentiels à la production de différents sous-types de neurones de la LRL. Les expériences futures avec cette technique se concentrera sur l'introduction de facteurs de transcription proneural de modifier le sort des différents neurones subypes connus pour être produite à partir de la Fmin à E11.5. La technique pourrait également être adaptée pour cibler d'autres régions qui sont activement neuroépithéliales produire des neurones à E11.5.