定向分化诱导性多潜能干细胞向T淋巴细胞

1。细胞培养

1. 制备辐照SNL76 / 7（irSNL76 / 7）饲养层细胞培养。
   SNL76 / 7细胞一般都保持在10％胎牛血清（FBS），杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基）媒体。
   1. 培养皿或瓶，将涂有0.1％的明胶溶液在37°C，30分钟孵化器前恢复SNL76 / 7细胞从液氮。
   2. 达到汇合SNL76 / 7细胞时，细胞就会被胰酶消化，离心5分钟在400Ğ和悬浮在新鲜的媒体。
   3. 悬浮SNL76 / 7细胞，将在5000拉德的剂量照射^钴 -60辐照。
      另一种方法，SNL76 / 7细胞可代替小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和丝裂霉素灭活可以取代照射。
   4. 照射后，细胞将在5分钟的400Ğ离心，并在10％二甲基亚砜（DMSO）胎牛血清冻结缓冲区，分装成悬浮冷冻管，并在将来使用液氮保存。
2. OP9-DL1的细胞在体外分化的制备。
   OP9-DL1的细胞一般将保持在20％胎牛血清的α-最低限度的基本培养基（α-MEM）的媒体。当他们到达汇合细胞将被分割在1:5稀释。
3. 的E.G7胸腺瘤细胞的制备。
   E.G7胸腺瘤细胞一般将保持在10％FBS的罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI）-1640媒体。当他们到达汇合，细胞将被分割在1:10稀释。
4. IPS和一般维修的TCR转iPS细胞。
   1. 培养皿，在37℃，30分钟前播种irSNL76 / 7饲养层细胞或iPS细胞恢复分裂提前一天将涂以0.1％的明胶溶液。
   2. 为iPS细胞分裂，细胞将胰酶消化，离心400Ğ5分钟和15％FBS DMEM培养基悬浮。
   3. 胰酶消化的iPS细胞将孵育30分钟，上一个新的培养皿在37°C间孵化器前播种新鲜irSNL76 / 7馈线细胞覆膜菜排除分化的细胞及残渣饲养层细胞上。
   4. 孵化后，将4×10 ⁶细胞接种在一个100mm的培养皿。

（2） 在体外编程

1. 在体外培养系统。
   1. 0天，5X10 ⁴ iPS细胞将一个100mm的文化菜中含有20％胎牛血清的α-MEM的媒体合流OP9-DL1的单层细胞接种。
   2. 在第3天，文化传媒，将新鲜的改变。
   3. 1. 在第5天，细胞就会被胰酶消化和400Ğ离心5分钟，前30分钟，在37°C间孵化器孵化上一个新的100毫米培养皿。
      2. 悬浮细胞，将收集和计算，5×10 ⁵细胞将被转移到一个新的文化菜中含有20％胎牛血清的α-MEM的媒体合流OP9-DL1的细胞单层。细胞因子mFlt-3L（终浓度：5毫微克/毫升）将被添加在文化。
   4. 1. 在第8天，松散连接的细胞会被轻轻吸取下来。
      2. 洗OP9-DL1的饲养层，10毫升的PBS更多的时间来得到最大恢复部分分化的iPS细胞。
      3. 收获后共培养的细胞，将细胞离心5分钟在400Ğ和悬浮于20％胎牛血清的α-MEM的媒体为辅mFlt-3L（5毫微克/毫升）和MIL-7（1毫微克/毫升）。
      4. 细胞将被转入6孔培养板涂有合流OP9-DL1的细胞。通常从一个100毫米的培养皿中恢复的iPS细胞将被转移到一个6孔板。
   5. 1. 从第10天，文化传媒将改变隔日（20％FBS的α-MEM的媒体supplemente与mFlt-3L（5毫微克/毫升）和MIL-7（1毫微克/毫升））。
      2. 培养板涂有接驳OP9​​-DL1的细胞将在4-6天改变取决于饲养层细胞的生长。
2. 在体内的iPS细胞部分分化成熟。
   1. iPS细胞共培养第22天，将关闭胰酶消化，离心5分钟，在400Ğ在37℃上一个新的培养皿中培养30分钟。
   2. 将收集悬浮细胞，通过70微米尼龙过滤器通过排除这可能会导致肺栓塞小鼠的细胞团块和冷PBS洗三次。
   3. 1.5×10 ⁷细胞/毫升的浓度，细胞就会悬浮在PBS。
   4. 细胞将保持在注射前的冰。
   5. 四，通过尾静脉注射之前，老鼠将被置于下的红外光，其尾静脉扩张。
   6. 经过静脉ð转移到4周龄通过尾静脉B6.129S7 RAG1 ^tm1Mom / J小鼠的ilatation，200μL细胞悬液或3X10 ^6个细胞，将继。三个星期被允许在部分分化的iPS细胞的体外成熟。
3. 评价。
   1. 分化的细胞和细胞回收率。 图1的形态学变化。
      1. OP9-DL1的细胞共培养不同天，将采取传统的显微镜下活细胞图片。
      2. 将细胞复苏率计算的基础上，从文化收获的细胞数量。
   2. 流式细胞仪分析表面标志的变化。 图2a。
      1. 在不同天的共培养，细胞将被删除从文化胰蛋白酶，用冷PBS洗，然后进行细胞表面染色。
      2. 在染色机智不同的荧光标记的抗体，细胞就会被封锁在4℃，20分钟的Fc受体阻滞剂24G2。
      3. 20分钟后，染色在4°C时，细胞​​就会被冷PBS洗涤流式细胞仪检查前的三倍。
   3. iPS细胞在体外分化。 图2b激活。
      1. 激活检测的前一天，预涂与抗CD3的（终浓度：4μg/ mL的PBS中）24孔板，在4°C过夜。
      2. 共培养22天，iPS细胞的T细胞将收获从文化，用冷PBS洗前用板涂层的抗CD3和可溶性抗CD28抗体（终浓度为4微克/毫升）刺激。
      3. 孵化器将进行_{37℃，5％CO2}培养箱40小时，然后Befeldin将被添加到文化，另外4个小时。
      4. 在年底共培养，细胞就会HAR既得利益，洗净，如上所述的Fc受体阻滞剂阻断。 CD8和TCRVβ链的表面标志，使用荧光标记的抗体将阻止细胞染色。
      5. 细胞表面染色后，细胞将用4％甲醛固定，并通过使用Biolegend的透套件透。
      6. 通透性后，将通过使用荧光标记的抗体染色，如IL-2和IFN-γ的细胞内分子。
      7. 前最后流式细胞仪检测，细胞将在冷PBS洗涤三次，以排除过量的抗体。
   4. 在RAG-/ -小鼠的成熟。
      1. 从小鼠，经过三个星期在体内发育，RAG-/ -小鼠会被牺牲，脾和淋巴结肿大，将被删除。
      2. 将单个细胞通过机械故障处理。将使用ACK裂解液和裂解红细胞mononucleocytes将收集和冷PBS洗两次。
      3. 洗净后，将被阻止细胞的Fc受体阻滞剂24G2在4℃，20分钟和在阻塞年底，将用不同的荧光标记的抗CD3，抗CD4，抗CD8和反TCRβ抗体染色细胞4°C 20分钟。
      4. 在染色结束时，细胞就会被冷PBS洗涤，流式细胞仪检查前的三倍。

3。 在体内编程

1. 代逆转录病毒结构。
   1. MSCV-IRES-DsRed的（MiDR）载体MSCV-IRES-GFP载体的基础上，构造代DsRed基因与绿色荧光蛋白基因。
   2. OT-T细胞受体基因的克隆，使OT-I/MiDR建设到在Midr的载体。
2. 逆转录病毒转导和细胞分选。
   1. 开发平台-E的包装细胞ARE中生成假病毒，将用于以下传导。
      1. 3X10 ⁶开发平台-E细胞接种于100毫米培养皿转染前一天。
   2. 第0天，开发平台-E的细胞，将转加时赛，我MiDR使用GeneJamma转染试剂质粒。
   3. 第1天，1×10 ⁶ iPS细胞将被接种到0.1％的明胶的预涂24孔板。
   4. 1. 第2天，假病毒含有从开发平台-E的文化上清将被收集并通过0.4微米过滤器，以排除潜在的污染物。
      2. 将于32°ç离心机的条件下进行转1小时5微克/毫升凝聚胺的存在，在1400转。
      3. 经过离心机的转导，细胞将被放置在32°C时，晚上_5％CO2培养箱。
   5. 第3天，重复的第2天TRA如上所述nsduction程序。 6孔板将预涂irSNL76 / 7饲养层细胞，以供将来使用。
   6. 第4天，转iPS细胞将胰酶消化，离心5分钟为400克，播种覆膜irSNL76 / 7饲养层细胞。
   7. 在汇合，细胞将被胰酶消化，离心5分钟，在400Ğ和细胞分选处理。将GFP和DsRed的双阳性细胞排序由MoFlo细胞分选仪。排序将irSNL76 / 7饲养层细胞培养细胞，以供将来使用。
3. 继转移和肿瘤的挑战。
   OT-我的TCR转IPS（OT-I/iPS）细胞通常保持在irSNL76 / 7饲养层细胞，如上所述。
   1. 继转移的一天，OT-I/iPS细胞是胰酶消化，离心5分钟，在400Ğ悬浮在新鲜媒体。
   2. 30分钟，上一个新的培养皿在37°C间孵化器的孵化需要消除分化的细胞和残馈线细胞。
   3. 悬浮细胞在培养结束时，将收集的400Ğ离心5分钟。
   4. 将在冰冷的PBS洗涤细胞沉淀三次，将通过在两个清洗之间的尼龙70微米过滤器，以排除细胞团块（2X过滤）通过细胞。
   5. 洗净后，将细胞计数，并在冷PBS悬浮浓度在1.5×10 ⁷细胞/ ml。
   6. 细胞将保持在注射前的冰。
   7. 继转移，将4-6周龄雌性C57BL/6J小鼠。 四，通过尾静脉注射之前，老鼠将被放置在红外光，其尾静脉扩张。
   8. 静脉扩张后，将200μL细胞悬液或3X10 ^6个细胞通过尾静脉继转移。六个星期将被允许在体内成熟OT我的TCR转iPS细胞。
   9. 1. 静脉注射6周后，将4X10 ⁶ E.G7胸腺瘤细胞腹腔接种。
      2. 从文化E.G7胸腺瘤细胞会有所收获，并在PBS洗三次。
      3. 在洗年底，细胞将悬浮在冷PBS浓度在8×10 ⁷细胞/ ml。
      4. 将50μL细胞悬液或4X10 ^6个细胞注射到腹腔。
4. 评价。
   1. OT我的TCR特性， 在体外转iPS细胞。
      1. 红色荧光的荧光显微镜检查，将绿色荧光蛋白双阳性细胞进行常规荧光显微镜下，与不固定的活细胞。
      2. 将进行PCR和RT-PCR分析基因的整合和表达。
         1. 将被隔离单独使用QIAGEN的DNA或从样品细胞的DNA或RNARNA分离试剂盒。
         2. 将进行PCR和RT-PCR引物特异性识别的TCRVβ5链重组VDJ地区使用。
   2. T细胞的发育和成熟。 图3a。
      1. 在第2周，4和6细胞移植后，动物将被处死，脾，淋巴结肿大，将会从动物中删除。
      2. 单细胞悬液，将通过机械故障。红血细胞将裂解使用的ACK裂解液mononucleocytes的，将被收集和冷PBS洗两次。
      3. 洗净后，将被阻止细胞的Fc受体阻滞剂24G2在4℃20分钟，并在的阻塞年底，细胞将被aliquotted和不同荧光标记的抗体，在4℃染色20分钟。
      4. 在染色结束时，细胞就会被冷PBS洗涤，流式细胞仪装载前的三倍。
   3. 肽刺激。 图3b。
      1. 动物肿瘤的挑战第50天，将被处死，脾，淋巴结肿大，将会从动物中删除。
      2. 单细胞悬液，将通过机械故障。红血细胞将裂解使用的ACK裂解液mononucleocytes的，将被收集和冷PBS洗两次。
      3. CD8 ^{+ T}细胞将通过美天旎生物技术的CD8 ^{+ T}细胞分离试剂盒分离。孤立的CD8 + T细胞，将混在1:10的比例，从天真的C57BL/6J小鼠小鼠隔离，脉冲和0.5μmol/毫升的卵_257-264肽为40个小时的照射脾。此后，布雷菲德菌素A将被添加到文化，另外4个小时。
      4. 在年底共培养，细胞就会有所收获，洗涤，如上所述的Fc受体阻滞剂阻断。
      5. 将阻止细胞表面标志染色CD8和TCRVβ5链ERS通过使用荧光标记的抗体。
      6. 细胞表面染色后，细胞将用4％甲醛固定，并通过细胞通透性套件透。
      7. 通透性后，将通过使用荧光标记的抗体染色，如IL-2和IFN-γ的细胞内分子。
      8. 前最后流式细胞仪检测，细胞将在冷PBS洗涤三次，以排除过量的抗体。
   4. 在体内的杀法。 图3C。
      1. 从天真的C57BL/6J小鼠的脾细胞将被孤立和羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记靶细胞。
      2. 5μmol/毫升CFSE标记（ConA ^您好细胞）将与10微克/毫升卵_257-264肽和0.5μmol/毫升CFSE标记（CFSE标记的^卤味细胞）将不会进行脉冲标记细胞的脉冲标记细胞。 2.5×10 ⁶ CFSE标记的^喜细胞加2.5×10 ⁶ CFSE标记^劳细胞的混合物将继静脉注射转移到指定的收件人。
      3. 16小时后，这些小鼠的脾细胞将被孤立和CFSE标记+细胞将通过流式细胞仪分析。
   5. 腹腔肿瘤细胞计数图4。
      小鼠肿瘤的挑战第20天，将被处死，腹腔灌洗，将用冷PBS。腹腔灌洗回收，将肿瘤细胞计数。
   6. 肿瘤浸润性T细胞识别。 图5。
      1. 在晚期肿瘤的挑战，将小鼠牺牲，将来自不同群体的腹腔取出肿瘤。
      2. 肿瘤将切成小块，一块将被放入离心管放在干冰立即，另一半将被固定在空调的RPMI-1640媒体将来使用甲醛和第三条，将被保留。
      3. 根据从甲醛固定石蜡包裹的样品一般协议，将进行H＆E染色。
      4. 将冷冻样品进行免疫荧光染色。
         1. 组织在使用前将切片和保存在-20℃。
         2. 组织切片，将空气中干燥15分钟，15分钟前冷丙酮固定。
         3. 固定后，该路段将是另一个15分钟前5分钟PBS洗涤干燥的空气。
         4. 后洗净，在潮湿室的幻灯片，并覆盖30微升3％BSA的PBS 30分钟，以阻断非特异性结合的组织切片。
         5. 在阻塞年底，涂抹封闭液和50μLPE-抗TCRVα2在3％BSA稀释的抗体和FITC标记的抗卵抗体混合物覆盖切片在PBS。
         6. 孵育在2个小时的湿室和孵化结束，幻灯片将在冷PBS洗涤三次，并用荧光显微镜检查前一种水性安装媒体上。
      5. 流式细胞仪分析肿瘤浸润性T细胞。
         1. 肿瘤会挤压成单细胞悬液，将ACK裂解液裂解红细胞。
         2. 洗涤和阻断后，细胞将被贴上明确承认CD8 +，TCRVα2和TCR Vβ5分子在细胞表面表达的不同荧光标记的抗体。
   7. 小鼠的存活率。 图6。
      肿瘤的挑战后，小鼠的生存将受到严格监控。

4。代表结果

CD3和TCRβ被用作标记的T细胞。我们评估，以确定是否与Notch配体DL1的iPS细胞的刺激，可促进T细胞分化表达CD3和^TCRβ+的 iPS细胞源性细胞，并进一步分析CD4和CD8的表达，对CD3门⁺和^TCRβ+人口。如下所示，在22天的CD3 ^{+TCRβ+，CD4 -} CD8 ⁺单阳性（SP）的T细胞产生iPS细胞在体外 。此外，iPS细胞衍生的SP细胞能产生IL-2和γ-干扰素在体外刺激的iPS细胞衍生板涂层的抗CD3和可溶性抗CD28抗体（ 图2）， T细胞的功能。

继转移到受体小鼠后，大部分的TCR基因转iPS细胞进行分化成CD8 + ⁺淋巴细胞，回应肽刺激体外本身creting IL-2和γ-干扰素（ 图3）。最重要的是，继转移TCR转iPS细胞引发OVA反应的淋巴细胞进入肿瘤组织和肿瘤的挑战（ 图5-6）保护动物的渗透。因此，TCR基因转导的iPS细胞能够分化为功能性抗原特异性淋巴细胞在体内 。

图1。iPS细胞分化的形态。在不同的日子，小鼠iPS细胞共培养与执行部分第9段，DL1的细胞在α-MEM培养基辅以20％FCS和2.2 g / L的碳酸氢钠存在5毫微克/毫升mFlt3L 1毫微克/毫升MIL-7 。

图2 iPS细胞，T细胞的分化。与图1中描述的OP9-DL1的细胞共培养小鼠iPS细胞。对DAY 22，iPS细胞源性细胞的分离和分析。一），CD4 ^{+，CD8 -}或CD4 ^- CD8 ⁺细胞后，门上的CD3 ⁺和^TCRβ+人口。 b）细胞在37°C，5％的CO ₂刺激板涂层的抗CD3和可溶性抗CD28抗体为5小时。 IL-2和IFN-γ的细胞内染色分析后，门活CD4 ^- CD8 ^{+ T}细胞。

图3。抗原特异性CD8 ^{+ T}细胞的iPS细胞在体内的发展。 OT-TCR基因转导的iPS细胞注入C57BL / 6小鼠第四 。 6到10周后，OVA特异性CD8 ^+Vβ5+ T细胞的发育。一），CD8 ^+Vβ5流式细胞仪门后的C ⁺汇集的淋巴结和脾脏细胞进行了分析，D8 ^+标准人口。乙）IL-2和γ-干扰素生产（暗线，阴影部分表示同型对照）测定细胞内细胞因子染色，CD8 ^+Vβ5+人口的门后。 C） 在体内的增殖/细胞毒性实验。 CFSE标记^喜 （右峰）和的CFSE ^劳 （左峰）靶细胞与卵_257-264肽和控制脉冲，分别注入小鼠iPS细胞转移或OT-CTL的转移后，有一天，10周后。

图4。继转移OT我的TCR基因转导的iPS细胞，抑制肿瘤生长。 OT-TCR基因转iPS细胞过继转移到C57BL / 6小鼠。一组小鼠OVA反应CD8 ^{+ T}细胞注射OT-TCŕ转基因小鼠，一组老鼠没有细胞的转移。小鼠后，无论是六个星期或细胞移植后的翌日，受到挑战E. G7肿瘤细胞。第20天，腹腔中的肿瘤细胞进行了列举。

图5。iPS细胞源性抗原特异性CTL渗透到肿瘤组织。肿瘤的挑战后30至35天，肿瘤组织进行了研究，为肿瘤反应T细胞的浸润。一）H＆E染色。炎症细胞浸润在肿瘤组织中（↓）。二）免疫组化染色。 OVA特异性^Vα2+淋巴细胞（红色）（绿色）卵表达的肿瘤组织中浸润。 c）从肿瘤组织中的单细胞悬液进行了分析Vα2表达^{+ +}通过流式细胞仪，之后的CD8 ⁺人口浇注Vβ5。

图6。继转移的OT-我的TCR基因转导的iPS细胞维持小鼠的存活率。卵TCR基因转导的iPS细胞过继转移到C57BL / 6小鼠受到挑战E.的七国集团肿瘤细胞图所述。 4。 Kaplan-Meier生存曲线（N = 6）50天的小鼠的存活率。

为使基于疗法， 在体外产生大量高活性银特定的T细胞在体内重新输液是最佳方法。虽然我们在体外培养的方法，给出了iPS细胞，iPS细胞源性细胞的死亡，尤其是在第四个星期，在四个星期内的大量功能性T细胞上升。我们得出这样的结论：从缺口的生存信号的信号介导的DL1的IL-7和FLt3L不足以维持iPS细胞衍生的祖T细胞的生存以及其他存活的因素可能是合作，以调节这些细胞成熟。 T细胞受体基因转导和体外的缺口配体刺激很大程度上直接ţ细胞分化然而，从iPS细胞的多能干细胞衍生的抗原特异性ţ细胞仍然能不能存活更长，这可防止获得的多能干细胞衍生的相应数字抗原-为使基于免疫特异性T细胞。

细胞在体内的抗原特异性CTL，从iPS编程可以克服的缺陷，以获得足够数量的T细胞，使基于疗法。尽管观测控制肿瘤的生长，我们确定了ACT的一些限制，与TCR基因转导的iPS细胞。首先，至少六周在体内发育是必不可少的，从T派生的T细胞分化ransferred iPS细胞。第二，我们注意到毛皮流失，骨质疏松症和其他未成年人自身免疫性表现在小鼠获得的TCR转iPS细胞，在一些行政性T细胞为基础的肿瘤免疫治疗的临床试验观察。这些影响可能会导致其他免疫细胞类型转移的iPS细胞的生成。然而，这些细胞是如何在体内产生的仍是未知。第三，TCR基因转导的iPS细胞过继转移风险的产生，是因为它的干型畸胎瘤。但到目前为止，在我们的研究中，我们只发现胸腺外群众在一个RAG1 - / -小鼠，并没有观察到在传统的C57BL / 6小鼠异常。因此，我们建议，以获得最大的效率，最好是在体内的iPS分化的遗传背景匹配。

在胚胎干细胞衍生的对比，从iPS细胞分化的一些细胞中的基因表达异常，有潜在L在¹⁸同源受助诱导T细胞依赖的免疫反应。因此，从特定病人的iPS细胞的细胞免疫原性应评估之前，这些自体细胞的临床应用设想。通过分析细胞衍生的iPS细胞的基因表达图谱，它已被证明，在异常高的水平表示了9个基因组（Hormad1，Zg16，Cyp3a11，Lce1f，SPT1，Lce3a，Chi3L4，OLR1，RETN） 。此外，这些基因在胚胎干细胞（Hormad1，Zg16和Cyp3a11）诱导表达显着增加对移植免疫原性基因相匹配的收件人^18。因此，9蛋白质组有可能导致iPS细胞衍生细胞过继转移后的免疫排斥反应，并可能代表免疫标记。然而，潜在的免疫原性的iPS细胞rived T淋巴细胞也尚未确定。