Establecimiento de cultivos de enriquecimiento microbianos eucariotas a partir de un estratificado químicamente lago de la Antártida y evaluación del potencial de carbono de fijación

1. Ejemplo de Adquisición

1. Elija y prepare el sitio de muestreo un día antes de muestreo de la columna de agua. Esto permitirá que las capas estratificadas de la columna de agua a la reforma después de una perturbación debido a la perforación y la fusión del hielo-agujero. Identificar la ubicación del sitio de perforación con el GPS.
2. Para acceder a la columna de agua, comience por la perforación de un agujero en el hielo con un taladro del hielo Jiffy conectado a una extensión de Jiffy de 4 pulgadas de vuelo y un poco de corte. Para evitar la congelación de la broca en el agujero, trate de evitar la perforación en el agua en estado líquido mediante la detención de perforación de aproximadamente 4-6 cm por encima de la parte superior de la columna de agua.
3. El taladro tendrá que ser ampliado de un diámetro de 15 a 60 cm antes del muestreo. Esto se logra mediante el uso de un horno de fusión agujero (Modelo Hotsy) que circula glicol polietileno caliente a través de un tubo de cobre. Agujero de fusión suele durar hasta 18 horas.
4. Antes de que el muestreo de la columna de agua, asegúrese de que todo el equipo necesario y la muestra de Sanvasos orage se ensamblan en el sitio de muestreo. Materiales de muestreo incluyen: botella de Niskin (L de capacidad 5-10), cabrestante con la profundidad calibrada por cable, Messenger, botellas suficientes muestras para cada profundidad de muestreo y refrigeradores para el transporte de muestras.
5. Comenzar el muestreo temprano en el día (~ 5 horas), como el filtrado de agua de los lagos debe ser completado en el día del muestreo. Recoger muestras de agua (1.5 L) de las profundidades deseadas (para este estudio: 6-m, 15 m, y de 18 m profundidad de muestreo, medidos desde el nivel del agua piezométrico en el agujero de hielo) con un sampler Niskin conectado a un calibrado la mano del cabrestante. Para evitar la perturbación de la columna de agua antes de recolectar poca profundidad más profundos.
6. Tienda lago muestras en cámaras frigoríficas y transporte desde el sitio de la muestra al laboratorio de campo con un trineo conectado a un ATV (vehículo todo terreno). Las muestras deben ser tratados o estabilizados (por ejemplo: congelación de flash en nitrógeno líquido) en el laboratorio de campo inmediatamente después de la toma de muestras.

2. Development de cultivos de enriquecimiento

1. Para el cultivo de cultivos de enriquecimiento, concentrado 0,5-1 litros de agua del lago a 47 mm de 0,45 micras de tamaño de poro de filtración con filtros de polietersulfona suave (<0,3 atm). Si la diversidad de la comunidad natural que se desea, se filtra una segunda muestra en 47 mm de 0,45 micras de tamaño de poro filtros de polietersulfona y seguir los protocolos de acuerdo a Bielewicz et al. ⁴ para eucariota diversidad filogenética.
2. Transferir filtros a 50 ml tubo estéril halcón contiene ~ 20 ml de agua del lago filtrada obtenida de la profundidad de muestreo igual a la del filtro. Lave suavemente las células del filtro utilizando una pipeta estéril.
3. Transferir suspensión celular a un 25 cm ² matraz estéril de cultivo celular. Añadir agua filtrada lago recogidos de cada profundidad de la muestra para aumentar el volumen de cultivo a 45 ml. Crear múltiples repeticiones para cada profundidad de muestreo, si enriquecimiento en diferentes medios de cultivo de los deseados.
4. Suplemento frascos de cultivo con 50X ssoluciones terile a una concentración final de 1X de los siguientes medios de cultivo: Medio Basal de Bold, BG11 y F / 2. Si el cultivo de organismos mixotróficos se requiere, configuración dos buques F/2-supplemented y añadir 2-3 granos de arroz estéril a uno de los matraces.
5. Incubar los frascos de cultivo a baja temperatura (4 ° C) y baja radiación (fotones de 20 mol m ^-2 s ^-1) en un crecimiento con control de temperatura de la incubadora al menos 4 semanas en la Antártida antes de su envío al laboratorio de EE.UU.. Si se desean aislamientos, la placa de 250 ml del cultivo de enriquecimiento en placas de agar que contienen los medios apropiados de crecimiento después de dos semanas de incubación.
6. Para el envío a los EE.UU., los cultivos de enriquecimiento de transferencia a estériles de 50 ml tubos Falcon. Requisito de solicitar el envío de "no congelar" y "mantener la calma" en el envío de solicitud. Si bien el proceso de envío de la Antártida es relativamente rápido (2 semanas por vía aérea comercial) y muy fiable, hay una posibilidad de pérdida de órgano fastidiosoismos durante el proceso de transporte. Por lo tanto, los investigadores pueden querer preservar una submuestra antes de su envío de manera que la pérdida de algunas especies durante el proceso de envío se puede evaluar.
7. A la llegada en los EE.UU., la transferencia de 5 ml de cultivo de enriquecimiento en 45 ml de medio de crecimiento apropiados en un matraz Erlenmeyer de 125-ml estéril tapado con una esponja estéril. Los cultivos de enriquecimiento debe mantenerse como culturas de pie en una temperatura de la cámara controla el crecimiento del medio ambiente (cámara de crecimiento diurno, VWR) a 4 ° C/20 mol fotones m ^-2 s ^-1. Los cultivos deben ser transferidos a medio fresco cada 30 días.

3. La extracción de la célula lisado de Enriquecimiento filtrados

1. Filtro de 5 ml de cultivo de enriquecimiento en un 25 mm Whatman GF / F con filtro de vacío suave (menos de 10 psi). El filtro se puede almacenar durante varias semanas a -80 ° C antes de analizar la actividad Rubisco.
2. Cortar el filtro en secciones de 4-5 con una tijera de acero estériles ytransferencia de las piezas con pinzas estériles a un tubo de 2 ml tapón de rosca llena de una quinta parte de la forma completa con 0,1 mm de diámetro de circonio / sílice cuentas.
3. Añadir 1,25 mL de tampón de extracción del filtro (50 bicina mM, 10 mM de MgCl _2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml de BSA, y 0,1% de Triton X-100; añadir fresco: 10 mM NaHCO $ _3, 10 mM de DTT, 3,3 mM de aminocaproico ácido, 0,7 benzamidina mM, pH 7,8) ¹³ e interrumpir las células utilizando un batidor Minibead tres veces durante 30 s con el ajuste de velocidad 48. Para evitar un calentamiento de la muestra, beadbeating alternan con 1 incubación hielo min.
4. Centrifugar suspensión filtro durante 2 minutos a 3000 xga 4 ° C para formar un gránulo suelto de GF / F fibras de filtro y los restos de la pared celular.
5. Quitar una parte alícuota de 200 uL y se sumergen en 800 l de helado de acetona al 90%. Medir la clorofila extraíble (chl) una en un espectrofotómetro a los valores de longitud de onda de 664 nm y 647 nm ^14. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
6. Centrifugar remaining sobrenadante a 4 ° C durante 2 min a 15.000 xg, y transferir el sobrenadante (evitar el sedimento de las membranas celulares insolubles y restantes GF / F fibras de filtro) a un tubo de microcentrífuga limpio 1,5 ml. Este lisado celular soluble ahora se puede utilizar en el ensayo de la actividad Rubisco carboxilasa.
7. Lisado puede ser almacenada a -80 ° C después de la adición de 12,5% de glicerol y la congelación de flash en nitrógeno líquido. Una pérdida de actividad puede producirse después de múltiples de congelación / descongelación ciclos dependiendo de la sensibilidad de las enzimas en el lisado. Por lo tanto, la actividad de lisado de fresca congelada frente debe ser probado antes en gran escala de células lisado extracciones.

4. RubisCO actividad carboxilasa Ensayo filtro

1. Transferir 125 l de lisado soluble a un tubo de 15 ml tornillo microcentrífuga tapa (la tapa no es necesario) que ha sido enfriada en hielo. Para las muestras de control negativo, añadir 125 lisado soluble l a 15 ml tubo de microcentrífuga de tornillo tapa, pero no añadir sustrato (en el paso 4,7). Ejecutarduplicar las reacciones de todas las muestras y los controles negativos.
2. Preparar 10 ml de tampón de ensayo fresco (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO _3, 25 mM de MgCl ₂₎ y enfriar en hielo. Alícuota suficiente del tampón de ensayo para todas las muestras y los controles negativos (100 l por muestra / control más 100 l adicional) a un tubo de 5 ml. Lleve a cabo todos los pasos subsiguientes en una campana extractora.
3. Añadir 40 l de NaH ¹⁴ CO ₃ (500 Ci / ml) por ml de tampón de ensayo para el buffer de alícuotas y mantener el buffer en hielo.
4. Retirar 10 l del tampón de ensayo que contenía ¹⁴ C y se diluye en 1 ml de tampón de ensayo. Después de invertir para mezclar, añadir 100 ml de la mezcla diluida 1:100 a 3 ml de Bio-Safe II centelleo contando cóctel en un vial de centelleo. Invertir para mezclar. Recuento de centelleo (Beckman LS6500) debe ser más de 18.000 copias por minuto antes de continuar con el ensayo.
5. Cuando un número suficiente de NaH ¹⁴ CO ₃ ha sido añadido a la tampón de ensayo,mover los tubos de reacción a un baño seco preajustado a 25 ° C y se incuba durante 3-5 minutos.
6. Añadir 100 l de tampón de ensayo a los lisados ​​e incubar durante 5 min a 25 ° C.
7. Añadir 20 l de 15 mM de ribulosa bisfosfato, a las muestras y permitir que la reacción proceder durante 5-10 minutos a 25 ° C.
8. Añadir 100 l de ácido propiónico (100%) (Fisher) para detener la reacción. Centrifugar durante 1 hora a 2.000 xg de agotamiento de los no incorporada ¹⁴ C.
9. Transferir el volumen total de las muestras a viales de centelleo que contenían 3 ml de Bio-Safe II cóctel de centelleo contando. Determinar cpm de productos ácidos finales estables por recuento de centelleo (B. Witte, R. comunicación Tabita personal).
10. Calcular las tasas de actividad de Rubisco en un chl una base ^14.

5. Los resultados representativos

Hemos utilizado el cultivo de enriquecimiento para aislar fototróficas adaptado al frío y protistas mixotróficos que residían en la Antártida LAke Bonney. Para capturar una mayor diversidad de organismos, hemos probado tres tipos de medios de cultivo: Medio basal de Bold (BBM) ^15, F/2-Si Medio Marino ^{16, 17} y ¹⁸ BG11 Medio. La inspección visual de los cultivos de enriquecimiento por microscopía óptica reveló que los cultivos fueron dominada por protistas fototróficas (indicado por la presencia de pigmento clorofila en la mayoría de las células) y albergaba una variedad de morfologías celulares en función de la profundidad de muestreo de la cual se tomó el inóculo y el tipo de medios utilizados en el cultivo (Fig. 1).

Se midió los niveles máximos de actividad carboxilasa catalizada por la enzima RubisCO como una aproximación a la potencial fijación de carbono. Chl a la abundancia ha sido monitorizada como una estimación de la biomasa fototróficas protistas (Fig. 2). A pesar de cultivo de todas las culturas en las mismas condiciones de temperatura / luz de régimen (es decir, 4 ° C/20 mol m ^-2 s ^-1), el potencial de fijación de carbonoy la biomasa fototróficas varió dramáticamente entre los cultivos de enriquecimiento. Máxima actividad RubisCO se observó en cultivos de enriquecimiento de cultivo, ya sea en BBM (Enriquecimientos 4 y 6) o BG11 (Enriquecimientos 13 y 14) medios de crecimiento, mientras que los cultivos enriquecidos en medio de crecimiento F / 2 (Enriquecimientos 19, 21, 23) exhibió un 4 - a 34 veces menor actividad carboxilasa máximos. Estas diferencias no se deben a los niveles más bajos de biomasa en los cultivos de F / 2, ya que la actividad carboxilasa se expresó en un Chl una base. Por otra parte, la actividad Rubisco no se correlacionó con la concentración de chl a (r = -0,023, p> 0,1;. La figura 2, recuadro). Las culturas BBM inoculados con el agua del lago de 6 my 15 m (Enriquecimientos 4 y 5) tuvo el mayor Chl a los niveles, mientras que todas las otras culturas exhiben chl relativamente bajo a, independientemente de la actividad de la enzima rubisco (Fig. 2).

Figura 1.Representante microbianos eucariotas culturas enriquecimiento que hemos seleccionado para el crecimiento de organismos diferentes. Identidad de la cultura se da en la parte inferior izquierda de los paneles. Todas las imágenes representan micrografías de luz generados usando aceite de inmersión con un aumento de 1000X.

Figura 2. La capacidad potencial de fijación de carbono y clorofila extraíble unos niveles en los cultivos de la Antártida microbianos eucariotas aislados de enriquecimiento del lago Bonney y se cultiva en diversos medios de cultivo. Ver Tabla 1 para más detalles cultura Recuadro:. De correlación de Pearson entre la clorofila un potencial de fijación de carbono en abundancia y culturas microbianas antárticas enriquecimiento eucariotas.

Estudios moleculares recientes han reportado una gran diversidad de eucariotas unicelulares a través de una amplia gama de entornos de ^{3, 19, 20,} sin embargo, debido a la falta de aislados en toda la gama de hábitats protist el papel funcional de estas especies individuales en las redes alimentarias son en gran parte desconocido. En este estudio, se han descrito métodos para enriquecer a las especies eucariotas microbianas presentan versatilidad metabólica de un ambiente relativamente undersampled, una permanente cubierta de hielo antártica lago. Cultivos enriquecidos de las profundidades de muestreo diferentes en el lago Bonney exhibieron diferencias en las tasas de fijación de carbono que fueron de crecimiento a medio-dependiente. Por ejemplo, un bajo potencial de fijación de carbono en cultivos enriquecidos en F / 2 frente a BBM, o BG 11 medios de crecimiento probablemente refleja diferencias en la diversidad y la capacidad metabólica protista. El crecimiento medio de BBM selecciona para especies de algas verdes (clorofitas o) y nuestras culturas parecen ser un monocultivo de una especie de alga verde (Fig.1A, B). Estos organismos se sabe que dependen en gran medida photoautotrophy. Un aislado del lago Bonney el metabolismo fotoautotróficos exposiciones puro, que tiene un requisito indispensable para la luz como su única fuente de energía ^1. En contraste, M / 2 crecimiento medio está diseñado para enriquecer en una amplia gama de protistas marinos, incluidos los organismos potencialmente mixotróficos ^12. A pesar de que no acababa de explorar la diversidad de las culturas de F / 2, vistas microscópicas de estos enriquecimientos muestran claramente un consorcio de protistas de distintas morfologías celulares (Fig. 1C, D). Por lo tanto, reduce la actividad Rubisco en los cultivos F / 2 podría ser debido a la utilización de alternativas modos de adquisición de carbono / energía. En apoyo de esta predicción, los cultivos puros de aislados photoautotrophic la Antártida muestran las tasas de Rubisco significativamente mayor en comparación con el máximo carboxilasa Antártida aislados que mixotrofía exposición (Dolhi & Morgan Kiss-, los resultados no publicados). Otros estudios de heterótrofos Sáenzla actividad YME en estas muestras ayudarían a caracterizar completamente la versatilidad metabólica de los cultivos de enriquecimiento y protistas están llevando a cabo en nuestro laboratorio. Además, los datos fisiológicos descritos en este documento se complementará con la información filogenética y la secuenciación metagenómica como parte de un gran esfuerzo de secuenciación para caracterizar las comunidades microbianas en todo el mundo llama el Proyecto Tierra Microbioma ( http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .

El ensayo modificado filtro descrito en este informe también se podría aplicar a lisado celular extraído de muestras filtradas lago de agua. Sin embargo, para las nuevas aplicaciones de este ensayo, el volumen de lisado óptimo debe determinarse por ensayo de tres volúmenes diferentes y utilizando lo que se obtiene cpm menos de 3 a 4 veces por encima de los controles negativos. Análisis del potencial de fijación de carbono en combinación con los análisis enzimáticos de las actividades heterótrofosdad en las comunidades de protistas naturales que proporcionan una visión más detallada de la función de la capacidad trófica protista y el ciclo del carbono en los ambientes acuáticos. En estos momentos estamos aplicando este enfoque para comprender el papel de los factores ambientales abióticos en la versatilidad metabólica protista en el lago Bonney y otros lagos antárticos. El método de ensayo de carboxilasa RubisCO filtro será una herramienta valiosa para estudiar la fijación de carbono potencial y versatilidad metabólica de pequeños cultivos de gran escala de enriquecimiento, así como sistemas integrales del lago.

Antes del desarrollo del cultivo de las herramientas moleculares independientes, protistas fueron identificados tradicionalmente por el cultivo y taxonómicamente clasificadas en función de su morfología celular. Así, hay una larga historia de enriquecimiento y aislamiento de los protistas que residen en una amplia variedad de hábitats. Las primeras investigaciones, en particular, son de gran valor histórico para la identificación taxonómica detallada (revisado en: ^{21, 22).} Mientras que el aislamiento de los protistasutilizando basados ​​en el enriquecimiento de los enfoques es relativamente rara en ambientes de agua dulce del Antártico, varios aislamientos de protistas marinos de enriquecimiento del agua de mar Antártico están disponibles ^23-26. Además, varias colecciones de cultivo se dedican a protista y aislados de microalgas (por ejemplo: la colección de cultivos Provasoli-Guillard, https://ncma.bigelow.org/~~V ). Tecnologías de secuenciación confiables y baratas han producido una enorme base de datos genética de las secuencias de protistas no cultivadas. Si bien estas bases de datos han sido muy informativa con respecto a la diversidad y distribución de este importante grupo de microorganismos, hay una brecha cada vez mayor en la vinculación de datos de la secuencia con nuestra comprensión de la ecología y la fisiología protista. Por lo tanto, las técnicas tradicionales de cultivo, particularmente en ambientes polares undersampled como los hábitats acuáticos seguirá desempeñando un papel importante hacia la comprensión de la importancia y el papel ecológicode los protistas en el ciclo geoquímico global.