Etablering af Mikrobielle Eukaryote berigelseskulturer fra en kemisk Stratificeret Antarktis Lake og vurdering af kulstofbinding potentiale

1. Prøve Køb

1. Vælg og forberede prøvetagningsstedet én dag før prøvetagning vandsøjlen. Dette vil give de lagdelte lag af vandsøjlen til at reformere efter forstyrrelse på grund af bore-og is-hul smeltning. Identificere placeringen af ​​borestedet med GPS.
2. For at få adgang vandsøjlen, begynder ved at bore et hul gennem isen med en Jiffy is snegl knyttet til en 4-tommer Jiffy flyvning udvidelse og skæring bit. For at forhindre frysning af boret i hullet, forsøge at undgå boring i det flydende vand ved at standse boringen cirka 4-6 inches over toppen af ​​vandsøjlen.
3. Borehullet skal blive udvidet fra en diameter på 15 til 60 cm inden prøveudtagningen. Dette opnås ved anvendelse af en hul smelteovn (Hotsy Model), som cirkulerer opvarmet polyethylenglycol via et kobberrør. Hul smeltning tager typisk op til 18 timer.
4. Forud for prøvetagning vandsøjlen, at alle nødvendige udstyr og prøve storage skibe samles på prøvetagningsstedet. Prøveudtagning materialer omfatter: Niskin flaske (5-10 L kapacitet), spil med dybde-kalibreret kabel, Messenger, tilstrækkelige prøvetagningsflasker for hver prøveudtagning dybde og kølere til prøve transport.
5. Begynd prøvetagning tidligt på dagen (~ 5 AM), som søvandet filtrering skal udfyldes på dagen for prøveudtagningen. Indsamle vandprøver (1-5 liter) fra de ønskede dybder (til denne undersøgelse: 6-m, 15 m og 18-m sampling dybder, målt fra piezometric vandniveauet i isen hul) under anvendelse af en Niskin sampler fastgjort til en kalibreret håndspil. For at forhindre forstyrrelse af vandsøjlen samle lavt vand, før dybere dem.
6. Store sø prøver i kølere og transport fra prøvestedet til marken laboratoriet ved hjælp af en slæde knyttet til en ATV (all terrain vehicle). Prøver skal behandles eller stabiliseret (for eksempel: flash fryser i flydende nitrogen) i feltet laboratoriet straks efter prøvetagning.

2. UDVIKLINGnt af berigelseskulturer

1. Til dyrkning af berigelseskulturer, Koncentrer 0,5-1 L af søvand pÃ¥ 47 mm 0,45 um porestørrelse polyethersulfon filtre vha. blid filtrering (<0,3 atm). Hvis mangfoldighed naturlige samfund er ønsket, filtrere en anden prøve pÃ¥ 47 mm 0,45 um porestørrelse polyethersulfon filtre og følg protokoller i henhold til Bielewicz et al. ⁴ for eukaryote fylogenetiske mangfoldighed.
2. Overførsel filteret 50 ml sterilt Falcon-rør indeholdende ~ 20 ml filtreret søvand opsamlet fra den samme prøvedybde som filter. Forsigtigt vaske cellerne fra filteret ved hjælp af en steril pipette.
3. Overførsel cellesuspension i en 25 ^cm2 steril cellekultur kolbe. Tilsættes filtreret søvand opsamlet fra hver prøve dybde til at forøge kulturen volumen til 45 ml. Konfigurer flere gentagelser for hver prøveudtagning dybde, hvis berigelser på forskellige dyrkningsmedier ønskes.
4. Supplere dyrkningskolber med 50X sterile løsninger til en slutkoncentration på 1X af følgende dyrkningsmedierne: Fed s basalmedium, BG11 og F / 2. Hvis dyrkning af mixotrophic organismer er nødvendig, set-up to F/2-supplemented skibe og tilsæt 2-3 korn af sterile ris til en af ​​kolberne.
5. Inkuber kultur kolber ved lav temperatur (4 ° C) og lav irradians (20 pmol fotoner m ^-2 s ^-1) i en temperatur-kontrolleret vækst inkubator i mindst 4 uger i Antarktis før forsendelse til din amerikanske laboratorium. Hvis isolater ønskes, plade 250 pi berigelseskulturen på agarplader indeholdende passende vækstmedium efter 2 ugers inkubation.
6. For forsendelse til USA, overførsel berigelseskulturer til sterile 50-ml Falcon-rør. Anmodning forsendelse krav om "ikke fryse" og "keep cool" på forsendelse anmodning. Mens forsendelsesprocessen fra Antarktis er relativt hurtigt (2 uger ved kommerciel luft) og yderst pålidelig, er der en mulighed for tab af kræsne organnismer under transport processen. Således kan efterforskerne ønsker at bevare en delprøve før levering, så tabet af visse arter under transporten processen kan vurderes.
7. Ved ankomsten i USA, loft overførsel 5 ml berigelse kultur i 45 ml af passende vækstmedier i en 125-ml steril Erlenmeyerkolbe med en steril svamp. Berigelseskulturer bør opretholdes som stående kulturer i en temperaturkontrolleret miljø vækstkammer (døgnets Vækst Afdeling, VWR) ved 4 ° C/20 pmol fotoner m ^-2 s ^-1. Kulturer bør overføres til friske medier hver 30. dag.

3. Cellelysat Ekstraktion fra filtreret berigelser

1. Filteret 5 ml berigelseskulturen på en 25 mm Whatman GF / F-filter under anvendelse blid vakuum (<10 psi). Filteret kan opbevares i flere uger ved -80 ° C før analyse RuBisCO aktivitet.
2. Skær filter i 4-5 sektioner med sterile stål saks ogoverføre stykker med sterile pincetter i et 2 ml skruelåg rør fyldt 1/5 af den måde, fyldt med 0,1 mm diameter zirconiumoxid / silicaperler.
3. Tilsættes 1,25 ml filter ekstraktionsbuffer (50 mM bicin, 10 mM _MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA og 0,1% triton X-100; tilsættes frisk: 10 mM _NaHCO3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocapronsyre syre, 0,7 mM benzamidin, pH 7,8) ¹³ og forstyrre celler under anvendelse af en Minibead slagle tre gange i 30 sekunder pÃ¥ hastighedsindstilling 48. For at forhindre opvarmning af prøven, alternative beadbeating med 1 min is inkubation.
4. Centrifugeres filter opslæmning i 2 minutter ved 3000 x g ved 4 ° C til dannelse af en løs pellet af GF / F filter fibre og cellevæg debris.
5. Fjern en 200 ul prøve og nedsænkes i 800 pi iskold 90% acetone. Måle ekstraherbart chlorophyl (Chl) en i et spektrofotometer ved en bølgelængde værdier 664 nm og 647 nm ^14. Supernatanten overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
6. Centrifuger remaining supernatanten ved 4 ° C i 2 minutter ved 15.000 x g og overføres supernatanten (undgå pellet af uopløselige cellulære membraner, og de resterende GF / F filter fibre) til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør. Denne opløselige cellelysat kan nu anvendes i RuBisCO carboxylase-aktivitet assay.
7. Lysatet kan opbevares ved -80 ° C efter tilsætning af 12,5% glycerol og flash frysning i flydende nitrogen. Et tab af aktivitet kan forekomme efter multiple fryse / optøningscykler afhængigt følsomheden af ​​enzymer i lysatet. Derfor bør aktiviteten af ​​frisk versus frosset lysat testes, før stor skala cellelysat ekstraktioner.

4. RuBisCO carboxylase Aktivitet Filter Assay

1. Overførsel 125 uL af opløseligt lysat til en 15 ml skruelåg mikrocentrifugerør (hætte ikke nødvendigt), som er blevet afkølet på is. For negative kontrolprøver, tilsættes 125 pi opløseligt lysat til 15 ml skruelåg mikrocentrifugerør, men ikke tilsættes substrat (i trin 4.7). Kørduplicate reaktioner for alle prøver og negative kontroller.
2. Fremstilling af 10 ml assaybuffer frisk (50 mM bicin-NaOH, pH 8,0, 50 mM _NaHCO3, 25 mM _MgCl2) og afkøles på is. Portion nok af assaypufferen for alle prøverne og negative kontroller (100 gi pr sample / kontrol plus 100 uL ekstra) til et 5 ml rør. Udfør alle efterfølgende trin under en emhætte.
3. Tilsættes 40 uL NaH ¹⁴ _CO3 (500 uCi / ml) pr ml i assaypuffer til alikvoter puffer og holde puffer pÃ¥ is.
4. Fjernelse 10 pi assay-buffer indeholdende ¹⁴ C og fortyndes det i 1 ml assaybuffer. Efter inverterende at blande, tilsættes 100 pi af 1:100 fortyndede blanding til 3 ml af Bio-Safe II scintillationstællingscocktail i et scintillationshætteglas. Invert at blande. Scintillationsbeholdere tæller (Beckman LS6500) skal være over 18.000 CPM før du fortsætter med analysen.
5. NÃ¥r tilstrækkeligt NaH ¹⁴ _CO3 er blevet tilføjet til assaypuffer,bevæge reaktionsrørene i et tørt bad forudindstillet til 25 ° C og inkuberes i 3-5 min.
6. Tilsæt 100 pi assay-buffer til lysaterne og inkuberes i 5 minutter ved 25 ° C.
7. Tilsættes 20 pi 15 mM ribulose bisphosphat, at prøverne og tillade reaktionen at forløbe i 5-10 minutter ved 25 ° C.
8. Tilsættes 100 pi propionsyre (100%) (Fisher) at standse reaktionen. Centrifuger i 1 time ved 2.000 xg at udtømme personlige ¹⁴ C.
9. Overfør det samlede volumen af ​​prøverne til scintillationsglas indeholdende 3 ml Bio-Safe II scintillationstællingscocktail. Bestem cpm syre stabile slutprodukter ved scintillationstælling (B. Witte, R. Tabita personlig kommunikation).
10. Beregn RuBisCO erhvervsfrekvens på et Chl et grundlag ^14.

5. Repræsentative resultater

Vi udnyttede berigelse dyrkning til at isolere kuldetilpassede fototrof og mixotrophic protister bosiddende i Antarktis LAKE Bonney. For at fange en større mangfoldighed af organismer, vi har testet tre vækst medietyper: Fed har basalmedium (BBM) ^15, F/2-Si Marine Medium ^{16, 17} og BG11 Medium ^18. Visuel inspektion af berigelseskulturer ved lysmikroskopi afslørede, at kulturerne var domineret af fototrofe protister (indikeret ved tilstedeværelsen af ​​klorofyl pigment i de fleste celler) og husede en lang række cellelinjer morfologier afhængigt prøvedybde hvorfra inokulum blev taget, og medietype anvendt i kultur (fig. 1).

Vi målte maksimale satser for carboxylase aktivitet katalyseret af enzymet RuBisCO som en proxy for kulstofbinding potentiale. Chl en overflod blev også overvåget som et skøn over fototrof protist biomasse (fig. 2). På trods af dyrkning af alle kulturer under samme temperatur / lys regime (dvs. 4 ° C/20 mikromol m ^-2 s ^-1), kulstofbinding potentialeog fototrofe biomasse varierede markant mellem berigelseskulturer. Maksimal RuBisCO aktivitet blev observeret i berigelseskulturer vokser i enten BBM (berigelser 4 og 6) eller BG11 (berigelser 13 og 14) vækstmedier, mens kulturer beriget på F / 2 vækstmedium (berigelser 19, 21, 23) udviste en 4 - 34-fold lavere maksimale carboxylase aktiviteter. Disse forskelle var ikke på grund af lavere biomasse niveauer i de F / 2 kulturer, som carboxylase aktivitet blev udtrykt på et Chl et grundlag. Desuden havde RuBisCO aktivitet ikke korrelerer med Chl en planlagt fusion (r = -0,023, p> 0,1;. Figur 2, indsat). De BBM kulturer podet med søvand fra 6 m og 15 m (berigelser 4 og 5) havde den højeste Chl-a-niveauer, mens alle andre kulturer udviste relativ lav Chl-a, uanset RuBisCO enzymaktivitet (fig. 2).

Figur 1.Repræsentative mikrobielle eukaryote berigelseskulturer der har udvalgt til vækst af forskellige organismer. Identiteten af ​​kulturen er givet i den nedre venstre af panelerne. Alle billeder repræsenterer lysmikrografer genereres ved hjælp af immersionsolie ved 1000X forstørrelse.

Figur 2. Potentiel kulstofbinding kapacitet og ekstraherbare klorofyl a niveauer i Antarktis mikrobielle eukaryote berigelseskulturer isoleret fra Lake Bonney og dyrket på forskellige substrater. Se tabel 1 for kultur detaljer Indsat:. Pearson korrelation mellem klorofyl a overflod og kulstofbinding potentiale i Antarktis mikrobielle eukaryote berigelse kulturer.

Nylige molekylære undersøgelser har rapporteret stor mangfoldighed af encellede eukaryoter tværs af en række miljøer ^{3, 19, 20,} men på grund af manglende isolater hele rækken af protist levesteder funktionelle roller disse individuelle arter fødekæder stort set ukendt. I denne undersøgelse har vi beskrevet metoder til berigelse for mikrobielle eukaryote art, der udviser metaboliske alsidighed fra en forholdsvis undersamplet miljø, en permanent isdækkede Antarktis sø. Kulturer beriget fra forskellige sampling dybder i Lake Bonney udstillet differentierede kulstofbinding satser, der var vækstmedium-afhængig. For eksempel kan kulstoffattigt fiksering potentiale i kulturer beriget i F / 2 versus BBM eller BG 11 vækstmedierne afspejler forskelle i protist diversitet og metaboliske egenskaber. BBM vækstmedium selekterer for grønne algearter (eller chlorophytes) og kulturer synes at være en monokultur af en grøn algearter (fig.1A, B). Disse organismer er kendt for høj grad afhænge af photoautotrophy. Ét isolat fra Lake Bonney udstiller ren photoautotrophic stofskiftet, der har strenge krav om lys som eneste energikilde ^1. I modsætning hertil er F / 2 vækstmedium udformet til at berige for en bred vifte af marine protister, herunder potentielt mixotrophic organismer ^12. Selvom vi ikke fuldt ud at udforske den mangfoldighed af F / 2 kulturer, mikroskopiske udsigt over disse berigelser viser tydeligt et konsortium af protister af forskellige celle morfologier (Fig. 1C, D). Således reduceres RuBisCO aktivitet i F / 2 kulturer kunne skyldes anvendelse af alternative carbon / energi erhvervelse tilstande. Til støtte for denne forudsigelse, udviser renkulturer af photoautotrophic antarktiske isolater markant højere maksimale RuBisCO carboxylase priser sammenlignet med Antarktis isolerer som udviser mixotrophy (Dolhi & Morgan-Kiss, upublicerede resultater). Yderligere undersøgelser af heterotrofe EnzYme aktivitet i disse prøver vil hjælpe med til at karakterisere den metaboliske alsidighed af protist berigelseskulturer og er i øjeblikket i vores laboratorium. Desuden vil de fysiologiske data, der er beskrevet i dette dokument suppleres med fylogenetisk og metagenomic sekventering oplysninger som en del af et stort sekventering indsats for at karakterisere mikrobielle samfund over hele kloden kaldet Jorden Microbiome Project ( http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .

Den modificerede filter assayet beskrevet i denne rapport kan også anvendes til cellelysat ekstraheret fra filtrerede søvandet prøver. Imidlertid, for nye anvendelser af dette assay, skal optimale lysat volumen bestemmes ved at analysere tre forskellige mængder og med at der giver cpm mindst 3 til 4 gange over de negative kontroller. Analyser af kulstofbinding potentiale i forbindelse med enzymatiske analyser af heterotrofe aktiviteTy i naturlige protist samfund ville give et mere detaljeret billede af den rolle protist trofisk evne og kulstof cykling i akvatiske miljøer. Vi er i øjeblikket anvender denne tilgang til at forstå betydningen af ​​abiotiske miljøfaktorer i protist metabolisk alsidighed i Lake Bonney og andre antarktiske søer. Den RuBisCO carboxylase filter assaymetode vil være et værdifuldt værktøj til at studere potentialet kulstofbinding og metabolisk alsidighed i små berigelseskulturer samt hele søen systemer.

Forud for udviklingen af ​​dyrkningsmetoder uafhængige molekylære værktøjer blev protister traditionelt identificeret ved dyrkning og taksonomisk klassificeret baseret på deres cellemorfologi. Der er således en lang tradition for berigelse og isolering af protister bopæl i en bred vifte af habitater. Tidlige undersøgelser i særdeleshed er historisk værdifulde for detaljeret taksonomisk identifikation (revideret i: ^{21, 22).} Mens isolering af protisterved hjælp af berigelse tilgange er relativt sjældne i Antarktis ferskvandsområder flere marine protist isolater fra berigelse af Antarktis havvand er tilgængelige ^23-26. Derudover er adskillige kultursamlinger dedikeret til protist og mikroalgepolysakkaridsammensætninger isolater (for eksempel: at Provasoli-Guillard Culture Collection, https://ncma.bigelow.org/~~V ). Pålidelige og billige sekventering teknologier har skabt en massiv genetisk database for vilde protistan sekvenser. Selv om disse databaser har været meget informative med hensyn til mangfoldighed og distribution af denne vigtige gruppe af mikroorganismer, der er en voksende kløft i bindingssekvens data med vores forståelse af protist økologi og fysiologi. Således vil de traditionelle dyrkningsmetoder, især i undersamplet miljøer såsom polære akvatiske habitater fortsat spille en vigtig rolle til at forstå betydningen og økologiske rolleaf protister i den globale geokemiske cykling.