Fastställande av mikrobiella Eukaryota anrikning kulturer från ett kemiskt Stratifierad Antarktis Lake och bedömning av Carbon Fixering Potential

1. Provtagning

1. Välj och förbered provtagningsplatsen en dag före provtagning av vattnet. Detta kommer att tillåta strierade stråk av vattenpelaren för att reformera efter en störning på grund av borrningen och is-hål smältning. Identifiera platsen för borrplatsen med GPS.
2. För att komma åt vattnet, börja med att borra ett hål genom isen med en Jiffy isborr ansluten till en 4-tums Jiffy flight förlängning och skärning bit. För att förhindra frysning av borren i hålet, försök att undvika borrning i flytande vatten genom att stoppa borrning ca 4-6 inches ovanför vattnet.
3. Borrhålet måste vidgas från en diameter på 15 till 60 cm före provtagningen. Detta åstadkommes genom användning av ett hål smältare (Hotsy modell), som cirkulerar uppvärmd polyetylenglykol genom ett kopparrör. Hål smältning tar normalt upp till 18 timmar.
4. Före provtagning av vattnet, se till att all erforderlig utrustning och prov storage fartyg monteras på provtagningsplatsen. Sampling material inkluderar: Niskin flaska (5-10 L kapacitet), vinsch med djup kalibrerad-kabel, Messenger, tillräckligt provflaskor för varje provtagning djup och kylare för prov transport.
5. Börja provtagning tidigt på dagen (~ 5 am), som sjövatten filtrering skall fyllas på dagen för provtagningen. Samla vattenprover (1-5 L) från önskade djup (för denna studie: 6-m, 15-m och 18-m djup provtagning, mätt från den piezometriska vattennivån i isen hålet) med en Niskin provtagare ansluten till en kalibrerad handvinsch. För att förhindra störning av vattnet samlas grunda djup innan djupare sådana.
6. Förvara sjön prover i kylare och transporter från provet platsen till fältet labbet med en släde ansluten till en ATV (All Terrain Vehicle). Prover bör behandlas eller stabiliseras (för t.ex. flash frysa i flytande kväve) på fältet laboratoriet omedelbart efter provtagning.

2. Development av anrikning kulturer

1. För odling av anrikning kulturer, Koncentrera 0,5-1 liter sjövatten pÃ¥ 47 mm 0,45 storlek um por polyetersulfon filter skonsam filtrering (<0,3 atm). Om mÃ¥ngfalden i naturliga samhället önskas, filtrera ett andra prov pÃ¥ 47 mm 0,45 um porstorleken polyetersulfon filter och följ protokoll enligt Bielewicz et al. ⁴ för eukaryot fylogenetisk mÃ¥ngfald.
2. Överföring filter 50 ml sterilt Falcon-rör med ~ 20 ml filtrerat sjövatten samlats från samma sampling djup som filtret. Försiktigt tvätta celler från filtret med hjälp av en steril pipett.
3. Överföra cellsuspension till en 25 cm ² steril cellkultur kolv. Lägg filtrerat sjövatten samlas in frÃ¥n varje prov djup för att öka kulturen volymen till 45 ml. Ställ in flera replikat för varje provtagning djup om anrikning pÃ¥ olika odlingsmedier önskas.
4. Komplettera odlingsflaskor med 50X sterile lösningar till en slutlig koncentration av 1 X av följande odlingsmedia: Fet s Basal Medium, BG11 och F / 2. Om odling av mixotrophic organismer krävs, set-up två F/2-supplemented fartyg och tillsätt 2-3 korn av sterila ris till en av kolvarna.
5. Inkubera kultur kolvar vid låg temperatur (4 ° C) och låg irradians (20 pmol fotoner m ^-2 s ^-1) i en temperatur-kontrollerad tillväxt inkubator i minst 4 veckor i Antarktis före transporten till din US laboratorium. Om isolat önskas plattan 250 | il av anrikning kultur på agarplattor innehållande lämpliga tillväxtmedia efter 2 veckors inkubation.
6. För leverans till USA, överföra anrikning kulturer till sterila 50-ml Falcon-rör. Begäran leverans kravet på "ej frysas" och "svalka" på sjöfarten begäran. Medan sjöfarten processen från Antarktis är relativt snabb (2 veckor av kommersiell luft) och mycket tillförlitliga, finns det en möjlighet för förlust av kräsen organnismer under transportprocessen. Således kan utredarna vill bevara ett delprov före leverans så att förlusten av vissa arter under transporten processen kan bedömas.
7. Vid ankomsten i USA, tak överföring 5 ml anrikning kultur i 45 ml av lämpliga tillväxt media i en 125-ml steril Erlenmeyerkolv med en steril svamp. Berikning kulturer bör behållas som stå kulturer i en temperaturstyrd miljö tillväxt kammaren (Daglig tillväxt avdelningen, VWR) vid 4 ° C/20 imol fotoner m ^-2 s ^-1. Kulturer bör överföras till nytt medium var 30 dagar.

3. Cellysatet Utsug från Filtrerat Anrikningar

1. Filtret 5 ml av anrikningen kultur på ett 25 mm Whatman GF / F-filter med användning av varsam vakuum (<10 psi). Filtret kan förvaras flera veckor vid -80 ° C före analys RuBisCo aktivitet.
2. Skär filtret i 4-5 avsnitt med sterila stål sax ochöverföra bitarna med steril pincett till en 2 ml skruvlock rör fyllt 1/5 av det sätt fullständig med 0,1 zirkoniumoxid / kiseldioxid mm diameter pärlor.
3. Tillsätt 1,25 ml av filtret extraktionsbuffert (50 mM bicin, 10 _mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, och 0,1% Triton X-100; tillsätt färsk: 10 mM NaHCOs _3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminokapronsyra syra, 0,7 mM bensamidin, pH 7,8) ¹³ och störa celler med användning av en Minibead visp tre gÃ¥nger under 30 s pÃ¥ hastighetsinställning 48. För att förhindra uppvärmning av provet, suppleant beadbeating med 1 minut is inkubation.
4. Centrifugera slurryn filtret under 2 min vid 3000 xg vid 4 ° C för att bilda en lös pellet av GF / F filter fibrer och cellväggen skräp.
5. Ta bort en 200 fil alikvot och sänk ned i 800 pl iskall 90% aceton. Mät extraherbart klorofyll (CHL) en i en spektrofotometer vid våglängden värden på 664 nm och 647 nm ^14. Överför supernatanten till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
6. Centrifugera remaining supernatanten vid 4 ° C under 2 min vid 15.000 x g och överföra supernatanten (undviker pelleten av olösliga cellmembran och återstående GF / F filter fibrer) till en ren 1,5 ml mikrocentrifugrör. Denna lösliga cell-lysat kan nu användas i Rubisco karboxylas aktivitetsanalys.
7. Lysatet kan förvaras vid -80 ° C efter tillsats av 12,5% glycerol och snabbfrysning i flytande kväve. En förlust av aktivitet kan uppträda efter flera frysnings / tinings-cykler, beroende på känsligheten hos de enzymer i lysatet. Därför bör aktiviteten av färskt kontra fryst lysat testas innan storskaliga cellysat extraktioner.

4. RuBisCo karboxylasaktiviteten Filter Analys

1. Överföra 125 pl av löslig lysat till en 15 ml skruvlock mikrocentrifugrör (locket inte behövs) som kylts på is. För negativa kontrollprover, tillsätt 125 | il lösliga lysatet till 15 ml skruvlock mikrocentrifugrör, men som inte tillför substratet (i steg 4.7). Körduplicera reaktioner för alla prover och negativa kontroller.
2. Framställ 10 ml testbuffert färskt (50 mM Bicin-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCOs _3, 25 _mM MgCl2) och kyl på is. Alikvot tillräckligt av analysbuffert för alla prover och negativa kontroller (100 | il per prov / kontroll plus 100 | il extra) till en 5 ml-rör. Utför alla efterföljande steg I ett dragskåp.
3. Tillsätt 40 pl NaH ¹⁴ CO ₃ (500 | iCi / ml) per ml analysbuffert till alikvoterades buffert och hÃ¥lla buffert pÃ¥ is.
4. Avlägsna 10 | il av analysbuffert innehÃ¥llande ¹⁴ C och spädas pÃ¥ 1 ml analysbuffert. Efter invertering att blanda, tillsätt 100 | il av 1:100 utspädd blandning med 3 ml Bio-Safe II scintillationsräkning cocktail i en scintillationsampull. Vänd för att blanda. Scintillation räknas (Beckman LS6500) bör vara över 18.000 kopior innan du fortsätter med analysen.
5. När tillräckligt NaH ¹⁴ CO ₃ har lagts till analysen buffert,flytta reaktionsrören i ett torrt badet förinställd till 25 ° C och inkubera under 3-5 minuter.
6. Tillsätt 100 pl analysbuffert till lysaten och inkubera under 5 min vid 25 ° C.
7. Tillsätt 20 pl av 15 mM ribulosbisfosfatkarboxylas, att proverna och låta reaktionen fortskrida under 5-10 minuter vid 25 ° C.
8. Tillsätt 100 pl propionsyra (100%) (Fisher) för att stoppa reaktionen. Centrifugera i 1 timme vid 2.000 xg för att uttömma oinkorporerad ¹⁴ C.
9. Överföra den totala volymen av proverna till scintillationsflaskor innehållande 3 ml Bio-Safe II scintillationsräkning cocktail. Bestäm cpm av sura stabila slutprodukter genom scintillationsräkning (B. Witte, R. Tabita personlig kommunikation).
10. Beräkna RuBisCo förvärvsfrekvens på CHL grund ^14.

5. Representativa resultat

Vi utnyttjade anrikning odling för att isolera kalla-anpassad fototrofa och mixotrophic protister som bor i Antarktis LAKE Bonney. För att fånga en större mångfald av organismer, testade vi tre tillväxt media typer: Bold Basal Medium (BBM) ^15, F/2-Si Marine Medium ^{16, 17} och BG11 Medium ^18. Visuell inspektion av anrikning kulturer genom ljusmikroskop visade att kulturerna dominerades av fototrofa protister (indikeras av närvaron av klorofyll pigment i de flesta celler) och hyste en mängd cell morfologier beroende på provtagning djupet från vilken inokulat togs och typ av media som används i kultur (fig. 1).

Vi mätte högsta tillåtna nivåerna för karboxylasaktiviteten katalyseras av enzymet RuBisCo som en proxy för kol fixering potential. Chl en mängd övervakades också som en uppskattning av fototrofa Protist biomassa (fig. 2). Trots odling av alla kulturer under samma temperatur / ljus regimen (dvs. 4 ° C/20 imol m ^-2 s ^-1), kol fixering potentialoch fototrofa biomassa varierade kraftigt mellan de anrikning kulturer. Maximal Rubisco-aktivitet observerades i anrikning kulturer växer i antingen BBM (Anrikningar 4 och 6) eller BG11 (Anrikningar 13 och 14) tillväxtmedia, medan kulturer anrikade på F / 2 tillväxtmedium (Anrikningar 19, 21, 23) uppvisade en 4 - till 34-faldigt lägre gränsvärden karboxylas aktiviteter. Dessa skillnader var inte på grund av lägre biomassa i F / 2 kulturer karboxylas aktiviteten uttrycktes på ett ChI en bas. Dessutom hade RuBisCo aktivitet korrelerade inte med CHL en koncentration (r = -0,023, p> 0,1;. Fig. 2, infälld). VBB kulturer som inokulerats med sjövatten från 6 m och 15 m (Anrikningar 4 och 5) hade den högsta CHL-nivåer, medan alla andra kulturer uppvisat relativt låg CHL ett, oavsett RuBisCo enzymaktivitet (Fig. 2).

Figur 1.Representativa mikrobiella eukaryota anrikning kulturer som har valts ut för tillväxten av olika organismer. Identitet av kulturen ges i det nedre vänstra panelerna. Alla bilder representerar Ijusmikrofotografier genereras med hjälp av oljeimmersion vid 1000 gångers förstoring.

Figur 2. Potential koldioxid fixering kapacitet och utdragbara klorofyll a nivåer i Antarktis anrikning mikrobiella eukaryota kulturer isolerade från sjön Bonney och odlas på olika odlingsmedier. Se tabell 1 för kultur mer information Inset. Pearson korrelation mellan klorofyll ett överflöd och kol fixering potential i Antarktis anrikning mikrobiella eukaryota kulturer.

Nya molekylära studier har rapporterat stor mångfald av encelliga eukaryoter i en rad miljöer ^{3, 19, 20,} men på grund av brist på isolat över hela skalan av FÄRGLÖSA livsmiljöer de funktionella roller dessa individuella arter i näringsvävar är till stor del okänd. I denna studie har vi beskrivit metoder för att anrika mikrobiella eukaryota arter som uppvisar metabolisk mångsidighet från en relativt undersamplas miljö, en permanent istäckt Antarktis sjö. Kulturer berikade från olika provtagningar djup i Lake Bonney ut differentierade kol fixering som var odlingsmedium-beroende. Till exempel visar låga koldioxidutsläpp fixering potential i kulturer anrikade på F / 2 kontra BBM eller BG 11 media tillväxten sannolikt skillnader i Protist mångfald och metabolisk kapacitet. BBM odlingsmedium väljer för gröna alger (eller chlorophytes) och våra kulturer verkar vara en monokultur av en grön algarter (Fig.1A, B). Dessa organismer är kända för att i hög grad beroende av photoautotrophy. Ett isolat från Lake Bonney utställningar rent photoautotrophic metabolism, med ett strikt krav för ljus som enda energikälla ^1. I motsats härtill är F / 2 tillväxtmedium utformad för att anrika för en rad olika marina protister, inklusive potentiellt mixotrophic organismer ^12. Även om vi inte fullt ut utforska mångfalden av F / 2 kulturer, mikroskopiska utsikt över dessa anrikningsgrad visar tydligt ett konsortium av protister olika cell morfologier (Fig. 1C, D). Således minskad RuBisCo aktivitet i F / 2 kulturerna skulle kunna bero på användning av alternativa kol / energi förvärv lägen. Till stöd för denna förutsägelse, rena kulturer av photoautotrophic Antarktis isolat uppvisar betydligt högre maximal RuBisCo karboxylas priser jämfört med Antarktis isolat som uppvisar mixotrofi (Dolhi & Morgan-Kiss, opublicerade resultat). Ytterligare studier av heterotrofa EnzYME aktivitet i dessa prover skulle bidra till att fullständigt karaktärisera metaboliska mångsidigheten hos FÄRGLÖSA anrikning kulturerna och pågår för närvarande i vårt laboratorium. Dessutom kommer de fysiologiska uppgifter som beskrivs i detta dokument kompletteras med fylogenetiska och metagenomic sekvensering information som en del av en stor sekvensering försök att karaktärisera mikrobiella samhällen över hela världen som kallas jorden microbiome Project ( http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .

Den modifierade Filtret analysen som beskrivs i denna rapport kan också tillämpas på cellysatet ur filtrerade prover sjövatten. För nya tillämpningar av denna analys bör optimal lysat volymprocent skall bestämmas genom analys av tre olika volymer och använda det som ger CPM minst 3 till 4 gånger högre de negativa kontrollerna. Analyser av kol fixering potentialen i samband med enzymatiska analyser av heterotrofa aktiviteterTy i naturliga FÄRGLÖSA samhällen skulle ge en mer detaljerad vy av den roll som Protist trofisk förmåga och kolets kretslopp i akvatiska miljöer. Vi håller för närvarande använder detta angreppssätt för att förstå vilken roll abiotiska miljöfaktorer i Protist metabolisk mångsidighet i Lake Bonney och andra Antarktis sjöar. Den RuBisCo karboxylas Filtret analysmetod kommer att bli ett värdefullt verktyg för att studera eventuella koldioxid fixering och metabola mångsidighet i små kulturer skala anrikning samt hela system sjö.

Före utvecklingen av odlingsmetoder oberoende molekylära verktyg har protister traditionellt identifierades genom odling och taxonomiskt klassificeras baserat på deras cellmorfologi. Således finns en lång historia av anrikning och isolering av protister som bor i en mängd olika livsmiljöer. Tidiga utredningar i synnerhet är historiskt värdefulla för detaljerad taxonomisk identifikation (över: ^{21, 22).} Även isolering av protistermed anrikning tillvägagångssätt är relativt sällsynt i Antarktis sötvattensmiljöer, flera marina FÄRGLÖSA isolat från anrikning av Antarktis havsvatten finns ^23-26. Dessutom är flera odlingskulturer tillägnad Protist och mikroalger isolat (till exempel: den Provasoli-Guillard kultursamling, https://ncma.bigelow.org/~~V ). Pålitliga och billiga sekvensering teknik har producerat en massiv genetisk databas av vilda protistan sekvenser. Även om dessa databaser har varit mycket upplysande om mångfald och distribution av denna viktiga grupp av mikroorganismer, finns det en växande klyfta att koppla sekvensdata med vår förståelse av Protist ekologi och fysiologi. Således kommer de traditionella odlingsmetoder, särskilt i undersamplas miljöer såsom polära akvatiska livsmiljöer fortsätta att spela en viktig roll för att förstå betydelsen och ekologiska rollav protister i den globala geokemiska cykling.